JP2001327283A

JP2001327283A - ウイルス濃縮用粒子、ウィルス濃縮用試薬、ウイルス濃縮方法およびウイルス検出方法

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Publication number: JP2001327283A
Application number: JP2000150366A
Authority: JP
Inventors: Shozo Nishida; 昌三西田; Mikio Hikata; 幹雄日方
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 2000-05-22
Filing date: 2000-05-22
Publication date: 2001-11-27
Anticipated expiration: 2020-05-22
Also published as: JP4370690B2

Abstract

(57)【要約】【課題】試料中のウイルスを濃縮するためのウィル
ス濃縮用粒子、ウイルス濃縮用試薬、ウイルス濃縮方法
およびウイルス検査方法を得る。【解決手段】粒子表面にカチオン性基またはその塩
を有する無機粒子からなるウイルス濃縮用粒子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中のウイルス
を濃縮するためのウィルス濃縮用粒子、ウイルス濃縮用
試薬、ウイルス濃縮方法およびウイルス検査方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ウイルスはヒトや動植物のさまざまな病
気の原因の一つであり、その検査・診断のためには原因
ウイルスの確認が非常に重要である。従来のウイルス検
査・診断法としては、ウイルス抗原あるいは抗ウイルス
抗体の免疫学的測定が一般的である。しかしながら、ウ
イルス感染から数日〜数週間は、ウイルス量あるいは抗
ウイルス抗体量が少ないため、これらの免疫学的測定法
では検出できない場合がある。この検出不可能な期間は
ウインドウ・ピリオド（空白期間）と呼ばれており、こ
のような患者が献血を行った場合、その献血液は十分な
感染性を持つことが多く、不特定多数の輸血患者・血液
製剤利用患者に危険をおよぼす可能性がある。したがっ
て、ウインドウ・ピリオドをできる限り短縮するため、
免疫学的測定限界下のウイルスを高感度に検出できる技
術の開発が急務とされている。

【０００３】近年、ポリメラーゼチェインリアクション
法（以下ＰＣＲ法）に代表される、核酸増幅技術によ
り、極微量のウイルスでも検出できる可能性が開けてき
た。しかしながら、ＰＣＲ法などによっても極微量のウ
イルス検出は特殊な施設と高度な技術が必要とされ、一
般的な施設で簡便に実施することはきわめて困難であ
る。そこで、これらの問題解決のため、検体中のウイル
スを濃縮する手法が用いられている。

【０００４】従来のウイルス濃縮法の代表例としては超
遠心法が挙げられるが、高価な機器と長時間を要し、か
つ同時に多数の検体を処理することは困難であり簡便な
方法とは言い難い。また、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
（ＨＢｓ抗原）がヘパリンと結合する性質から、ヘパリ
ンセファロース担体によるクロマトグラフィー法も報告
されているが、これも同時に多数の検体を処理すること
は困難である。その他、硫酸アンモニウムやポリエチレ
ングリコール、ポリアニオンと２価イオンの組み合わ
せ、例えば酸性基を有する粒状物質（特公平６−２２６
２７号公報）や粒子と２価金属を用いる方法（特開平６
−２１７７６７号公報）、カチオン性基を有する水溶性
高分子物質を加えウィルス除去する方法（特開平４−３
４２５３６号公報）等によりウイルスを沈殿させる方法
があるが、混合する試薬や分離されるウィルスに混入す
る多量の蛋白などにＰＣＲ阻害がある等の問題からウイ
ルスの沈殿分離後の試料精製が必要であるという難点が
あった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
のウイルス濃縮法の問題点を解決し、簡便な手段によ
り、同時に多数の検体を簡便に処理することができ、自
動化への対応も容易で、核酸増幅検査に悪影響を及ぼさ
ないウイルス濃縮用粒子並びにこの粒子を使用するウイ
ルス濃縮用試薬、ウイルス濃縮方法およびウイルス検出
方法を提供することにある。

