TW201602143A - 使用新穎陽離子性接枝聚合物之目標物的分離濃縮方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係提供取代既有之陽離子性聚合物，將目標物分離濃縮的方法及為了其之套組。

Description

使用新穎陽離子性接枝聚合物之目標物的分離濃縮方法
本申請案係主張對已於2014年3月24日提出申請之日本專利申請2014-60419號及2014-60420號說明書擁有優先權，前述日本申請案係參照全部內容納入本說明書中。
在本案說明書及上述2項日本專利申請所引用的所有文獻記載均納入說明書中。
本發明係關於使用了能以低廉的導入成本、簡便的操作，並安全且安定地製造之接枝聚合物的目標生體分子分離濃縮方法及使用該方法的套組。
離子交換聚合物係一種合成樹脂，並具有一部分之分子結構能作為離子基進行電離的結構。雖然顯示了在水等之溶劑中的離子與離子交換作用，該行為係依照對離子的選擇性，並根據離子基的性質大致分為陽離子交 換聚合物及陰離子交換聚合物兩種。藉由利用聚合物中的固定離子與各種溶液中的對立離子(被交換離子)之間吸附力的差異，能夠分離溶液中所含的各種離子。
生體分子的電荷特性係取決於分子全體的電荷、電荷密度、表面電荷的分佈方式及溶液的pH值等各種要因。例如在蛋白質的方面含有弱酸性及弱鹼性等多種的離子性胺基酸，並在分子表面同時具有正電荷及負電荷。該電荷的總和稱之為有效表面電荷，且由於胺基酸的荷電狀態會隨著pH值變化，蛋白質分子的有效表面電荷亦取決於溶液的pH值向正或負變化。
離子交換色層分析法，係利用此種生體分子電荷狀態(有效表面電荷)之pH及鹽濃度的變化，使其與具相反電荷的載體進行可逆性鍵結、溶出以進行回收的方法(例如專利文獻1、2及非專利文獻1)。
但是在進行該回收操作後，由於溶出的時候使用了界面活性劑及高濃度鹽等，造成難以維持目標物的立體構造及在存活狀態下進行回收。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開1996-173194號公報
[專利文獻2]日本特開2002-125695號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Microbiology 152 (2006), 3575-3583
本發明係提供使用新穎的陽離子性接枝聚合物替代現存的陽離子性聚合物，以分離濃縮目標物的方法及其套組。
即本發明中，本發明之構成如同以下[1]至[11]。
[1]一種方法，其係使用陽離子性接枝聚合物而分離濃縮目標物的方法，其包含下述(1)~(3)步驟：(1)在鹼性條件下使包含陽離子性接枝聚合物與目標物之樣本接觸，使目標物與陽離子性接枝聚合物鍵結的步驟；(2)分離陽離子性接枝聚合物與標的生體分子之鍵結體的步驟；及(3)由前述鍵結體溶出目標物的步驟；<其中，前述陽離子性接枝聚合物係將聚胺衍生物與乙烯性不飽和單體(c)進行聚合而得之聚胺接枝聚合物，前述聚胺衍生物係將具有至少1個胺基之高分子化合物 (a)與具有至少1個環氧基之化合物(b)進行反應而得者>。
[2]如上述[1]之方法，其中步驟(1)中，進一步包含添加二價或三價之金屬離子之事。
[3]如上述[1]或[2]之方法，其中步驟(2)中，進一步包含洗淨鍵結體的步驟。
[4]如上述[1]~[3]中任一項之方法，其中前述陽離子性接枝聚合物被固定於固相面上。
[5]如上述[1]~[3]中任一項之方法，其中步驟(3)中，包含使未與目標物鍵結之陽離子性接枝聚合物凝聚的步驟。
[6]一種套組，其係為了如上述[1]~[5]中任一項之方法所使用的套組，其包含陽離子性接枝聚合物。
[7]如上述[6]之套組，其中進一步包含金屬離子鹽。
[8]如上述[6]之套組，其中進一步包含鹼性溶液與金屬離子鹽的反應液。
[9]如上述[6]~[8]中任一項之套組，其中進一步包含洗淨液。
[10]如上述[6]~[9]中任一項之套組，其中進一步包含含有酸性溶液或螯合劑的分散液。
[11]如上述[6]~[10]中任一項之套組，其中進一步包含凝聚液。
透過本發明的方法，樣本中的目標物能夠高效率地分離濃縮，且由於在分離濃縮的過程中較已知方法更不會使目標物受損，故隨後的分析較為容易。更詳細而言，亦可適用於使用質量分析裝置的分析。
[圖1]大腸桿菌與陽離子性接枝聚合物之鍵結體的沉澱凝聚塊
左邊的試管為大腸桿菌(無)；右邊的試管為大腸桿菌(有)。
[圖2]GFP表現大腸桿菌與陽離子性接枝聚合物之鍵結體的螢光顯微鏡觀察
以雷射波長(488nm)檢測大腸桿菌中表現的GFP，並以可見光檢測陽離子性接枝聚合物及大腸桿菌。使用雷射波長及可見光以連續取得影像，並以偽彩色顯示進行疊加。左圖係大腸桿菌已藉由陽離子性接枝聚合物捕獲的狀態；右圖係該凝聚塊以分散液分散後的狀態。
[圖3]經分離之大腸桿菌的存活確認
將陽離子性接枝聚合物與大腸桿菌進行反應，並將離心後的上清液及以分散液分散凝聚塊後的溶液分別進行培養。右半邊的影像為上清液，左半邊則為分散液。
[圖4]使用經分離回收後之核酸的電氣流動
lane 1係未進行陽離子性接枝聚合物處理的樣本， lane 2係陽離子性接枝聚合物處理後的樣本之電泳影像。
[圖5]經回收之細胞的檢測
(1)使細胞與陽離子性接枝聚合物反應並離心後的上清液(左)及凝聚塊(右)。
(2)以分散液將該凝聚塊分散後的狀態。
隨著(1)、(2)，以雷射波長350nm檢測細胞核，並以可見光檢測陽離子性接枝聚合物。使用雷射波長及可見光以連續取得影像。以偽彩色顯示疊加，並觀察凝聚狀態及分散狀態。
[圖6]經回收之細胞的螢光顯微鏡觀察
以陽離子性接枝聚合物捕獲，並用分散液分散後進行免疫染色。以雷射波長350nm檢測細胞核，並以488nm檢測與細胞表面上表現之抗原(MCAM)進行反應的抗體。使用兩種雷射波長以連續取得影像。以偽彩色顯示疊加，並觀察細胞表面抗原。
[圖7]經回收之囊泡的檢測
(1)囊泡與陽離子性接枝聚合物反應並離心後的上清液(左)及凝聚塊(右)。
(2)該凝聚塊以分散液分散後的狀態。
隨著(1)、(2)，以雷射波長488nm檢測囊泡，並以可見光檢測陽離子性接枝聚合物。使用雷射波長及可見光以連續取得影像。以偽彩色顯示疊加，並確認凝聚狀態及分散狀態。
[圖8]經回收之囊泡的螢光顯微鏡觀察
以陽離子性接枝聚合物捕獲之囊泡用分散液分散後，進行免疫染色。以雷射波長488nm檢測囊泡，並以雷射波長594nm檢測抗體。使用兩種雷射波長以連續取得影像。以偽彩色顯示疊加，並確認囊泡表面抗原的狀態。
[圖9]使用添加有界面活性劑之溶液回收之大腸桿菌的檢測(電泳)
[圖10]使用添加有界面活性劑之溶液回收之大腸桿菌的檢測(質量分析)
[圖11]噬菌體的分離檢測
[圖12]經分離之大腸桿菌的存活確認
使用環氧辛烷改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物(PAAEpo-g-DADMAC)，以及縮水甘油丁酸酯改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物(PAAGB-g-DADMAC)，進行大腸桿菌的分離。接枝聚合物與乳膠珠混合後，將其與菌體反應。
[圖13]經分離之大腸桿菌的存活確認
使用環氧辛烷改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物(PAAEpo-g-DADMAC)，進行大腸桿菌的分離。讓接枝聚合物與菌體反應後，再添加乳膠珠。
[圖14]經分離之大腸桿菌的存活確認
使用縮水甘油改性聚二烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物(DAAGly-g-DADMAC)，進行大腸桿菌的分離。接枝聚合物與乳膠珠混合後，將其與菌體反應。
[圖15]經分離之大腸桿菌之存活確認
使用縮水甘油改性聚二烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物(DAAGly-g-DADMAC)，進行大腸桿菌的分離。讓接枝聚合物與菌體反應後，再添加乳膠珠。
所謂「陽離子性接枝聚合物」，係由具有至少1個胺基的高分子化合物(a)和具有至少1個環氧基的化合物(b)反應所得之聚胺衍生物、與乙烯性不飽和單體(c)進行聚合而得[前述的具有至少1個胺基的高分子化合物(a)，只要是從以下一般式(1)所示之乙烯亞胺系聚合物、一般式(2)所示之乙烯基胺系聚合物、一般式(3)所示之烯丙胺系聚合物、一般式(4)所示之二烯丙胺系聚合物，以及一般式(5)所示之丙烯酸胺系聚合物所組成的群組中選擇即可(但是下述一般式中，n為10到200,000的整數，m為5到3,000的整數，l為5到5,000的整數，o為10到10,000的整數，p為1到100的整數)]。
「具有至少1個胺基的高分子化合物(a)」係只要具有至少1個胺基即可，且該構成單位中即使含有無胺基的構成單位亦可。因此，具有上述一般式(1)到(5)所示構造的各聚合物除上述一般式(1)到(5)所示構造的構成單位之外，包含無胺基之構成單位亦可，或 不包含亦可。作為無胺基之構成單位雖可舉出二氧化硫、丙烯醯胺、烯丙醇、丙烯酸等，但是不限於此。
「具有至少1個胺基的高分子化合物(a)」中的「胺基」，只要是一級胺基、二級胺基、及三級胺基的任一種即可，但以一級胺基或二級胺基特佳。
「具有至少1個胺基的高分子化合物(a)」中的「胺基」的數量雖無特別限制，但從反應性、易使用性等觀點來看，每1高分子以5~15000個為佳，又以8~3000個特佳。此外，若換算成每高分子化合物之分子量的個數，每分子量10000中以5個至230個為佳，又以10個至130個特佳。
