KR101160125B1 - 개선된 박테리아의 농축 및 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 박테리아 시료의 농축 및 검출방법에 관한 것으로, 저농도에서 고농도에 걸친 넓은 농도 범위의 박테리아 시료에 대하여 간편하면서 효과적으로 농축을 수행할 수 있고, 더 나아가 상기 농축 방법을 활용하여 박테리아의 농축-증폭-검출을 하나의 단일 챔버 내에서 구현할 수 있다.

Description

개선된 박테리아의 농축 및 진단 방법{Improved Method for Concentrating and Assaying Bacteria}
본 발명은 박테리아의 농축 및 검출방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 저농도에서 고농도에 걸친 넓은 농도 범위의 시료 내 박테리아를 간편하면서 효과적으로 농축하는 방법, 그리고 더 나아가 상기 농축 방법을 이용하여 시료 내 타겟 박테리아의 농축-증폭-검출을 하나의 단일 챔버 내에서 구현할 수 있는 진단 방법에 관한 것이다.
인류의 편의를 위한 기술이 발전함에 따라 현대 사회에서는 많은 환경오염의 문제가 야기되고 있다. 대표적인 예로서, 수질 오염을 들 수 있는 바, 특히 음식물 쓰레기, 축사 등으로부터 발생한 감염성 박테리아로 인한 인체 유해성을 들 수 있다. 특히, Escherichia coli O157:H7(E.coli O157:H7) 및 Bacillus cereus(B. cereus)는 식품 유래 박테리아로서, 유아설사증, 출혈성 대장염 등을 일으키는 것으로 보고되고 있다. E. coli O157:H7은 식품 오염을 야기하는 가장 흔한 혈정 중 하나로서 주로 고기류로부터 유래하는 한편, 토양으로부터 유래하는 B. cereus 역시 식품 오염의 주된 원인 중 하나로 알려져 있다.
따라서, 감염성 박테리아를 진단(검출)하는 작업은 식물, 동물, 그리고 인체에 대한 2차적 감염을 예방하는데 필수적이라 할 수 있다.
최근, 새로운 바이오 분석 플랫폼을 기반으로 하여 박테리아 검출 기술이 비약적으로 발전하고 있다. 이와 관련하여, E. coli O157:H7 및 B. cereus와 같은 병원성 박테리아를 검출하기 위하여 시료를 세포 용해(cell lysis)시켜 방출되는 핵산 또는 단백질을 이용한 방법이 알려져 있다.
상기 방식의 예로서, 타겟 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 프로브를 이용하는 방법이 알려져 있는 바, 구체적으로는 단백질을 이용한 항원(antigen)-항체(antibody) 반응을 유도하여 검출하는 기술로서 특이적인 항체를 이용하여 조직 또는 유체 내 박테리아로부터 유도된 특정 항원을 검출하는 방식이다(예를 들면, EP 0 318 734호 등).
다른 방법으로서, PCR(polymerase chain reaction; 중합효소 연쇄반응)법 또는 NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)법을 이용하여 박테리아 내의 특이적 타겟 핵산(DNA, rRNA, mRNA 등)을 증폭하는 기술이 알려져 있다. 이러한 방식은 100 c.f.u./mL 수준의 저농도 핵산 시료에 대하여도 높은 정확성으로 검출/진단할 수 있다. 항체 기반 바이오센서와 달리, 이러한 핵산 기반 방식은 프라이머 셋의 특이적 혼성화를 이용함으로써 박테리아 검출 감도가 상대적으로 높은 것으로 보고되고 있다.
이외에도 전기화학적 방법을 이용하거나 양자점과 같은 나노 입자를 이용한 형광법(예를 들면, 미국특허공개번호 제2007/0166743호, 국내특허번호 제704011호 등 다수의 선행 문헌에 개시되어 있는 형광공명전이현상을 이용한 기술 등)을 이용하여 검출 강도를 향상시키는 기술 역시 알려져 있다.
그러나, 고감도 검출 기술이 발전하고 있음에도 불구하고, 시료 내 병원성 박테리아를 검출하기 위해서는 타겟(셀 또는 핵산)의 농축/정제 과정이 요구된다. 특히, 저농도의 병원성 박테리아 셀을 함유하는 대용량의 환경 시료의 경우, 정확한 검출을 위해서는 샘플의 농축 과정이 필수적이라 할 수 있다.