【０００６】

【発明を解決するための手段】本発明者らは研究の結
果、上記課題を解決する手段として、次のウイルス濃縮
用粒子および濃縮方法を開発するに到った。即ち、本発
明は、第一に、粒子表面にカチオン性基（塩の状態を含
む）を有する粒子（以下、「ウィルス濃縮用粒子」と称
することがある）からなるウイルス濃縮用粒子を提供す
る。また、本発明は、第二に、ウイルスを含有する可能
性のある試料に上記のウィルス濃縮用粒子を添加し、ウ
イルスを前記粒子に結合させる段階、次にこうしてウイ
ルスが結合した前記粒子を試料から分離、収集する段階
を含む、ウイルス濃縮方法を提供するものである。さら
に、本発明は、第三に、ウイルスを含有する可能性のあ
る試料に上記のウイルス濃縮用粒子を添加し、ウイルス
を前記粒子に結合させる段階、次にこうしてウイルスが
結合した前記粒子を試料から分離、収集することにより
ウイルスを濃縮する段階、こうして濃縮されたウイルス
を核酸増幅検査に供する段階を含む、ウイルス検出方法
を提供する。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
〈ウイルス濃縮用粒子〉本発明において、ウイルス濃縮
用粒子とは、血液や体液等の検体中のウイルスを吸着し
た後、分離・濃縮する粒子であり、当該粒子により分離
・濃縮されたウイルスは核酸抽出・検査・診断、特に核
酸増幅を伴う検査・診断に用いられる。本発明のウイル
ス濃縮用粒子は粒子表面にカチオン性基（塩の状態を含
む）を有する粒子である。

【０００８】本発明のウイルス濃縮用粒子は、水不溶性
の無機材料であれば特に限定されず、そのような材料か
らなる粒子と該粒子の表面に存在するカチオン性基とか
ら構成されている。

【０００９】本発明におけるカチオン性基は、１級アミ
ノ基、２級アミノ基、３級アミノ基；４級アンモニユム
基；各級のイミノ基；各級のアミジノ基、イミジノ基、
ヒドラジノ基；さらにピリジル基等の窒素原子を含む環
状基等を挙げることができる。本発明では、カチオン性
基は、アミノ基等のプロトンと結合してカチオンを形成
し得る基および該基が酸と反応して塩を生成し、塩のカ
チオン部を形成している基を包含する。本発明において
カチオン性基は、水や緩衝液、血液、体液中に溶出する
とＰＣＲ法などの核酸増幅法を阻害することがあるた
め、粒子に化学的に結合されている必要がある。その存
在量は、粒子１ｇ当り平均で１×１０^-10当量以上であ
り、代表的には１×１０^-10〜１×１０^-2当量であり、
好ましくは１×１０^-9〜１×１０^-3当量であり、より好
ましくは１×１０^-8〜１×１０^-3当量である。カチオン
性基の存在量が粒子１ｇ当り１×１０^-10当量より少な
いとウイルス濃縮能力が不十分である。限定するもので
はないが、通常、粒径１ｇ当り１×１０^-2当量より多く
のカチオン性基を導入することは困難なことが多い。