「具有至少1個胺基的高分子化合物(a)」的分子量雖無特別限制，但從反應性、黏度、操作、良率等觀點來看，數均分子量以500~10000000為佳，又以500~1000000特佳。
此外，在本案第1發明中使用之具有至少1個胺基的高分子化合物(a)重複單位的含有數量雖無特別限制，但從反應性、黏度、操作、良率等觀點來看，以10~150000個為佳，又以10~3000個特佳。
「具有至少1個胺基的高分子化合物(a)」亦可為「另具有至少1個烯丙基及至少1個胺基的烯丙胺系單體(a’)」。雖然只要是該構造中具有至少1個烯丙基及至少1個胺基的聚合性化合物的話，任何化合物均能夠使用，但以具有一般式(a1)所示之構造的烯丙胺系化 合物為佳。
一般式(a1)中，R9及R10至少其中一方為氫原子，另一方則為氫或碳數1至8的烴基，以氫原子或碳數1至3的烷基為佳。
此外，在一般式(a1)中，若R9及R10的任一方均為烯丙基，即具有2個烯丙基的二烯丙胺系單體，從聚合性等觀點來看是特佳的。
從獲得高聚合性的觀點來看，至少烯丙胺系單體(a’)中的一部分以具有2個烯丙基的二烯丙胺系單體為佳，且以該烯丙胺系單體(a’)中的30莫耳%以上是二烯丙胺系單體更佳，又以50莫耳%以上是二烯丙胺系單體特佳。
在一般式(a1)中，R9及R10的一方(例如R9)是氫原子時，另一方(此時R10)則以氫原子、甲基、乙基、烯丙基或芐基為佳。亦即具有一般式(a1)所示構造的烯丙胺系化合物，其較佳者為烯丙胺、甲基烯丙胺、乙基烯丙胺、二烯丙胺或苄基烯丙胺。
此外，具有一般式(a1)所示構造的烯丙胺系化合物之有機酸鹽或無機酸鹽，亦可較佳適用於作為本案第1發明之具有至少1個烯丙基及至少1個胺基的烯丙胺系單體(a’)。作為上述有機酸鹽或無機酸鹽中的反離 子，以鹵素離子(進而以Cl-、Br-或I-為佳)、甲基硫酸離子、乙基硫酸離子、甲磺酸離子、2-羥基-1-乙磺酸離子、乙酸離子或羥基乙酸離子為佳。
陽離子性接枝聚合物可以是「在上述定義中，前述之具有至少1個環氧基的化合物(b)為一般式(6)所示的化合物」的聚胺接枝聚合物(但是一般式(6)中的R為取代或非取代之1價烴基)。
陽離子性接枝聚合物可以是「在上述定義中，前述之具有至少1個環氧基的化合物(b)為一般式(7)所示的化合物，並且選自下述(1)~(14)所成群組中」的聚胺接枝聚合物：(1)式中R1、R2、R3及R4為氫原子的環氧乙烷；(2)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或鏈中含有羥基之碳數1~8的直鏈或分支之飽和烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物；(3)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或取代或非取代之1價烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物；(4)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或鏈中含有醚鍵結之碳數1~8的直鏈或分支之飽和烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物；(5)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或鹵素 (但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物；(6)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或不飽和烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物；(7)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或含有具脂環式或不飽和鍵結之環式烴基的烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物；(8)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或含有芳香環或雜環之烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物；(9)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或含有環氧環之烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的多官能環氧化合物；(10)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或鏈中含有烷氧基矽基之碳數3~12的直鏈或分支之飽和烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物；(11)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或鏈中含有氟之烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物；(12)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或鏈中含有羧基之烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物；(13)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或鏈中含有酯鍵結或醯胺鍵結之碳數1~12的直鏈或分支之飽和烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物；以及(14)式中R1、R2、R3及R4各自獨立為氫原子或鏈中含有磺酸酯基之烴基(但是R1、R2、R3及R4不全是氫原子)的環氧化合物。
此外，作為「具有至少1個環氧基的化合物(b)」，可舉出環氧乙烷(構造參照下式)、
縮水甘油(構造參照下式)、
環氧丙烷(構造參照下式)、
環氧丁烷、2,3-環氧丁烷、1,2-環氧己烷及1,2-環氧十六烷，縮水甘油基甲醚(構造參照下式)、
乙基縮水甘油醚、縮水甘油基異丙醚及三縮水甘油基 異三聚氰酸，環氧氯丙烷(構造參照下式)、
環氧溴丙烷及2-(氯甲基)-1,2-環氧丁烷，1,3-環氧丁烯(構造參照下式)、
1,2-環氧基-5-己烯及烯丙基縮水甘油醚，1,2-環氧環戊烷(構造參照下式)、
1,2-環氧環己烷及1,2-環氧基-4-乙烯基環己烷3,4-環氧基四氫呋喃，氧化苯乙烯(構造參照下式)、
縮水甘油基苯醚及4-縮水甘油基氧基咔唑，1,2：3,4-二環氧丁烷(構造參照下式)、
1,4-丁二醇二縮水甘油醚及乙二醇二縮水甘油醚，3-縮水甘油基丙氧基三甲氧基矽烷(構造參照下式)、
及3-縮水甘油基氧基丙基(二甲氧基)甲基矽烷，1,2-環氧基-1H,1H,2H,3H,3H全氟十一烷(構造參照下式)、
環氧琥珀酸(構造參照下式)、
縮水甘油丁酸酯(構造參照下式)、
及N-縮水甘油基酞醯亞胺，以及縮水甘油基硝基苯并磺酸酯(構造參照下式)、
及縮水甘油基-p-甲苯磺酸酯等化合物，但不僅限於此。
陽離子性接枝聚合物可以是「在上述定義中，前述之乙烯系不飽和單體(c)係選自乙烯基系單體、苯乙烯系單體、甲基丙烯酸酯系單體、丙烯酸酯系單體、丙烯醯胺系單體、烯丙基系單體、二烯丙基系單體及不飽和羧酸所組成之群組」的聚胺接枝聚合物。
乙烯系不飽和單體(c)的分子量雖無特別限制，但 從接枝效率等觀點來看，分子量以28至1100為佳，又以28至500特佳。
乙烯系不飽和單體(c)的碳原子數雖無特別限制，但以2個至50個為佳，又以2個至30個特佳。
作為在乙烯系不飽和單體(c)之中較佳適用於本發明之單體的更具體實例，可舉出苯乙烯、二乙烯基苯、p-苯乙烯磺酸鈉水合物、乙烯基苄基三甲基氯化銨、乙酸乙烯酯、1-乙烯基咪唑、2-乙烯基吡啶、丙烯腈、烯丙胺鹽酸鹽、二烯丙胺鹽酸鹽、二甲基二胺鹽酸鹽、二烯丙基二甲基氯化銨(特別是其60%水溶液)、二甲基丙烯醯胺、羥基乙基丙烯醯胺、二甲胺基丙基丙烯醯胺、二甲胺基丙基丙烯醯胺氯化甲基四級鹽、N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯醯胺、甲基丙烯酸3-(三甲氧基矽基)丙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯等。在此之中，從主幹聚合物上之羥基與鄰接碳的反應性、接枝之後側鏈末端基團的有用性等觀點來看，以二甲基丙烯醯胺、二烯丙基二甲基氯化銨、苯乙烯、丙烯腈等特佳。
此等單體的化學構造、CAS編號等，對該發明所屬技術領域具有通常知識者係屬不言自明的，故省略其說明。
乙烯系不飽和單體(c)因應本發明之目的，可單獨地只使用1種，亦可組合2種以上來使用。在2種以上的乙烯系不飽和單體(c)組合使用時，可以是全部均符合上述之較佳例，亦可是只有一部分符合上述之較佳例。
含有陽離子性接枝聚合物的每單位重量的胺基量係以0.1~17mmol/g為佳，又以1~10mmol/g特佳。此外平均粒徑在陽離子性接枝聚合物未固定於固相面上時係以250nm以下為佳，又以100nm~200nm更佳。