핵산 기반 기술의 경우, 통상적으로 세포용해(cell lysis)-핵산 정제/농축-시료 증폭-시료 측정의 순으로 구성되는데, 이에 대한 다양한 시료 제조 방법이 개발된 바 있다. 이와 관련하여, 대표적으로 카오트로픽 염(chaotropic salt)을 이용한 붐 테크놀로지(Boom technology; 예를 들면, 미국특허번호 제5,234,809호)가 상용화되고 있다. 상기 방식은 정전기적 인력을 통하여 실리카 표면에 핵산을 흡착시키는 방식이나, 사용된 카오트로픽 염이 생물 반응의 저해물질로 작용하여 별도의 번거로운 세척공정을 거쳐야 하는 단점을 갖고 있다. 이외에도, pH 조절에 의한 CST(charge switch technology), 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 이용한 SPRI(solid phase reversible immobilization) 기술도 알려져 있다.
그러나, 전술한 핵산 고정 방식의 경우, 핵산 농축에 앞서 대용량의 시료 내 세포로부터 핵산을 추출하기 위해서는 대용량 시료에 대한 세포 용해(cell lysis) 과정이 수행되어야 하기 때문에 많은 에너지 또는 화학물질의 소비가 요구된다. 더 나아가, 이러한 접근 방식은 노동 집약적일 뿐만 아니라, 많은 시간을 요하는 단점을 갖는다.
이와 같은 문제점을 완화하고자, 최근에는 세포 또는 박테리아 자체에 대한 농축/정제 후에 검출/진단을 수행하는 방식에 대한 관심이 높아지고 있다. 특히, 저농도 박테리아 시료의 경우, 농축에 앞서 수행되는 세포 용해를 통한 핵산 추출 과정에서 비효율적 요소가 야기되므로, 박테리아 자체를 농축한 후에 핵산을 추출하는 것이 바람직할 수 있다.
고체 표면 상에 박테리아를 흡착시키기 위하여, 예를 들면 이온 효과, 표면 친수성(소수성) 및 전하 효과(예를 들면, 국내특허번호 제647335호 등), PEG와 같은 화학물질 등에 대한 다양한 연구가 수행된 바 있다. 그러나, 여전히 고체 표면 상에 다양한 특성의 박테리아를 효과적으로 고정(흡착)시키는 것은 용이한 작업이 아니며, 종래의 박테리아 고정 기술에 대한 지속적인 개선 방안이 요구되고 있다.
실제, 고농도의 박테리아 시료의 경우, 고체 표면을 친수화함으로써 비교적 용이하게 고정/농축할 수 있으나, 저농도에서는 박테리아 세포와 고체 표면 또는 세포와 세포 간에 존재하는 다수의 상호 작용에 의하여 상이한 거동을 나타낸다는 점이 발견되었는 바, 고농도뿐만 아니라 저농도 박테리아 시료에 대하여도 효과적으로 적용 가능한 농축 방법이 요구되고 있다.
한편, 기존에 연구되어 왔던 대부분의 기술은 마이크로 펌프 및 밸브와 같은 복잡한 마이크로 유체 부재(micro fluidic element)를 필요로 하고, 각 단계마다 별도의 공간 또는 챔버로 해당 시료를 옮기는 등의 번거로운 작업을 요구하고 있다.
이처럼, 시료(특히, 환경 샘플과 같은 대용량의 저농도 박테리아 시료) 내 박테리아를 간편하고 신속하게 고정(흡착)할 수 있는 농축 방법, 그리고 더 나아가 후속 증폭 및 검출 공정에 악영향을 미치지 않고, 궁극적으로 박테리아의 농축, 세포 용해, 증폭(핵산 증폭) 및 검출이라는 일련의 프로세스를 단일 공간 또는 챔버 내에서 고효율로 수행할 수 있는 방법 역시 요구된다.