【００１０】本発明のウィルス濃縮用粒子は、シリカ、
アルミナ、チタニアなどの金属酸化物類を主体とした無
機物で構成されており、このような粒子の表面にカチオ
ン性基を付与する方法は粒子表面にカルボキシル基、ハ
イドロキシル基、エポキシ基、アミノ基、アミド基、ビ
ニル基など（粒子表面に導入後変性してこれらの官能基
になるものを含む）を、シランカップリング剤を反応さ
せ、また粒子を構成する金属酸化物を金属アルコキシド
の加水分解・縮合反応により形成する場合はシランカッ
プリング剤を共存させて反応させることにより導入し、
それらの基を結合部としてカチオン性基を有する化合物
を反応させることにより、カチオン性基を付与すること
ができる。シランカップリング剤がアミノ基を導入す
る、例えば、アミノプロピルトリエトキシシランの如き
ものであれば、さらなる反応を行わなくてもカチオン性
基を有する粒子であることは当然である。カチオン性基
を有する化合物としては、生物試料由来の、プトレッシ
ン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、1,3-ジア
ミノプロパン、カルジン、ホモスペルミン、3-アミノプ
ロピルカダベリン、ノルスペルミン、テルモスペルミ
ン、カルドペンタミン等のポリアミンおよびそれらの重
合生成物、ヒストンおよびプロタミンに分類される塩基
性タンパク質とそれらの重合体、ポリビニルアミン、ポ
リアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリプロピレン
イミンなどのポリアルキルアミン、ポリアルキルイミン
などに分類されるポリアミン化合物、ポリリシン、ポリ
アルギニン、ポリヒスチジンなどのポリアミノ酸類、そ
の他ポリジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリジ
メチルアミノエチルメタクリレート、ポリビニルピリジ
ン４級化物、ポリブレン、キトサン、グリコールキトサ
ン、メチルグリコールキトサン、ポリジアリルジメチル
アンモニウム等の合成、天然、半合成（発酵、遺伝子組
み替えを含む）高分子、エチレンジアミン、トリメチレ
ンジアミン、テトラメチレンジアミン、ペンタメチレン
ジアミン、ヘキサメチレンジアミン等のジアミン類等が
挙げられる。

【００１１】本発明のウィルス濃縮用粒子は、その粒子
の内部または表面に磁性体を含有することもできる。こ
の磁性体は該粒子の内部のみに含有され、表面に露出し
ていないことが好ましい。本発明においては、ウイルス
濃縮用粒子に磁性体を含有させることにより、該粒子の
磁気を作用させて収集することが可能となり、遠心分離
等による操作が不要で検査時間を短縮させることが可能
となるほか、検査・診断の自動化への対応も容易とな
る。このような磁性体は、例えば四三酸化鉄（Ｆｅ
₃Ｏ₄）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）等の各種フ
ェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金属
またはこれら金属の合金などを用いることができる。

【００１２】磁性体の含有量は、ウイルス濃縮用粒子全
体に対し10重量％以上、特に20〜100重量％であること
が好ましい。この量が少なすぎると、該ウイルス濃縮用
粒子に、良好な磁気分離性が得られず、その結果、後述
するウイルスの分離・濃縮方法において、血液または体
液等の検体からウイルス濃縮用粒子を分離するために相
当に長い時間を要するので、高い時間的効率が得られな
いことがあり、好ましくない。

【００１３】本発明において、磁性体をウィルス濃縮用
粒子に含有させるには、磁性体粒子を金属アルコキシド
またはその溶液中に分散した後、当該金属アルコキシド
を加水分解および縮合することにより、当該磁性体粒子
の表面に被膜または微粒子を形成する方法、いわゆるゾ
ル−ゲル法を利用することができる。具体的に説明する
と、先ず、磁性体粒子を金属アルコキシドまたはその溶
液に添加し、超音波分散機などによって磁性体粒子を十
分に分散させ、次いで、得られた分散液を十分に攪拌し
ながら、当該分散液に水および触媒を添加して金属アル
コキシドの加水分解反応および縮合反応を行う。

【００１４】ここで、金属アルコキシドとしては、下記
一般式（１）で表される構造を有するものを用いること
が好ましい。Ｒ¹ｎＳｉ（ＯＲ²）ｎ-４（１）（Ｒ¹およびＲ²は置換または無置換の１価の炭化水素基
を示し、ｎは０〜３の整数である）Ｒ¹およびＲ²の具体例としては、メチル基、エチル基、
プロピル基、ビニル基、フェニル基、などの１価の炭化
水素基およびこれらの基における水素原子がハロゲン原
子またはアミノ基で置換された置換炭化水素基を挙げる
ことができる。

【００１５】金属アルコキシドの具体例としては、金属
が珪素の場合が一般的で例えば、テトラメトキシシラ
ン、テトラエトキシシラン、テトライソプロポキシシラ
ン、テトラブトキシシラン、メチルトリメトキシシラ
ン、メチルトリエトキシシラン、アミノフェニルトリメ
トキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ
−２−アミノエチル−３−アミノプロピルトリメトキシ
シラン、３−クロロプロピルートリメトキシシランなど
が挙げられる。これらの中で、アミノ基やハロゲン基を
有するアルコキシドを使用すれば、粒子表面に変性可能
な官能基を導入することができ、前述のカチオン性基を
有する化合物を粒子に固定する結合基となる。