作為「陽離子性接枝聚合物」的一種態樣，可舉出下列接枝聚合物。
(1)環氧丙烷改性聚烯丙胺與二甲基丙烯醯胺的接枝聚合物
將20質量%的聚烯丙胺(重量平均分子量3000)以冰水冷卻及攪拌的同時，滴入環氧丙烷(相對於胺為2當量)。在20℃下使其反應24小時後將溶液濃縮，得到了環氧丙烷改性聚烯丙胺的水溶液。
在依照上述調製的42質量%之環氧丙烷改性聚烯丙胺中加水使其變為14質量%，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH10。接著各自分批添加65質量%的二甲基丙烯醯胺(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液12.01g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時，得到了水溶液之環氧丙烷改性聚烯丙胺與二甲基丙烯醯胺之接枝聚合物(重量平均分子量120000)。
(2)環氧丙烷改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物
在與(1)同樣方法調製的50質量%之環氧丙烷改性 聚烯丙胺中加水使其變為30質量%，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH10。接著加入65質量%之二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)，再分批添加28.5質量%之APS水溶液96.08g(相對於單體為20莫耳%)並使其聚合72小時，得到了水溶液之環氧丙烷改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物(重量平均分子量24000)。
(3)環氧丙烷改性聚烯丙胺與苯乙烯的接枝聚合物
將20質量%的聚烯丙胺以冰水冷卻及攪拌的同時，滴入環氧丙烷(相對於胺為0.1當量)。在20℃下使其反應24小時後將溶液濃縮，得到了環氧丙烷改性聚烯丙胺的水溶液。
在環氧丙烷改性聚烯丙胺中加水使其變為20質量%，接著加入苯乙烯(相對於胺為0.3當量)，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH12。其後，滴入28.5質量%的APS水溶液12.01g(相對於單體為20莫耳%)，並使其聚合24小時。其後在70℃下加溫24小時，得到了下列推測構造的環氧丙烷改性聚烯丙胺及苯乙烯之接枝聚合物(但是在下述一般式中，q是0至3,000的整數，r為0至3,000的整數，s是0至3,000的整數，t是0至10,000的整數，u是0至10,000的整數，w是0至10,000的整數)，平均粒徑為120nm。
(4)環氧丙烷改性聚烯丙胺與二甲基丙烯醯胺之接枝聚合物的製造(於pH7的製造)
在與(1)同樣方法調製的42質量%之環氧丙烷改性聚烯丙胺中加水使其變為14質量%，並在20℃下攪拌。接著加入35質量%之鹽酸以調整pH值至7，各自分批添加二甲基丙烯醯胺(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液12.01g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時，得到了水溶液之環氧丙烷改性聚烯丙胺與二甲基丙烯醯胺之接枝聚合物(重量平均分子量210000)。
(5)環氧辛烷改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物
在20質量%的聚烯丙胺中加水使其變為13質量%，以冰水冷卻及攪拌並同時滴入環氧辛烷(相對於胺為0.1當量)。滴入完成後在40℃下使其反應24小時後將溶液 濃縮，得到了水溶液之環氧辛烷改性聚烯丙胺。
在依照上述調製的30質量%之環氧辛烷改性聚烯丙胺中加水使其變為19質量%，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH12。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時。其後再分批追加28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)，得到了水溶液之環氧辛烷改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物。
(6)乙二醇二縮水甘油醚改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物
在20質量%的聚烯丙胺中加水使其變為13質量%，以冰水冷卻及攪拌並同時滴入乙二醇二縮水甘油醚(相對於胺為0.05當量)。滴入完成後在40℃下使其反應24小時後將溶液濃縮，得到了水溶液之乙二醇二縮水甘油醚改性聚烯丙胺。
在依照上述調製的30質量%之乙二醇二縮水甘油醚改性聚烯丙胺中加水使其變為19質量%，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH12。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時，得到了黄色凝膠之乙二醇二縮水甘油醚改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物。
(7)氧化苯乙烯改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物
在20質量%的聚烯丙胺中加水使其變為13質量%，以冰水冷卻及攪拌並同時滴入氧化苯乙烯(相對於胺為0.1當量)。滴入完成後在40℃下使其反應24小時後將溶液濃縮，得到了氧化苯乙烯改性聚烯丙胺的水溶液。
在依照上述調製的30質量%之氧化苯乙烯改性聚烯丙胺中加水使其變為19質量%，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH12。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時。其後再分批追加28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)，得到了水溶液之氧化苯乙烯改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物。
(8)縮水甘油丁酸酯改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物
在20質量%的聚烯丙胺中加水使其變為13質量%，以冰水冷卻及攪拌並同時滴入縮水甘油丁酸酯(相對於胺為0.1當量)。滴入完成後在40℃下使其反應24小時後將溶液濃縮，得到了縮水甘油丁酸酯改性聚烯丙胺的水溶液。
在依照上述調製的30質量%之縮水甘油丁酸酯改性 聚烯丙胺中加水使其變為19質量%，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH12。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時。其後再分批追加28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)，得到了水溶液之縮水甘油丁酸酯改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物。
(9)環氧丙烷改性聚烯丙胺與苯乙烯的接枝聚合物
在與(3)同樣方法調製的環氧丙烷改性聚烯丙胺中加水使其變為20質量%，接著加入苯乙烯(相對於胺為0.3當量)，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH12。其後滴入28.5質量%之SPS水溶液12.53g(相對於單體為20莫耳%)，並使其聚合24小時。之後在70℃下加溫24小時，得到了環氧丙烷改性聚烯丙胺與苯乙烯的接枝聚合物，平均粒徑為135nm。
(10)環氧丙烷改性聚烯丙胺與苯乙烯的接枝聚合物
在與(3)同樣方法調製的環氧丙烷改性聚烯丙胺中加水使其變為20質量%，接著加入苯乙烯(相對於胺為0.3當量)，並在80℃下攪拌，反應溶液係pH12。其後滴入28.5質量%之APS水溶液12.01g(相對於單體為20莫耳%)，並使其聚合24小時，得到了環氧丙烷改性聚 烯丙胺與苯乙烯的接枝聚合物，平均粒徑為144nm。
(11)縮水甘油改性聚二烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物
在二烯丙胺中加水使其變為79質量%，以冰水冷卻及攪拌並同時滴入縮水甘油(相對於胺為1當量)。滴入完成後在45℃下反應24小時後將溶液濃縮，得到了水溶液之縮水甘油改性二烯丙胺。
在78質量%之縮水甘油改性二烯丙胺中加入35質量%之鹽酸(相對於胺為1當量)。其後加水使其變為50質量%，加溫至60℃，並分批添加2,2’-偶氮雙(2-甲基丙脒)2鹽酸鹽(相對於單體為6莫耳%)，使其聚合24小時。將獲得的溶液以電滲析進行純化，得到了縮水甘油改性聚二烯丙胺的水溶液。