따라서, 본 발명은 고농도 및 저농도를 포괄하는 넓은 농도 범위 박테리아 시료를 효과적으로 농축할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 더 나아가 단일 공간 또는 챔버 내에서 박테리아의 농축, 증폭 및 검출 작업을 모두 수행할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 제1 구체예에 따르면,
수접촉각이 50° 이하인 친수성 고체 표면에 박테리아-함유 시료를 접촉하는 단계를 포함하는 시료 내 박테리아의 농축 방법으로서,
(i) 타겟 박테리아가 그람 음성 박테리아인 경우, 상기 시료는 적어도 1종의 2가 양이온을 함유하고 pH가 5 이하인 수계(aqueous) 시료이고; 그리고
(ii) 타겟 박테리아가 그람 양성 박테리아인 경우, 상기 시료는 적어도 1종의 코스모트로픽 음이온을 함유하고 pH가 5 이하인 수계 시료인 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제2 구체예에 따르면,
a) 수접촉각이 50° 이하이고, 표면 전하가 (+)가 아닌 친수성 고체 표면에 박테리아-함유 시료를 접촉시켜 농축하는 단계;
b) 상기 농축된 박테리아를 세포 용해시키는 단계; 및
c) 상기 세포 용해물에 증폭 용액을 첨가하여 증폭 반응을 수행하는 단계;
를 포함하는 박테리아의 진단 방법으로서,
(i) 타겟 박테리아가 그람 음성 박테리아인 경우, 상기 시료는 2가 양이온을 함유하고 pH가 5 이하인 수계 시료이고; 그리고
(ii) 타겟 박테리아가 그람 양성 박테리아인 경우, 상기 시료는 적어도 1종의 코스모트로픽 음이온을 함유하고 pH가 5 이하인 수계 시료인 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제3 구체예에 따르면,
시료 내 박테리아의 농축 키트로서,
상측 단부에 유입구 및 하측 단부에 배출구를 구비한 단일 튜브 타입 챔버, 및 상기 챔버에 충진되어 상기 박테리아 고정을 위한 고체 표면을 제공하는 구조물을 포함하는 바이오 칩;
Ca2+ 및 Mg2+로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 2가 양이온을 함유하고, pH가 5 이하인 완충용액을 포함하는 그람 음성 박테리아 농축용 용액; 및
적어도 1종의 코스모트로픽 음이온을 함유하고 pH가 5 이하인 완충용액을 포함하는 그람 양성 박테리아 농축용 용액;
을 포함하며,
상기 고체 표면은 수접촉각이 50° 이하인 것을 특징으로 하는 키트가 제공된다.
본 발명에 따른 박테리아의 농축 방법은 고농도뿐만 아니라 저농도로 존재하는 시료 내 타겟 박테리아를 고체 표면 상에 간편하고 효과적으로 농축할 수 있다. 더 나아가, 상기 농축 방법을 이용하여 단일 공간 또는 챔버 내에서 농축된 박테리아에 대한 후속 증폭(핵산 증폭) 및 검출 과정을 인시튜(in-situ)로 수행함으로써 각 단계마다 시료를 별도의 챔버로 이송하는 등의 불편함을 제거할 수 있으며, 특히 대용량의 저농도 시료의 세포 용해 과정을 상대적으로 저용량의 농축된 박테리아의 세포 용해 과정으로 대체함으로써 시간 및 에너지 효율을 개선할 수 있는 장점을 갖는다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 있어서 바람직하게 사용 가능한 바이오 칩의 구조를 개략적으로 도시하는 사시도이고;
도 2a 내지 2c는 각각 본 발명의 일 구체예에 있어서 바람직하게 사용 가능한 바이오 칩의 예시적인 외관을 도시하는 사시도, 정 단면도 및 측 단면도이고;
도 3(a)는 본 발명의 실시예에서 사용된 바이오 칩의 외관 및 이에 충진된 비드(니켈 비드)의 치수를 보여주는 사진이고;
도 3(b)는 본 발명의 일 실시예에 따라 박테리아가 고체 표면 상에 흡착되는 상태를 순차적으로 보여주는 사진으로서, 시계방향으로 각각 비드(니켈 비드), 확대된 비드 표면, 비드-TEOS 표면, 및 비드-TEOS 표면-박테리아 흡착 상태를 나타내고;