【００１６】以上において、金属アルコキシドの使用割
合は、磁性体粒子１００重量部に対して、１〜１０００
重量部、特に３０〜５００重量部であることが好まし
い。金属アルコキシドの割合が少なすぎると、磁性体粒
子の表面に均一に被膜または微粒子を形成することが困
難となる。一方、金属アルコキシドの割合が多すぎる
と、磁性体粒子を含有しないシリカ粒子が多量に発生す
るため、好ましくない。

【００１７】また、上記の金属アルコキシドの代わり
に、これらが縮合されてなるオリゴマーを用いることも
できる。このようなオリゴマーを用いる場合には，ポリ
スチレン換算の重量平均分子量が５００〜１００００の
ものが好ましい。このオリゴマーは、直鎖状、分枝状ま
たは環状構造のいずれであってもよい。

【００１８】金属アルコキシド溶液を調製するための有
機溶媒としては、アルコール類、ケトン類、エステル類
などを用いることができる。その具体例としては、エタ
ノール、メタノール、イソプロパノール、ブチルアルコ
ール、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトンなど
が挙げられる。これらは単独または２種以上を混合して
用いることができる。これらの有機溶媒の使用割合は、
金属アルコキシド１００重量部に対して０〜１０００重
量部である。

【００１９】金属アルコキシドの加水分解に用いられる
水の使用割合は、金属アルコキシド１００重量部に対し
て、好ましくは１〜５０００重量部、さらに好ましくは
１０〜２０００重量部である。この割合が少ないと、加
水分解反応が迅速に進行しないため、当該磁性シリカ粒
子の製造において高い時間的効率が得られず、実用的で
はない。一方、この割合が多すぎると、磁性体粒子を含
有しないシリカ粒子が多量に発生するため、好ましくな
い。また、水は、そのまま分散液に添加してもよく、ま
た、上記の有機溶媒と混合して分散液に添加してもよ
い。

【００２０】触媒としては、ルイス酸や塩基などを用い
ることができ、具体的には、塩酸などの無機酸化合物、
酢酸などの有機酸化合物、アンモニアなどの無機塩基化
合物、エタノールアミンなどの有機アミン化合物などを
用いることができる。触媒の使用割合は、金属アルコキ
シド１００重量部に対し、好ましくは０．０１〜１００
重量部、さらに好ましくは０．２〜５０重量部である。

【００２１】このようにして得られるウィルス濃縮粒子
は、その分散媒に合成過程で使用した種々の化合物およ
びその反応物、例えば、分散剤、未反応のカチオン基を
有する化合物、触媒、各種イオン類などを含んでいる。
これらの物質は、核酸増幅検査段階において反応阻害物
となる可能性が高いため、例えばAdv.Colloid Interfac
e Sci.,81,77〜165(1999)などに示される方法によりウ
ィルス濃縮用粒子の分散媒から除去することが好まし
い。後述するカチオン性基の定量に滴定を採用する場合
には、最終的に混床型イオン交換樹脂などを用いてウィ
ルス濃縮用粒子を精製することが好ましい。

【００２２】（多価金属化合物）本発明において、ウイ
ルス濃縮用粒子とともに多価金属化合物を試料に添加す
ることにより、ウイルスのウイルス濃縮用粒子への結合
割合をより高くすることができる場合がある。ここで多
価金属としては、例えば、Be, Mg, Sr, Ba, Ti, Zr, C
r, Mo, W, Mn,Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ni, Pd, Pt, Cu, A
g, Au, Zn, Cd, Hg, Al, Ga, Si, Ge,Sn, Pb, P, As, S
b, Biなどを挙げることができ、多価金属化合物とはこ
れら多価金属の塩化物、水酸化物、炭酸化合物、硫酸化
合物、硝酸化合物、酢酸化合物、塩素酸化合物などのう
ち、水中で解離して２価以上のカチオンを生成する化合
物である。これらの多価金属化合物としては、塩化マグ
ネシウムなどが好ましい。多価金属化合物の使用量は、
通常、ウイルス濃縮用粒子と試料とを混合する際の反応
液中濃度が1〜100mol/ｍ³となる量である。