在依照上述調製的43質量%之縮水甘油改性聚二烯丙胺中加水使其變為30質量%，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH11。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液36.04g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時。其後再分批追加28.5質量%的APS水溶液36.04g(相對於單體為10莫耳%)，在50℃下聚合24小時，得到了縮水甘油改性聚二烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物的水溶液(重量平均分子量84000)。
(12)環氧丙烷改性聚乙烯亞胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物
攪拌47質量%之聚乙烯亞胺(重量平均分子量2000)並同時滴入環氧丙烷(相對於胺為0.1當量)，並在20℃下使其反應24小時，得到了環氧丙烷改性聚乙烯亞胺水溶液。
在依照上述調製的50質量%之環氧丙烷改性聚乙烯亞胺中加水使其變為14質量%，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH12。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液31.23g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時，得到了水溶液之環氧丙烷改性聚乙烯亞胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物。
(13)環氧丙烷改性聚乙烯基胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物
攪拌15質量%之聚乙烯胺(重量平均分子量150000)並同時滴入環氧丙烷(相對於胺為0.1當量)，在20℃下使其反應24小時後將溶液濃縮，得到了23質量%的環氧丙烷改性聚乙烯胺水溶液。
在依照上述調製的23質量%之環氧丙烷改性聚乙烯亞胺中加水使其變為15質量%，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH12。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS 水溶液31.23g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時，得到了水溶液之環氧丙烷改性聚乙烯胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物。
(14)環氧丙烷改性聚二烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物
在二烯丙胺中加水使其變為78質量%，以冰水冷卻及攪拌並同時滴入環氧丙烷(相對於胺為0.1當量)。在20℃下使其反應24小時，得到了水溶液之環氧丙烷改性二烯丙胺。
在79質量%之環氧丙烷改性二烯丙胺中加入35質量%之鹽酸(相對於胺為1當量)，得到了水溶液之59質量%之環氧丙烷改性二烯丙胺鹽酸鹽。在獲得的59質量%之環氧丙烷改性二烯丙胺鹽酸鹽41.33g中加水使其變為7質量%，並加熱至60℃。其後分批添加59質量%之環氧丙烷改性二烯丙胺鹽酸鹽123.99g及2,2’-偶氮雙(2-甲基丙脒)2鹽酸鹽(相對於單體為5.6莫耳%)，並使其聚合24小時。將獲得的溶液以電滲析進行純化，得到水溶液之環氧丙烷改性聚二烯丙胺。
在依照上述調製的30質量%之環氧丙烷改性聚二烯丙胺中加水使其變為24質量%，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH12。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24 小時。其後再分批追加28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)，在60℃下使其聚合24小時，得到了水溶液之環氧丙烷改性聚二烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物(重量平均分子量19000)。
(15)環氧丙烷改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物(使用重量平均分子量2000且相對於胺添加0.1當量之環氧丙烷的環氧丙烷改性聚烯丙胺)
攪拌15質量%之聚烯丙胺(重量平均分子量1600)並同時滴入環氧丙烷(相對於胺為0.1當量)，在20℃下使其反應24小時後將溶液濃縮，得到了水溶液之環氧丙烷改性聚烯丙胺。
在依照上述調製的30質量%之環氧丙烷改性聚烯丙胺中加水使其變為18質量%，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH10。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時。其後再分批追加28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)，在60℃下使其聚合24小時，得到了水溶液之環氧丙烷改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物(重量平均分子量16000)。
(16)環氧丙烷改性聚烯丙胺與2-乙烯基吡啶的接枝聚合物
在與(3)同樣方法調製的環氧丙烷改性聚烯丙胺中加水使其變為20質量%，接著加入2-乙烯基吡啶(相對於胺為0.3當量)，並在20℃下攪拌，反應溶液係pH12。其後滴入28.5質量%之APS水溶液12.01g(相對於單體為20莫耳%)，並使其聚合24小時。得到了環氧丙烷改性聚烯丙胺與2-乙烯基吡啶的接枝聚合物，平均粒徑為225nm。
從起始原料等獲得之接枝聚合物係推測為具有下式構造之物(但是在下述一般式中，q是0至3,000的整數，r是0至3,000的整數，s是0至3,000的整數，t是0至10,000的整數，u是0至10,000的整數，w是0至10,000的整數)。
「樣本」係指被認為是含有作為檢測對象之「對象物」的混合物。「樣本」係來自於包含人類的生體(例如血液、唾液、體液、體組織等)、環境(例如土壤、海水、環境水(溫泉水、浴槽水、冷卻塔水等))、或者是人工物或自然物(例如麵包等加工食品、優格等發酵食品、或米及小麥等栽培植物、微生物、病毒)。
這些樣本係應其所需地純化分離處理操作後之物亦無不可，例如自血液獲得的血漿(blood plasma)乃至血清(blood serum)均符合於此。
此外，加入金屬離子鹽者亦無不可。
再者，「樣本」中亦可含有界面活性劑，亦可在檢測「對象物」前添加界面活性劑。作為界面活性劑，Triton(註冊商標)系界面活性劑(聚(氧乙烯)辛基苯醚等)、Tween(註冊商標)系界面活性劑(聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯等)、Brij(註冊商標)系界面活性劑(聚氧乙烯烷醚等)、蔗糖月桂酸酯(同仁化學)、皂素(SIGMA-ALDRICH)、BPSH(NIKKOL)、NOIGEN TDS-70(第一工業製藥)、TritonX-705(SIGMA-ALDRICH)等均符合於此。
「對象物」係指應藉由本發明檢測之物。雖無特別限定，但以帶有負電荷之物為佳。例如包含了細胞、真菌、細菌、病毒及此等之分解物、以及肽、核酸等。
細胞不僅是指存在於生體內者，是培養細胞亦無不可；此外不僅是正常的細胞，是癌細胞(例如血中循環癌細胞(CTC))亦可。
真菌係指一般被稱為菇類、黴菌、酵母之生物的總稱，白癬菌、念珠菌及麴菌等均符合於此。
細菌係指具有細胞膜的原核生物，葡萄球菌、大腸桿菌、沙門桿菌、綠膿菌、霍亂弧菌、赤痢菌、炭疽菌、結 核菌、肉毒桿菌、破傷風菌及鏈球菌等均符合於此。
病毒係指利用其他生物的細胞使其能夠自我複製的微小構造體，並由蛋白質外殼及包含在其內部的核酸而成之物。諾羅病毒、輪狀病毒、流感病毒、腺病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、肝炎病毒、皰疹病毒及HIV等均符合於此。
細胞、真菌、細菌及病毒的分解物係指構成這些的因子，亦可是各胞器(核、高基氏體、粒線體等)，細胞、真菌、細菌之膜級分等的含有磷酸脂質之物(包括反轉囊泡)，構成細胞、真菌、細菌及病毒的因子之複合體等。此外不是存在於正常細胞中，而是經由細胞凋亡而生的微小膜囊泡(例如EndotherialMicroparticle：EMP)及囊泡亦可。
肽係指各種胺基酸相互連接而成的分子系統群，並包含在生體內運作的完全蛋白質，亦可包含各種所謂的轉譯後修飾(例如醣苷化：糖鏈修飾)。
核酸係指去氧核醣核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)及其混合物與鍵結物。此外其構成鹼基雖然是天然中存在的核苷酸(例如鳥糞嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))，但亦可包含那些以外的天然及人工修飾鹼基。在此所謂的「修飾鹼基」，係指上述5種核苷酸受到化學性修飾的鹼基。此等雖無特別限定，但甲基胞苷、假尿苷、4-硫代尿苷、二氫尿苷、Q核苷、次黃嘌呤(肌苷 (I))等符合於此，亦包含了藉由將RNA作為模板進行反轉錄反應所製作出的cDNA。
所謂「鹼性條件下」係指pH8以上，較佳者為9以上，更佳者為10以上，再更佳者為pH11以上，以使用鹼性溶液來達到鹼性條件為佳。作為鹼性溶液係可舉出弱鹼、NaOH水溶液等強鹼，或者在pH8以上帶有緩衝能力的buffer(例如甘胺酸buffer、CHES、CAPS)等。