도 4(a)는 본 발명의 실시예에 있어서 비드 표면 상에 처리된 물질에 따른 수접촉각 및 E. coli O157:H7 흡착율을 나타내는 그래프이고;
도 4(b)는 본 발명의 실시예에 있어서 비드 표면 상에 처리된 물질에 따른 수접촉각 및 Bacillus 흡착율을 나타내는 그래프이고;
도 5는 각각 본 발명의 실시예(농도: 105 c.f.u/㎖)에 있어서 비드 개수에 따른 E. coli O157:H7 흡착율(a), 비드 개수에 따른 증폭 산물의 전기영동 패턴(b) 및 로딩 유속에 따른 E. coli O157:H7 흡착율을 나타내는 그래프(c)이고;
도 6은 본 발명의 실시예에 있어서 E. coli O157:H7 및 B. cereus 각각의 농도에 따른 박테리아 흡착율을 나타내는 그래프이고;
도 7은 저농도 시료(102 c.f.u/mL)를 사용한 경우에 있어서 표면 전하에 의한 영향을 확인하기 위하여 표면 처리시 APTS의 농도에 따른 박테리아 흡착율을 나타내는 그래프이고;
도 8은 비드(500 개) 표면 처리에 사용된 물질에 따른 실시간 PCR 증폭 산물의 형광 광도를 나타내는 그래프이고;
도 9는 본 발명의 실시예에 있어서 PEG 농도(0% 및 1%(w/v))에 따라, MgCl2를 함유하는 그람 음성 박테리아(E. coli O157:H7) 시료 내 MgCl2 농도 별 박테리아 흡착율; 그리고 NaSO4를 함유하는 그람 양성 박테리아(B. cereus) 시료 내 NaSO4 농도 별 박테리아 흡착율을 나타내는 그래프이고;
도 10은 본 발명의 실시예에 있어서 다양한 시료 내 조성(PEG 및 Mg 변화)에 따른 TEOS로 개질된 니켈 마이크로비드 상에서의 저농도 시료 내 박테리아(E. coli O157:H7 및 B. cereus)의 흡착율을 나타내는 그래프이고; 그리고
도 11은 저농도 박테리아 시료(E. coli O157:H7, 농도: 101 c.f.u./㎖)를 사용하여, 본 발명에 따른 농축 단계 없이 수득한 NASBA 증폭 산물에 대한 전기영동 그래프("before"로 표시함) 및 본 발명에 따른 농축 단계를 거쳐 수득한 NASBA 증폭 산물에 대한 전기 영동 그래프("after"로 표시함)이다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "코스모트로픽 염"은 Hofmeister 시리즈에 따라 단백질 결정화를 유도하고 소수성 입자에 대한 염석(salting-out) 이온으로서 작용하며, 전형적으로는 물 구조를 형성하는 역할을 하는 물질(water structure maker)이다.
Hofmeister 시리즈에 있어서, 음이온의 경우, 전형적으로는 SO4 2 -<HPO4 2 -<OH-<F-<HCOO-<CH3COO-<Cl-<Br-<NO3 -<I<SCN-<ClO4 - 순으로 정하여지는데, 왼쪽으로 갈수록 표면장력이 증가하고, 단백질의 용해도가 낮아져 염석(응집)이 증가하며, 그리고 단백질에 대한 안정성이 증가하게 된다. 반면, 오른쪽으로 갈수록 이와는 반대 특성을 나타낸다. 이때, Cl-의 왼쪽에 위치하는 음이온을 통상적으로 "코스모트로픽 음이온"으로 지칭한다(Zhang et al ., Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10:658-663). 또한, 상기 코스모트로픽 음이온과 양이온으로 이루어진 염을 "코스모트로픽 염"으로 정의할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 박테리아의 농축 방법에 있어서, 박테리아는 친수성 고체 표면에 흡착되는데, 이때 주목할 점은 박테리아가 응집 또는 군집된 상태(aggregation) 또는 클러스터링된 상태(clustering)로 흡착된다는 것이다. 특히, 단일 개체보다는 박테리아 간의 응집물이 친수성 표면에 더욱 상호작용하는 것으로 판단된다. 이러한 현상에 대한 근거는 명확하지는 않지만 박테리아가 친수성 표면에 흡착되기에 앞서 산성 조건 하에서 응집되거나, 또는 박테리아는 친수성 표면에 예상치 않게 흡착된 다른 박테리아에만 흡착할 수 있다는 원리로 설명될 수 있다.