【００２３】（ウィルス濃縮用試薬）本発明において、
ウィルス濃縮用試薬とは前記ウィルス濃縮用粒子と多価
金属化合物を組み合わせてなる。本発明においてウィル
ス濃縮用試薬はウィルス濃縮用粒子を水性媒体に分散し
た分散液に予め多価金属化合物を添加しておいてもよい
し、前記分散液と多価金属化合物を別個に保管してお
き、使用直前に混合する形としてもよい。

【００２４】本発明のウイルス濃縮用粒子をウイルスを
含む試料液に添加するとウイルスが該粒子の表面に存在
するカチオン性基により粒子に結合する。その結果、血
漿や血清等の検体中のウイルスを高い効率で濃縮するた
め、通常、カラムクロマト法ではなくバッチ法にて使用
される。したがって、粒子の粒径は通常0.1〜300μm、
好ましくは0.1〜100μm、より好ましくは0.2〜80μmで
ある。粒径がこの範囲内であれば粒径が均一でなくても
本発明の目的のために使用することが可能である。粒径
が0.1μm未満の場合は、血液または体液からウイルス濃
縮用粒子を分離する際の遠心分離の回転数や回転時間の
増加を招き、装置が大型になったり、高い時間的効率が
得られず好ましくない。また、粒径が300μmを越える場
合は、ウイルスを捕獲する効率が低下し、ウイルス濃縮
が十分に行えないことがあるため好ましくない。また、
本発明のウイルス濃縮用粒子の粒子形状は球状である必
要はなく、異形粒子であってもかまわない。なお球状で
ない粒子の粒径としては、それぞれの粒子の最長径と最
短径との平均値をとるものとする。

【００２５】〈ウイルス濃縮方法〉次に、本発明のウイ
ルス濃縮用粒子（試薬）によるウイルス濃縮方法につい
て具体的に説明する。本発明のウイルス濃縮用粒子（試
薬）は各種ウイルスに対して濃縮能を有しており、例え
ば、ヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス等）、アデノ
ウイルス、フラビウイルス（日本脳炎ウイルス等）、ヘ
ルペスウイルス、（単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状
疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス
等）、ポックスウイルス、パルボウイルス（アデノ関連
ウイルス等）、オルソミクソウイルス（インフルエンザ
ウイルス等）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス等）、
レトロウイルス（後天性免疫不全症候群ウイルス等）、
Ｃ型肝炎ウイルス等のウイルスの濃縮が可能である。

【００２６】本発明のウイルス濃縮用粒子（試薬）によ
るウイルス濃縮の対象となる検体としては、血漿、血
清、細胞破砕液、尿、唾液等の各種体液、培養細胞破砕
液等を挙げることができる。このような検体はそのまま
試料として使用されてもよいし、何らかの目的で希釈な
どされた状態で試料として使用されてもよい。

【００２７】本発明のウイルス濃縮用粒子（試薬）の試
料への添加量は、試料に含まれているウイルス濃度にも
よるが、（ウィルス濃縮試薬中の）ウィルス濃縮用粒子
が試料の通常0.05〜50重量％、好ましくは0.05〜10重量
％である。添加量が少なすぎると、ウイルス濃縮用粒子
に結合できるウイルスの数が限られるため濃縮効率が悪
化する。また、添加量が多すぎると、結合したウイルス
を後段階で脱離させるのに多量の脱離液が必要となり濃
縮効率が低下する。