所謂讓陽離子性接枝聚合物與含有目標物的樣本「接觸」，係除了將陽離子性接枝聚合物溶液加入樣本中的態樣以外，亦包含在該樣本中加入陽離子性接枝聚合物的態樣。
所謂「鍵結」，係指陽離子性接枝聚合物與對象物以配位鍵結(及/或)離子鍵結相互作用的狀態。
所謂「分離」鍵結體，係指鍵結體在酸性條件下或螯合劑存在下，解開陽離子性接枝聚合物與對象物的上述「鍵結」。
所謂酸性條件下，係指pH7以下，較佳者為pH6以下，更佳者為pH5以下，以使用酸性溶液來達到酸性條件為佳。作為酸性溶液係可舉出甘胺酸buffer、蟻酸溶液及乙酸溶液等。
作為螯合劑係以乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙氨乙基醚四乙酸(EGTA)等符合於此。雖只要是螯合劑的質子已背離之pH值便無特別限制，但pH值以6.0至pH8.0為佳。
所謂「溶出目標物」係指在上述「分離」反應後，目標物可溶化於適當的溶液中。當目標物是活細胞時則是指在不破壞細胞膜下進行回收。
所謂二價或三價的金屬離子，Mg2+、Ba2+、Ca2+、Sr2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Cr3+、Cu2+、Cd2+、Sn2+等均符合於此。
所謂「固定於固相面」係指使「陽離子性接枝聚合物」偏向存在。雖無特別限定，但具體而言係指將「陽離子性接枝聚合物」固定或塗佈在玻璃、尼龍膜、半導體晶圓、微珠、乳膠珠、磁珠及膠體粒子等之表面上，固定方法可使用周知技術直接將「陽離子性接枝聚合物」固定於玻璃等之表面上，或者亦可藉由接頭分子間接地固定。此外，亦可在固相面上聚合單體以合成被固定於固相面上的陽離子性接枝聚合物。
再者，「陽離子性接枝聚合物」是已填充於管柱等中的狀態亦可。
所謂「洗淨鍵結體」，係指在維持「陽離子性接枝聚合物」與「目標物」的鍵結下，同時去除非特異性地與陽離子性接枝聚合物鍵結的雜質之一種操作。對於洗淨，可使用和鍵結反應所使用之溶液相同的溶液，亦可是其他溶液，生理食鹽水及醇類亦無不可。
所謂「使未與目標物鍵結的陽離子性接枝聚合物凝聚」，可舉出透過疏水性相互作用分離陽離子性接枝聚合物；或者透過作為反制的聚陰離子及陰離子性界面 活性劑，藉由其離子性相互作用凝聚並分離陽離子性接枝聚合物等方法。更詳細來說，使用凝聚液(含有非質子性極性溶劑(乙腈等)或陰離子性界面活性劑(辛烷磺酸鈉及癸烷磺酸鈉等)、聚陰離子(羧基甲基化聚烯丙胺：CMPAA)等)，藉由乙腈的疏水性相互作用以及與聚陰離子、離子性界面活性劑的離子性相互作用，使得陽離子性接枝聚合物凝聚。
上述之「陽離子性接枝聚合物」、「反應液」、「洗淨液」、「分散液」及「凝聚液」不僅是液體狀(「陽離子性接枝聚合物」則是乳化狀)之物，亦可包含那些液體乾燥後之物。
[實施例]
以下雖透過實施例、比較例及參考例對本發明進行更詳細地說明，但本發明不僅限於此等。
<實施例1>
大腸桿菌的分離及回收率的確認
1.方法
使用血球分析裝置(Sysmex)以求取使用陽離子性接枝聚合物回收之大腸桿菌的回收率。
樣本及試劑如下：
1)樣本
大腸桿菌係用Bio-Rad公司製之GFP表現Kit所製作。
在正常人血清中添加必要數量(1~2×104cell/μL)之所製作的大腸桿菌以作為樣本使用。
2)試劑
I：反應液：1M甘胺酸-NaOH pH11.0、3M氯化鎂
II：分散液：500mM甘胺酸-HCl pH5.0
3)陽離子性接枝聚合物
將20質量%的聚烯丙胺(重量平均分子量3000)在冰水中冷卻及攪拌，同時滴入環氧丙烷(相對於胺為0.1當量)。在20℃下使其反應24小時後將溶液濃縮，得到了環氧丙烷改性聚烯丙胺的水溶液。
在環氧丙烷改性聚烯丙胺中加水使其變為20質量%，接著加入苯乙烯(相對於胺為0.3當量)，並在20℃下攪拌。其後滴入濃度28.5質量%之過硫酸銨(APS)水溶液12.01g(相對於單體為20莫耳%)，並使其聚合24小時。之後在70℃下加溫24小時，得到了環氧丙烷改性聚烯丙胺與苯乙烯的陽離子性接枝聚合物(平均粒徑為120nm)(上述(3)中的環氧丙烷改性聚烯丙胺與苯乙烯之接枝聚合物)。
4)血球分析裝置
大腸桿菌係用血球分析裝置檢測血小板(PLT)。
測定係遵循血球分析裝置實驗指南來進行。
大腸桿菌的分離及回收率的確認係如下列進行：
混合樣本500μL與20%陽離子性接枝聚合物50μL及反應液100μL，並使其反應1分鐘。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。回收上清液，得到了以分散液500μL將所得沉澱凝聚塊完全地分散的分散溶液。上清液及分散溶液係使用血球分析裝置求取大腸桿菌的回收率。此外，使用與陽離子性接枝聚合物反應前之大腸桿菌作為對照。
2.結果
血球分析裝置的測定結果表示於表1。
從表1的結果來看回收率約為70%，得到了良好的回收率。
<實施例2>
經分離之大腸桿菌的存活確認
1.方法
使用陽離子性接枝聚合物分離血液中的大腸桿菌，培養並確認分離之大腸桿菌的存活。
樣本及試劑如下：
1)樣本
在正常人血清中添加必要數量之使用和實施例1相同的Bio-Rad公司製GFP表現Kit所製作的大腸桿菌以作為樣本使用。
2)試劑
I：反應液：1M甘胺酸-NaOH pH11.0、3M氯化鎂
II：分散液：500mM甘胺酸-HCl pH5.0
3)陽離子性接枝聚合物
與實施例1相同地調製。
大腸桿菌的分離及存活確認係如下列進行：
混合樣本500μL與20%陽離子性接枝聚合物50μL及反應液100μL，並使其反應1分鐘。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。去除上清液，得到了以分散液500μL將所得沉澱凝聚塊完全地分散的分散溶液(圖2)。將上清液及分散溶液的5000分之1的量，使用LB細菌培養寒天培養基在37℃下培養18小時，並確認其存活(圖3)。
此外作為比較例，以與實施例相同的方法得到沉澱凝聚塊後，分別添加1.5M NaCl溶液500μL(比較例1)及1.5% TritonX-100 500μL(比較例2)，使凝聚塊完全地分散。各自的上清液及分散溶液以與實施例相同的方法培養並確認其存活。
2.結果
培養結果表示於表2。
從表2的結果來看，藉由使用本發明方法能將細菌在沒有發生溶菌且存活的狀態下回收。
<實施例3>
以質量分析器測定
1.方法
利用MALDI TOF(基質輔助雷射脫離離子化飛行時間型)質量分析器MALDI BioTyper(註冊商標)(Bruker Daltonics)對使用陽離子性接枝聚合物回收的大腸桿菌進行細菌鑑定。
樣本及試劑如下：
1)樣本
大腸桿菌係使用Bio-Rad公司製之GFP表現Kit製作。
在生理食鹽水中添加必要數量之所製作的大腸桿菌以作為樣本使用。
2)試劑
I：反應液：1M甘胺酸-NaOH pH11.0、3M氯化鎂
II：分散液：70%蟻酸
III：凝聚液：100%乙腈
3)陽離子性接枝聚合物
與實施例1相同地調製。
4)質量分析器
Matrix係使用Bruker Daltonics公司的Matrix HCCA Portioned。
測定係遵從MALDI BioTyper(註冊商標)的實驗指南進行。細菌鑑定的判定係藉由BioTyper(註冊商標)中指定的分數來評估。
大腸桿菌的分離及以質量分析器的測定係如下列進行：
混合樣本500μL與20%陽離子性接枝聚合物50μL及 反應液100μL，並使其反應1分鐘。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊(圖1)。去除上清液，並將所得沉澱凝聚塊以分散。萃取液50μL使其完全地分散，萃取菌體中的蛋白質。其後添加凝聚液200μL，並以桌上小型離心機離心30秒，使陽離子性接枝聚合物沉澱。回收上清液，並作為質量分析器的測定用樣本。
2.結果
質量分析器的測定結果表示於表3。
從表3的結果來看鑑定分數為1.7以上，得到了良好的鑑定精度。從此結果來看，大腸桿菌中蛋白質之萃取及使用質量分析器之測定可說是可行的。
<實施例4及5>
血清中之核酸的分離及回收率的確認
1.方法
使用陽離子性接枝聚合物以分離血清中所添加的核酸，對所得之核酸進行瓊脂糖凝膠電泳，再使用SYBR Safe(invitrogen)染色，並以LAS4000(GE)檢測。回收率 係自斑點之螢光強度求取。
樣本及試劑如下：
1)樣本
核酸係以質體和基因體作為對象。質體係從大腸桿菌中萃取(實施例4)，基因體則是從Hela細胞中萃取(實施例5)。萃取之質體溶液係使用LB細菌培養寒天培養基來培養，且從菌落並未形成之事確認了沒有大腸桿菌的混入。此外，萃取之基因體溶液係用螢光顯微鏡，確認了細胞並未混入。
在正常人血清中添加必要數量的萃取之DNA以作為樣本。此外，使用了未添加DNA的正常人血清作為對照。
2)試劑
I：反應液：1M甘胺酸-NaOH pH11.0、3M氯化鎂
II：分散液：500mM EDTA-2Na pH8.0
3)陽離子性接枝聚合物
與實施例1相同地調製。
4)電泳
使用了1.0%瓊脂糖凝膠。
電泳用之樣本調整係使用了6×Loading Dye(TOYOBO)。
核酸的分離及檢測方法係如下列進行：