【００２８】試料中のウイルスを吸着したウイルス濃縮
用粒子は、遠心分離あるいは自然沈降により、またウィ
ルス濃縮用粒子が磁性体を含有する場合には磁気分離に
より試料から分離される。本発明で使用されるウイルス
濃縮用粒子は通常、0.1〜300μmの粒径範囲を持つの
で、遠心機でも十分遠心分離が可能である。分離された
ウイルス濃縮用粒子は必要に応じて、低濃度の緩衝液で
洗浄した後、ウイルスの粒子からの分離、核酸の抽出工
程に移る。なお、核酸抽出は、ウイルスが粒子に結合し
たままでも行うことができる。例えば、分離されたウイ
ルス濃縮用粒子に少量の緩衝液を加え、加熱することで
直接、ウイルスの核酸を抽出することも可能であるし、
市販されている核酸抽出試薬を直接添加してウイルスの
核酸を抽出することも可能である。

【００２９】ウイルスを粒子から分離する方法として
は、塩溶液を作用させてウイルス濃縮用粒子とウイルス
とを解離させる方法がある。塩溶液としては高濃度の臭
化カリウム、臭化ナトリウム、1.5M塩化ナトリウム、1m
Mリンタングステン酸等を用いることができる。

【００３０】〈ウイルス検出方法〉このウイルス検出方
法は、上記のようにしてウイルスが結合した本発明の粒
子を試料から分離、収集することによりウイルスを濃縮
する段階ののち、こうして濃縮されたウイルスを核酸増
幅検査に供する段階を有している。

【００３１】ウイルスの核酸増幅検査（ＮＡＴ; Nuclei
c acid amplification test）の方法は特に限定され
ず、例えば、ロシュ社のＰＣＲ(Polymerization chain
reaction)法、ジェン・プローブ社のＴＭＡ(Transcript
ion Mediated amplification-hybridization protectio
n assay)法、アボット社のＬＣＲ(Ligase chain reacti
on)法等を利用することができる。このウイルス濃縮方
法を利用したウイルス検出法では、核酸増幅検査に供さ
れる検体中のウイルスが既に濃縮されているので、元の
検体または試料に含まれているウイルスが極く微量であ
っても効率的にウイルスの検出を行うことができる。ま
た、本発明のウィルス濃縮用粒子は試料中のウィルス外
皮蛋白の検出にも使用することができる。具体的には、
本発明のウィルス濃縮用粒子を試料と混合し、吸着され
たウィルス外皮蛋白を標識抗体で検出する方法をあげる
ことができる。この方法では、標識抗体の種類を変える
ことにより各種のウィルス外皮蛋白を検出することがで
きる。

【００３２】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。本実
施例において得られるウィルス濃縮用粒子の粒径および
カチオン性基の存在量について下記の方法で定量した。粒径の測定：光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡または透過
型電子顕微鏡により写真撮影を行い２００個の粒子の粒
径を測定し、その平均値を求めた。カチオン性基の存在量：伝導度滴定法ウィルス濃縮用粒子を遠心分離あるい
は磁気分離により純水で２回洗浄し、粒子１gあたり混
床型イオン交換樹脂５ｇを添加し、混合後１時間攪拌し
た後、混床型イオン交換樹脂を濾去した。この混床型イ
オン交換樹脂による精製を２回繰り返した。得られた精
製粒子を硫酸規定液を滴定液として滴定した。これはイ
オン交換樹脂で精製後、NaOH水溶液でpHを１１程度に上
げ、硫酸規定液で滴定する事によっても求めることがで
きる。参考文献；（イ）Preprints Symp Colloid Interface C
hem Jpn, 32, 314(1979) （ロ）J. Appl Polm Sci, 26, 2015(1981) 非水滴定法上記と同様にウィルス濃縮用粒子を精
製後、乾燥しクロロホルムに溶解し、クロロホルムに不
溶分を濾去した後、過塩素酸／酢酸溶液の規定液を用い
て滴定しカチオン性基量を定量した。

【００３３】実施例１ γ-Fe₂O₃粒子（マグヘマイト、シーアイ化成製、一次粒
子の平均粒径：０．０２μｍ）１０ｇを、エタノール１
００ｇとテトラエトキシシラン１０ｇとの混合溶液に添
加し、超音波分散機により十分に分散させた。この分散
液をエタノールの揮散を防ぐ程度の密閉が可能な反応器
に仕込み、室温で十分撹拌しながら、１.0ｗｔ％のア
ンモニア水溶液２０ｇを３０分かけて添加し、さらに５
時間撹拌を継続してテトラエトキシシランの加水分解及
び縮合反応を完結させた。そして、磁石により磁性粒子
と上澄みを分離し上澄みを除去した。そこへ新たなエタ
ノール１００ｇとメタクリルオキシメチルトリエトキシ
シラン（ＭＯＴＥＳ）３.０ｇの混合溶液を添加し、よ
く撹拌しながら、１.０ｗｔ％のアンモニア水溶液５.０
ｇを１０分かけて添加し、さらに５時間撹拌を継続して
ＭＯＴＥＳの反応を完結させた。磁気分離・上澄み除去
を行い、さらにエタノール添加撹拌、磁気分離・上澄み
除去を２回繰り返した後、室温での風乾に続いて真空乾
燥を５時間以上行った。こうして得られた粉体に、エタ
ノール１０.０ｇ、メタクリル酸２.０ｇおよびアゾビス
イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０.０５ｇを添加して
よく撹拌し、ウオーターバスにより温度を７５℃に上昇
させ、７時間その温度に保って反応させた。その後、未
反応のメタクリル酸や粒子表面にグラフトしていないポ
リメタクリル酸や開始剤残渣を除去するために、５０ｇ
程度のエタノールを添加して撹拌、磁気分離、上清除去
の洗浄を３回行い、さらに、１回５０〜１００ｇ程度の
蒸留水を使用して添加、撹拌、磁気分離、上清除去のプ
ロセスを３回繰り返した。こうして得られた、表面にポ
リアクリル酸をグラフトしたシリカ粒子の乾燥重量で
１.０ｇをとり、２０ｍｌの１０ｍＭＭＥＳ緩衝溶液
（ｐＨ６）を添加し、ポリエチレンイミン（数平均分子
量７万）の３９％水溶性３３μｌおよびカルボジイミド
試薬であるＥＤＣ・塩酸塩（１−エチル−３（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライ
ド）０．２ｇを添加し、２０℃、２時間反応させた。反
応終了後、磁気分離、上清除去、蒸留水添加、撹拌、磁
気分離のプロセスを３回繰り返して表面にカチオン性基
を有したウィルス濃縮用無機粒子を得た。実施例２ γ-Fe₂O₃粒子（マグヘマイト、シーアイ化成製一次粒
子の平均粒径：０．０２μｍ）１０ｇを、エタノール１
００ｇとテトラエトキシシラン１０ｇとの混合溶液に添
加し、超音波分散機により十分に分散させた。この分散
液をエタノールの揮散を防ぐ程度の密閉が可能な反応器
に仕込み、室温で十分撹拌しながら、１.0ｗｔ％のア
ンモニア水溶液２０ｇを３０分かけて添加し、さらに５
時間撹拌を継続してテトラエトキシシランの加水分解及
び縮合反応を完結させた。そして、磁石により磁性粒子
と上澄みを分離し上澄みを除去した。そこへ新たなエタ
ノール１００g とアミノプロピルトリエトキシシラン
１０ｇとの混合溶液を添加し、超音波分散機により十分
に分散させた。この分散液をエタノールの揮散を防ぐ程
度の密閉が可能な反応器に仕込み、室温で十分撹拌しな
がら、１.0ｗｔ％のアンモニア水溶液２０ｇを３０分か
けて添加し、さらに５時間撹拌を継続してアミノプロピ
ルトリエトキシシランの加水分解及び縮合反応を完結さ
せた。そして、磁石により磁性粒子と上澄みを分離し上
澄みを除去した。そこへ蒸留水１００ｇを添加してよく
撹拌し、磁気分離・上澄み除去を行い、さらに蒸留水添
加撹拌、磁気分離・上澄み除去を２回繰り返した後、蒸
留水を入れて表面カチオン性基を有するウィルス濃縮用
無機粒子を得た。実施例３（１）実施例１で得られたウィルス濃縮用粒子を生理食
塩水で固形分濃度５重量％に調整した。（２）ＨＢＶ陽性血１００μＬおよびＨＢＶ陰性血４．
９ｍＬを混合し、合計量５ｍＬの試料Ａを調整した。（３）上記試料Ａに上記（１）で調整した粒子懸濁液
（５重量％）100μＬを加え、室温で１０分間回転撹拌
を行った。反応終了後、磁気分離スタンドにセット
し、粒子と上清を分離し、上清を捨て、Tris-HCl緩衝液
(pH７．４)を加えた後、DNA Extractor Kit（和光純
薬工業株式会社製）を用い核酸を抽出した。得られた抽
出物（核酸）を試料Ｂという。得られた抽出物をNested
-PCR法により３５回の1st-PCR、２５回の2nd-PCRの増幅
過程によりＤＮＡを増幅した。PCRのプライマー配列
は、Hiroaki Okamoto , Igakuno ayumi, (1992),1
62(9),544-549に従った。得られた1st-PCR、2nd-PCRそ
れぞれの増幅産物を３％アガロースを用いて電気泳動を
行い、エチジウムプロマイド染色によりＤＮＡを可視化
しポラロイド（登録商標）写真に撮影した。得られた目
的ＤＮＡの量をバンドの蛍光強度から、−、＋、＋＋、
＋＋＋の４段階で判定した。上記（１）〜（３）のプロ
セスを実施例２に対しても行い、それぞれ、実施例２か
らDNA Extractor Kitを用いて抽出した試料Ｃを得た。
また、上記（２）で混合したものと同様のＨＢＶ陽性
血１００μＬ（試料Ｄ）およびＨＢＶ陰性血１００μＬ
（試料Ｅ）から上記ＤＮＡ Extractor Kitにより核酸
を抽出し、同様にＰＣＲ反応を行い、電気泳動により判
定した。結果を表１に示す。