混合樣本500μL與20%陽離子性接枝聚合物50μL及反應液100μL，並使其反應1分鐘。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。在上清液及分散溶液中添加nacalai tesque之核酸萃取用試劑-苯酚、氯仿、異戊醇(25：24：1)500μL，並分離成苯酚相及水相。回收300μL水相中的DNA，混合600μL乙醇及30μL乙酸鈉水溶液，並藉由乙醇沉澱使DNA沉澱。沉澱物係懸浮於100μL蒸餾水中，並與Loading Dye混合以作為電泳用之樣本。使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，並以SYBR Safe染色之後，以LAS4000進行螢光檢測(圖4)。
2.結果
DNA回收量表示於表4。
從表4的結果來看，質體DNA之回收率為60%，基因體DNA回收率為40%。
<實施例6>
血清中細胞的分離、回收率及立體構造‧表面構造的確認
1.方法
使用陽離子性接枝聚合物分離在血清中添加的細胞。細胞回收率係使用血球分析裝置(Sysmex)進行確認。接著以螢光顯微鏡(Life technologies)確認細胞表面的抗原抗體反應。
樣本及試劑如下：
1)樣本
細胞係使用Hela細胞，在正常人血清中添加必要數量(1~2×106cell/mL)以作為樣本使用。
2)試劑
I：反應液：1M甘胺酸-NaOH pH11.0、3M氯化鎂
II：分散液：500mM EDTA-2Na pH8.0
3)陽離子性接枝聚合物
與實施例1相同地調製。
4)血球分析裝置
細胞係作為WBC測定。
測定係遵從與實施例1相同之血球分析裝置之實驗指南進行。
5)抗體
一級抗體係將抗人類CD146(MCAM)、單株抗體(N1238)(MONOSAM)稀釋50倍使用。
二級抗體係將Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 594(Life Technologie)稀釋500倍使用。
將一級抗體及二級抗體在遮光狀態下倒轉混合1小時來進行反應，調製了螢光標識抗體。
細胞之分離方法及檢測方法係如下列進行：
混合樣本500μL與20%陽離子性接枝聚合物50μL及反應液100μL，並使其反應1分鐘。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。回收上清液，並將所得沉澱凝聚塊以分散液500μL完全地分散(圖5)。回收之上清液及所得分散溶液係使用血球分析裝置來量測回收率，並將未與陽離子性接枝聚合物反應的細胞用作對照。
接著將分散溶液與螢光標識抗體混合，在遮光狀態下以倒轉混合1小時來進行反應，並以螢光顯微鏡確認抗原抗體反應(圖6)。
2.結果
以血球分析裝置的WBC測定值表示於表5。
從表5的結果來看細胞之回收率為98%，得到了良好的回收率。
因為血球分析裝置係將具有核的物質作為WBC測定，故透過使用本發明方法，可以說細胞能夠在維持住立體構造的狀態下回收。
此外，以螢光顯微鏡確認了Hela細胞與MCAM抗體之抗原抗體反應。從其結果來看，可以說是能在維持著細胞表面構造的狀態下進行回收。
<實施例7>
血清中囊泡的分離、回收率及立體構造‧表面構造的確認
1.方法
使用陽離子性接枝聚合物以分離血清中所添加的囊泡。囊泡的回收率則用血球分析裝置進行確認。此外，使用螢光顯微鏡(Life technologies)確認經分離之囊泡的立體構造及表面構造是否維持住。
樣本及試劑如下：
1)樣本
囊泡係以超音波振盪器破碎Hela細胞來製作。
為了以螢光顯微鏡觀察囊泡，細胞破碎係於DyLight 488 Antibody Labeling kit(Thermo)附屬之螢光色素(DyLight,Ex/Em：493/518)水溶液中進行，以使螢光色素被攝入囊泡內部。
在正常人血清中添加必要數量的所製作之囊泡以作為樣本使用。
2)試劑
I：反應液：1M甘胺酸-NaOH pH11.0、3M氯化鎂
II：分散液：500mM EDTA-2Na pH8.0
3)陽離子性接枝聚合物
與實施例1相同地調製。
4)血球分析裝置
囊泡係作為WBC測定。
測定係遵從與實施例1相同之血球分析裝置之實驗指南進行。
5)抗體
一級抗體係將抗人類CD146(MCAM)、單株抗體(N1238)(MONOSAM)稀釋50倍使用。
二級抗體係將Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 594(Life Technologie)稀釋500倍使用。
將一級抗體及二級抗體在遮光狀態下倒轉混合1小時來進行反應，調製了螢光標識抗體。
囊泡的分離方法及檢測方法係如下列進行：
混合樣本500μL與10%陽離子性接枝聚合物100μL及反應液50μL，並使其反應1分鐘。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。回收上清液，並將所得沉澱凝聚塊以分散液500μL完全地分散，得到分散溶液(圖7)。回收之上清液及所得之分散溶液係用血球分析裝置來測定回收率，並將未與陽離子性接枝聚合物反應的囊泡用作對照。
接著將分散溶液與螢光標識抗體混合，在遮光狀態下以倒轉混合1小時來進行反應，並以螢光顯微鏡確認抗原抗體反應(圖8)。
2.結果
以血球分析裝置的囊泡測定值表示於表6。
從表6的結果來看囊泡之回收率為82%，得到了良好的回收率。
此外，分散溶液中的囊泡在維持著攝入螢光色素的狀 態下，用螢光顯微鏡確認了該囊泡邊緣圍繞著螢光標識抗體的情況。從此結果來看，可以說是能在維持著囊泡之立體構造及表面構造的狀態下進行回收。
<參考例1>
病毒粒子分離、回收的確認
1.方法
使用噬菌體作為由蛋白質外殻及其內部含有的核酸所組成之病毒模型。調整成固定力價(titer)之噬菌體溶液，並以本發明之方法回收噬菌體，再透過記數大腸桿菌溶菌後產生之溶菌斑來計算回收後力價。
1)樣本
噬菌體
宿主大腸桿菌
2)試劑
I：反應液：1M甘胺酸-NaOH pH11.0、3M氯化鎂
II：分散液：500mM甘胺酸-HCl pH5.0
3)陽離子性接枝聚合物
與實施例1相同地調製。
噬菌體的分離方法及檢測方法係如下列進行：
混合噬菌體樣本500μL與10%陽離子性接枝聚合物100μL及反應液50μL，並使其反應1分鐘。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。回收上清液，並將所得沉澱凝聚塊以分散液500μL完全地分散，得到了分散溶液。將所得溶液逐步稀釋，並將稀釋後之溶液與宿主大腸桿菌培養液混合，加入軟寒天並在寒天培養皿上培養一晚，從其溶菌斑數計算經回收之噬菌體的力價。
<實施例8>
使用含有界面活性劑之溶液所回收的細菌之存活確認
1.方法
對沉澱在採血管之分離劑上的大腸桿菌使用含有非離子性界面活性劑之溶液，並在存活的狀態下回收大腸桿菌。
樣本及試劑如下：
1)樣本
大腸桿菌係用Bio-Rad公司製之GFP表現Kit所製作。
將在生理食鹽水中添加了2×108cell/mL所製作的大腸桿菌者用作樣本。
2)試劑
I：1%界面活性劑溶液
界面活性劑係在實驗1~6中分別使用了蔗糖月桂酸酯(同仁化學)、皂素(SIGMA-ALDRICH)、BPSH(NIKKOL)、NOIGEN TDS-70(第一工業製藥)、TritonX-705(SIGMA-ALDRICH)或CHAPS(同仁化學)。
II：反應液：IM甘胺酸pH11.0、3M氯化鎂
III：分散液：500mM甘胺酸pH5.0
3)陽離子性接枝聚合物
與實施例1相同地調製。
菌體的回收及存活確認係如下列進行：
將使大腸桿菌分散於生理食鹽水中之菌液3mL加入採血管，以離心3000rpm進行5分鐘離心後，去除上清液。接著將1%界面活性劑溶液0.5mL添加至採血管，使沉澱在分離劑表面的菌體分散。
菌體分散液在20℃下經過30分鐘，以及靜置3小時後混合10%陽離子性接枝聚合物100μL及反應液100μL， 並使其反應1分鐘。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。去除上清液，並將所得沉澱凝聚塊以分散液500μL完全地分散，得到了分散溶液。將分散溶液百分之1的量，用LB細菌培養寒天培養基在37℃下培養18小時，並以菌落數量來確認生菌數量。
使用生理食鹽水代替界面活性劑溶液以作為對照(對照1)。
2.結果
培養後之樣本中的菌落數量表示於表8。
在實驗1~5使用的非離子性界面活性劑，特別是使用蔗糖月桂酸酯時能夠活著回收細菌。
<實施例9>
使用含有界面活性劑之溶液所回收的大腸桿菌，由質量分析器之測定
1.方法
使用含有界面活性劑之溶液將沉澱於採血管之分離劑上的大腸桿菌回收，並與陽離子性聚合物反應後，透過以70%乙腈洗淨反應物來抑制血液成分的影響，並且調製能夠以質量分析器測定的樣本。
樣本及試劑如下：
1)樣本
大腸桿菌係用Bio-Rad公司製之GFP表現Kit所製作。
將全血及所製作的大腸桿菌以2×108cell/mL添加於細菌培養用培養瓶(BD公司)中以用作樣本。
2)試劑
I：回收液：0.1%界面活性劑
II：反應液1：1M甘胺酸pH11.0
III：反應液2：3M氯化鎂
IV：洗淨液：70%乙腈
V：萃取液：70%蟻酸
VI：分離液：100%乙腈
3)陽離子性接枝聚合物
與實施例1相同地調製。
4)電泳
使用E-R155e-PAGEL 15%凝膠(ATTO)。
凝膠染色係使用2D-銀染色試劑II(COSMO‧BIO)。
5)質量分析
使用Auto FlexII(Bruker)之flexControl 2.0，並遵從使用手冊進行測定。
質譜解析係使用flexAnalysis。
去除血液成分之確認係如下列進行：
採集血液並將所得之血液10mL加入培養瓶中，再從此移動3mL至採血管中。採血管進行3000rpm、5分鐘的離心，分離血球成分及菌體。吸附於採血管中之分離劑表面上的大腸桿菌係於採血管中添加回收液500μL，再回收於1.5mL離心管中。在此使用了蔗糖月桂酸酯、NOIGENXL60、皂素、BPSH、TritonX-705、CHAPS，作為實驗7~12中回收液所含之界面活性劑。
此外作為對照2，使用蒸餾水替代回收液中添加之界面活性劑以探討回收。在含有回收溶液的離心管中將10%陽離子性接枝聚合物100μL與反應液1及反應液2各100μL混合，並使其反應1分鐘。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了凝聚沉澱物。去除上清液，將所得凝聚沉澱物以洗淨液500μL完全地分散，再以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。將上清液回收於1.5離心管中以作為樣本1。凝聚沉澱物則在萃取液50μL中完全地分散後再加入凝聚沉澱液150μL，並以桌上小型離 心機離心30秒。該上清液移至新的1.5離心管以作為樣本2。
這些樣本係以Auto Flex II測定質譜。
此外，實施了以確認雜質之影響為目的之電泳的確認。用於測定之樣本係將對照2及各自從實驗7~12得到的樣本1及2以15000rpm、30分鐘進行離心，並回收其上清液，接著為了濃縮該上清液而進行一晚的冷凍乾燥。將乾燥後之樣本以50μL之SDS sample Buffer溶解以作為電泳用之樣本。使用E-R155e-PAGEL 15%凝膠以進行電泳。
2.結果
電泳結果表示於圖9。
樣本1係確認到主要條帶在分子量10000及30000附近。從該結果來看，發現到藉由洗淨液可去除吸附於陽離子性聚合物的血液成分。此外，樣本2相對於對照2在30000以下之條帶數在較多。從該結果來看，藉由用洗淨液去除血液成分，檢測出來自菌體的蛋白質條帶。
以Auto FlexII得到之質譜表示於圖10。
為了判斷使用之界面活性劑是否會阻礙在質量分析器的離子化，故從所得質譜中透過數據處理用軟體flexAnalysis之Find Mass List機能來統計質量峰數。該結果表示於表9，計數條件則表示於表10。
此外，為了確認回避血液成分影響的效果，故求取來 自血液成分之質量峰相對於來自菌體之質量峰的波峰強度比率。來自菌體的質量峰係在以菌落為樣本時，從檢出之質量峰中選擇6250、9740m/z。來自血液成分之質量峰則是選擇血紅素之質量峰15130m/z。其結果表示於表11。
表9顯示，從實驗7,8之統計質量峰數相較於對照2是增加的來看，其離子化被促進了；另一方面，從實驗9~11中統計質量峰數是減少的來看，其離子化被阻礙的可能性很高。
表11顯示，實驗7、8中來自菌體與來自血液之質量峰比率在1.0以上，來自菌體之波峰較來自血液之波峰檢測出更高的強度。相對於此實驗9~12中來自菌體與來自血液之質量峰比率在1.0以下，來自血液之波峰較來自菌體之波峰檢測出更高的強度，故回避血液成分影響之效果低下。
從此結果來看，實驗7、8的方法抑制了血液成分的影響，並能夠以質量分析器進行測定。
<實施例10>
病毒粒子之分離、回收確認(參考例1的追加試驗)
1.方法
1)樣本
使用自NBRC(獨立行政法人製品評價技術基盤機構Biotechnology Center)購入的Escherichia coli phage T7(CODE：20007)，並遵從NBRC指定實驗指南及一般性實驗程序(例如「無敵的Bio-Technical Series‧基因工程實驗筆記(上)‧2.噬菌體部分(羊土社)」)進行噬菌體調製。
以復水液(10% polypepton、2% Yeast extract、1% MgSO4)200μL使乾燥菌體懸浮後，覆蓋於含有大腸桿菌105cell左右的0.6%寒天培養基(10% polypepton、5% Yeast extract、2.5%NaCl、1%寒天)上。將此培養基盤在37℃下培養一晚，並削取寒天之未形成菌落部分(數cm2左右)，再移至1.5mL離心管中。放入10mM Tris-HCl(pH7.5)1mL，並在20℃下振盪90分鐘後，進行3000rpm、15分鐘的離心並回收上清液以作為噬菌體樣本(冷藏保存)。
2)試劑
I：反應液1：1M甘胺酸-NaOH pH11.0
II：反應液2：3M氯化鎂溶液
III：分散液：1M甘胺酸-HCl pH5.0
3)陽離子性接枝聚合物
與實施例1相同地調製。
噬菌體之分離及力價確認係如下列進行：
混合樣本500μL與20%陽離子性接枝聚合物100μL、反應液1：100μL及反應液2：100μL。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。去除上清液，並將所得沉澱凝聚塊以分散液100μL完全地分散，得到了分散溶液。將分散溶液與含有105cell左右之大腸桿菌的寒天培養基混合，在37℃下培養18小時，確認了大腸桿菌的溶菌(圖11)。
此外，讓與陽離子性接枝聚合物反應之前的噬菌體樣本感染大腸桿菌以作為正對照。
2.結果
發現了藉由接枝聚合物能夠分離噬菌體。
<實施例10>
經分離之大腸桿菌的存活確認
1.方法
1)樣本
將使用與實施例1同樣之Bio-Rad公司製GFP表現Kit所製作的大腸桿菌添加必要數量至正常人血清中，以作為樣本使用。大腸桿菌108cell左右。
2)試劑
I：反應液1：1M甘胺酸-NaOH pH11.0
II：反應液2：3M氯化鎂溶液
III：分散液：1M甘胺酸-HCl pH5.0
3)陽離子性接枝聚合物
使用了上述(5)之環氧辛烷改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物(PAAEpo-g-DADMAC)，以及上述(8)之縮水甘油丁酸酯改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物(PAAGB-g-DADMAC)。
具體來說，將20質量%之聚烯丙胺加水使其變為13質量%，在冷水中冷卻及攪拌並同時滴入環氧辛烷(相對於胺為0.1當量)。滴入結束後並在40℃下使其反應24小時後，將溶液濃縮，得到了水溶液之環氧辛烷改性聚烯丙胺。將調製的30質量%環氧辛烷改性聚烯丙胺加水使其變為19質量%，並在20℃下攪拌。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時。其後再分批追加28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)，得到了水溶液之環氧辛烷改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物。
或者，將20質量%之聚烯丙胺加水使其變為13質量%，在冷水中冷卻及攪拌並同時滴入縮水甘油丁酸酯(相對於胺為0.1當量)。滴入結束後並在40℃下使其反應24小時後，將溶液濃縮，得到了水溶液之縮水甘油丁酸酯改性聚烯丙胺。將調製的30質量%縮水甘油丁酸酯改 性聚烯丙胺加水使其變為19質量%，並在20℃下攪拌。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時。其後再分批追加28.5質量%的APS水溶液14.42g(相對於單體為10莫耳%)，得到了水溶液之縮水甘油丁酸酯改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物。
以上述接枝聚合物成為最終濃度8%，以及以用周知方法製造的乳膠珠(例如聚苯乙烯乳膠LE(平均粒徑：120nm、NITTOBO MEDICAL公司製))成為最終濃度5%之方式將兩者混合，以作為接枝聚合物溶液。
再者，實施例1中使用的上述環氧丙烷改性聚烯丙胺與苯乙烯的接枝聚合物(PAA-g-PSt)亦用作正對照。
大腸桿菌之分離及存活確認係如下列進行：
混合樣本500μL與上述接枝聚合物溶液100μL、反應液1：100μL及反應液2：200μL。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。將上清液移至其他離心管中，接著進行15000rpm、5分鐘的離心，並將所得沉澱物分散於500μL分散液中。
把透過去除上清液所得之沉澱凝聚塊以分散液500μL完全地分散，得到了分散溶液。
將來自上清液及來自沉澱凝聚塊的分散溶液100μL加入各別的5mL LB液體培養基中，並在37℃下培養18小時，為了確認大腸桿菌的存活而以分光光度計測量培養前 後之培養液樣本的吸光度，並以該變化量作為大腸桿菌量。
此外，將上述來自上清液及來自沉澱凝聚塊的分散溶液50μL塗佈於LB細菌培養寒天培養基上，並在37℃下培養18小時，再由菌落的形成來確認大腸桿菌的存活(圖12)。
此外，作為負對照，亦探討含有聚苯乙烯乳膠LE而不含上述接枝聚合物的情況。
2.結果
如同下表12中，發現了未形成粒子之接枝聚合物亦可將目標物分離濃縮。
<實施例11>
經分離之大腸桿菌的存活確認
1.方法
1)樣本
將使用與實施例1同樣之Bio-Rad公司製GFP表現Kit所製作的大腸桿菌添加必要數量至正常人血清中，以作為樣本使用。大腸桿菌108cell左右。
2)試劑
I：反應液1：1M甘胺酸-NaOH pH11.0
II：反應液2：3M氯化鎂溶液
III：分散液：1M甘胺酸-HCl pH5.0
3)陽離子性接枝聚合物
使用了上述(5)之環氧辛烷改性聚烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物(PAAEpo-g-DADMAC)。