【００３４】

【表１】以上のように、カチオン基を有する粒子は、ウィルス濃
縮効果を発揮していることがわかる。

【００３５】

【発明の効果】本発明のウイルス濃縮用粒子を用いるこ
とにより、簡便な手段により、同時に多数の検体を簡便
に濃縮処理することのでき、しかも得られた濃縮ウイル
スを含む試料は核酸増幅の処理に悪影響を及ぼさない。
この粒子を利用するウイルス濃縮方法は、極く微量のウ
イルスを含む検体からウイルスを効率良く短時間で濃縮
することができ、またウイルス検出方法はより高精度で
ウイルスを検出することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 7/02 (Ｃ１２Ｎ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:92）Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】粒子表面にカチオン性基またはその塩を
有する無機粒子からなるウイルス濃縮用粒子。
【請求項２】無機粒子の主成分がシリカであることを
特徴とする請求項１記載のウイルス濃縮用粒子。
【請求項３】無機粒子が磁性体を含むことを特徴とす
る請求項１記載のウィルス濃縮用粒子。
【請求項４】ウイルスを含有する可能性のある試料に
請求項１記載のウィルス濃縮用粒子を添加し、ウイルス
を前記粒子に結合させる段階、次にこうしてウイルスが
結合した前記粒子を試料から分離、収集する段階を含
む、ウイルス濃縮方法。
【請求項５】ウイルスを含有する可能性のある試料に
請求項１記載のウィルス濃縮用粒子を添加し、ウイルス
を前記粒子に結合させる段階、次にこうしてウイルスが
結合した前記粒子を試料から分離、収集することにより
ウイルスを濃縮する段階、こうして濃縮されたウイルス
を核酸増幅検査に供する段階を含む、ウイルス検出方
法。
【請求項６】ウィルスを含有する可能性のある試料に
請求項１記載のウィルス濃縮用粒子を添加し、ウィルス
を前記粒子に結合させる工程ならびに前記試料から前記
粒子を分離し、前記粒子に吸着したウィルスまたはウィ
ルスの外皮蛋白を免疫学的検査に供する工程を含むこと
を特徴とするウィルスまたはウィルス外皮蛋白の検出方
法。