大腸桿菌之分離及存活確認係如下列進行：
混合樣本500μL與上述接枝聚合物溶液100μL、反應液1：100μL及反應液2：200μL。將樣本及上述接枝聚合物混合後，再添加以周知方法製造的乳膠珠(例如聚苯乙烯乳膠LE(平均粒徑：120nm、NITTOBO MEDICAL公司製))20μL並充分混合後，以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。將上清液移至其它離心管，再進行15000rpm、5分鐘的離心，並將所得沉澱物分散於500μL分散液中。
把透過去除上清液所得之沉澱凝聚塊以分散液500μL完全地分散，得到了分散溶液。
將上述來自上清液及來自沉澱凝聚塊的分散溶液50μL塗佈於LB細菌培養寒天培養基上，並在37℃下培養18小時，再由菌落的形成來確認大腸桿菌的存活。
2.結果
接枝聚合物無論是先與乳膠珠混合或是與菌體反應後再添加乳膠珠，均能同樣地捕獲菌體(圖13)。
<實施例12>
經分離之大腸桿菌的存活確認
1.方法
1)樣本
將使用與實施例1同樣之Bio-Rad公司製GFP表現Kit所製作的大腸桿菌添加必要數量至正常人血清中，以作為樣本使用。大腸桿菌108cell左右。
2)試劑
I：反應液1：1M甘胺酸-NaOH pH11.0
II：反應液2：3M氯化鎂溶液
III：分散液：1M甘胺酸-HCl pH5.0
3)陽離子性接枝聚合物
使用了上述(11)之縮水甘油改性聚二烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物。
具體來說，將二烯丙胺加水使其變為79質量%，在冰水中冷卻及攪拌並同時滴入縮水甘油(相對於胺為1當量)。滴入結束後並在45℃下反應24小時後，將溶液濃縮，得到了水溶液之縮水甘油改性二烯丙胺。
在78質量%之縮水甘油改性二烯丙胺中加入35質量 %之鹽酸(相對於胺為1當量)。其後加水使其變為50質量%，加溫至60℃，並分批添加2,2’-偶氮雙(2-甲基丙脒)2鹽酸鹽(相對於單體為6莫耳%)，使其聚合24小時。將所得溶液以電滲析進行純化，得到了縮水甘油改性聚二烯丙胺的水溶液。在調製的43質量%之縮水甘油改性聚二烯丙胺中加水使其變為30質量%，並在20℃下攪拌。接著各自分批添加65質量%的二烯丙基二甲基氯化銨(相對於胺為3當量)及28.5質量%的APS水溶液36.04g(相對於單體為10莫耳%)並使其聚合24小時。其後再分批追加28.5質量%的APS水溶液36.04g(相對於單體為10莫耳%)，在50℃下聚合24小時，得到了水溶液之縮水甘油改性聚二烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨之接枝聚合物。
以上述接枝聚合物成為最終濃度8%，以及以用周知方法製造的乳膠珠(例如聚苯乙烯乳膠LE(平均粒徑：120nm、NITTOBO MEDICAL公司製))成為最終濃度5%之方式將兩者混合，以作為接枝聚合物溶液。
再者，實施例1中使用的上述(3)之環氧丙烷改性聚烯丙胺與苯乙烯的接枝聚合物(PAA-g-PSt)亦用作正對照。
大腸桿菌之分離及存活確認係如下列進行：
混合樣本500μL與上述接枝聚合物溶液100μL、反應液1：100μL及反應液2：200μL。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。將上清液移至其他離心 管中，接著進行15000rpm、5分鐘的離心，並將所得沉澱物分散於500μL分散液中。
把透過去除上清液所得之沉澱凝聚塊以分散液500μL完全地分散，得到了分散溶液。
將來自上清液及來自沉澱凝聚塊的分散溶液100μL加入各別的5mL LB液體培養基中，並在37℃下培養18小時，為了確認大腸桿菌的存活而以分光光度計測量培養前後之培養液樣本的吸光度，並以該變化量作為大腸桿菌量。
此外，將上述來自上清液及來自沉澱凝聚塊的分散溶液50μL塗佈於LB細菌培養寒天培養基上，並在37℃下培養18小時，再由菌落的形成來確認大腸桿菌的存活(圖14)。
此外，作為對照，亦探討含有聚苯乙烯乳膠LE而不含上述接枝聚合物的情況。
2.結果
<實施例13>
以質量分析器的測定
1.方法
1)樣本
將使用與實施例1同樣之Bio-Rad公司製GFP表現Kit所製作的大腸桿菌添加必要數量至正常人血清中，以作為樣本使用。大腸桿菌108cell左右。
2)試劑
I：反應液1：1M甘胺酸-NaOH pH11.0
II：反應液2：3M氯化鎂溶液
III：分散液：70%蟻酸
IV：凝聚液：100%乙腈
3)陽離子性接枝聚合物
使用了實施例12中使用之上述(11)縮水甘油改性聚二烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物。
以上述接枝聚合物成為最終濃度8%，以及以用周知方法製造的乳膠珠(例如聚苯乙烯乳膠LE(平均粒徑：120nm、NITTOBO MEDICAL公司製))成為最終濃度5%之方式將兩者混合，以作為接枝聚合物溶液。
再者，實施例1中使用的上述(3)之環氧丙烷改性聚烯丙胺與苯乙烯的接枝聚合物(PAA-g-PSt)亦用作正對照。
大腸桿菌之分離及以質量分析器之測定係如下列進行：
混合樣本500μL與上述接枝聚合物溶液50μL、反應 液1：100μL及反應液2：200μL。其後以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。
去除上清液，所得之沉澱凝聚塊以分散液30μL完全地分散，接著混合凝聚液100μL後，以桌上小型離心機離心60秒，所得上清液作為質量分析器的測定樣本。質量分析器的操作進行係相同於實施例3。
此外，作為對照，亦探討含有聚苯乙烯乳膠LE而不含上述接枝聚合物的情況。
2.結果
此外，在使用縮水甘油改性聚二烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物和乳膠珠的混合液時，根據以質量分析器之測定可明白，即使不添加反應液2(鎂離子)亦可捕捉/回收大腸桿菌。
<實施例14>
分離之大腸桿菌的存活確認
1.方法
1)樣本
將使用與實施例1同樣之Bio-Rad公司製GFP表現Kit所製作的大腸桿菌添加必要數量至正常人血清中，以作為樣本使用。大腸桿菌108cell左右。
2)試劑
I：反應液1：1M甘胺酸-NaOH pH11.0
II：反應液2：3M氯化鎂溶液
III：分散液：1M甘胺酸-HCl pH5.0
3)陽離子性接枝聚合物
使用了實施例12中使用之上述(11)縮水甘油改性聚二烯丙胺與二烯丙基二甲基氯化銨的接枝聚合物。
大腸桿菌之分離及存活確認係如下列進行：
混合樣本500μL與上述接枝聚合物溶液100μL、反應液1：100μL及反應液2：200μL。將樣本及上述接枝聚合物混合後，再添加以周知方法製造的乳膠珠(例如聚苯乙烯乳膠LE(平均粒徑：120nm、NITTOBO MEDICAL公司製))20μL並充分混合後，以桌上小型離心機離心30秒，得到了沉澱凝聚塊。將上清液移至其他離心管中，接著進行15000rpm、5分鐘的離心，並將所得沉澱物分散 於500μL分散液中。
把透過去除上清液所得之沉澱凝聚塊以分散液500μL完全地分散，得到了分散溶液。
將上述來自上清液及來自沉澱凝聚塊的分散溶液50μL塗佈於LB細菌培養寒天培養基上，並在37℃下培養18小時，再由菌落的形成來確認大腸桿菌的存活。
2.結果
接枝聚合物無論是先與乳膠珠混合或是與菌體反應後再添加乳膠珠，均能同樣地捕獲菌體(圖15)。
[產業上之可利用性]
本發明方法及其為了其之套組相較於以往的離子交換聚合物使用方法，更能將對象物有效率地分離純化，即使樣本中對象物的存在量極為稀少亦能檢測到。

Claims (11)

  1. 一種方法，其係使用陽離子性接枝聚合物而分離濃縮目標物的方法，其包含下述(1)~(3)步驟：(1)在鹼性條件下使包含陽離子性接枝聚合物與目標物之樣本接觸，使目標物與陽離子性接枝聚合物鍵結的步驟；(2)分離陽離子性接枝聚合物與標的生體分子之鍵結體的步驟；及(3)由前述鍵結體溶出目標物的步驟；[其中，前述陽離子性接枝聚合物係將聚胺衍生物與乙烯性不飽和單體(c)進行聚合而得之聚胺接枝聚合物，前述聚胺衍生物係將具有至少1個胺基之高分子化合物(a)與具有至少1個環氧基之化合物(b)進行反應而得者]。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟(1)中，進一步包含添加二價或三價之金屬離子之事。
  3. 如請求項1或2之方法，其中步驟(2)中，進一步包含洗淨鍵結體的步驟。
  4. 如請求項1~3中任一項之方法，其中前述陽離子性接枝聚合物被固定於固相面上。
  5. 如請求項1~3中任一項之方法，其中步驟(3)中，包含使未與目標物鍵結之陽離子性接枝聚合物凝聚的步驟。
  6. 一種套組，其係為了如請求項1~5中任一項之方法 所使用的套組，其包含陽離子性接枝聚合物。
  7. 如請求項6之套組，其中進一步包含二價或三價之金屬離子鹽。
  8. 如請求項6之套組，其中進一步包含鹼性溶液與二價或三價之金屬離子鹽的反應液。
  9. 如請求項6~8中任一項之套組，其中進一步包含洗淨液。
  10. 如請求項6~9中任一項之套組，其中進一步包含含有酸性溶液或螯合劑的分散液。
  11. 如請求項6~10中任一項之套組，其中進一步包含凝聚液。
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