고체 표면의 친수성이 증가할수록 보다 많은 박테리아가 흡착하게 되는데, 세포와 고체 표면의 소수성(hydrophobicity)이 부착 프로세스 중 초기의 비특이적(non-specific) 상호작용을 지배하는 주요 파라미터로 작용하는 것으로 판단된다. 따라서, 1차적으로는 박테리아 세포와 고체 표면 간의 상호 작용에 관계되는 힘을 증가시킬 필요가 있는데, 이는 고농도의 박테리아 시료에 대한 실험에 의하여 뒷받침된다. 그러나, 저농도 박테리아 시료의 경우, 고농도 시료에서의 흡착 거동과는 구별되는 바, 특히 단순히 고체 표면의 친수성을 증가시키는 것만으로는 박테리아를 효과적으로 흡착할 수 없다는 점을 들 수 있다.
전술한 현상을 감안할 때, 본 발명이 반드시 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만 하기의 원리에 따라 설명될 수 있다.
박테리아는 외막(bacterial envelope)은 구조에 따라 그람(Gram) 염색반응이 구별되는 바, 그람 음성 박테리아(얇은 뮤레인(murein) 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 외막의 지질 이중층을 가짐)와 그람 양성 박테리아(두꺼운 뮤레인 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 이로써 Crystal violet을 보유함)로 구분된다.
그람 음성 박테리아의 세포막은 포스포리피드(phospholipid)와 기타 글리코프로테인(glycoprotein)으로 이루어져 있으며, 포스포리피드의 대부분은 (-)의 하전을 띄고 있다(net negative charge). 그 종류로는 살모넬라균, 수막염균, 스피로헤타 콜레라균, 페스트균, 티푸스균, 이질균, 대장균, 임균 등이 있다.
반면, 그람 양성 박테리아의 경우, 세포벽은 주로 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 타이코산(teichoic acid)으로 구성되는 바, 그 표면은 거의 중성에 가까운 하전 특성을 갖고 있으며, 포도상구균, 연쇄상구균, 탄저균, 디프테리아균, 파상풍균, 폐렴균 등을 들 수 있다.
일반적으로, 박테리아와 고체 표면 간의 상호 작용에는 전하에 의한 상호작용(정전기적 결합), 수소 결합 및 소수성 결합(hydrophobic interaction)이 관여된다. 한편, 박테리아 세포 간의 상호 작용에 있어서도 이러한 3가지 힘이 작용한다.
고체 표면의 친수성이 높은 경우에는 소수성 상호작용이 우세하게 되어 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 모두 비교적 용이하게 친수성 고체 표면에 흡착 고정될 수 있다. 특히, 고농도 시료에서는 박테리아의 표면 전하에 관계없이 소수성 결합에 의하여 서로 용이하게 응집될 수 있다.
그러나, 저농도 시료에 있어서는 박테리아 세포 간의 거리가 크기 때문에 수소 결합 및 소수성 상호작용이 감소하게 된다. 따라서, 저농도 시료에서는 고체 표면과 박테리아 간의 상호 작용뿐만 아니라, 박테리아 세포와 세포 간의 상호 작용과 관계되는 힘을 증가시킬 필요가 있다.
본 발명의 구체예에 따르면, 시료 내 박테리아는 친수성 고체 표면 상에 고정(흡착)되는 바, 이때 "친수성"의 정도는 수접촉각으로 정량화할 수 있다. 즉, "수접촉각"은 액체(물)가 고체 표면 상에서 열역학적으로 평형을 이루는 경우에 고체 표면과 액체 표면이 형성하는 각으로 정의할 수 있다. 고체 표면의 특성에 따라 접촉각이 변화하며, 측정된 접촉각으로부터 친수성의 정도를 확인할 수 있다. 예를 들면, 고체 표면의 친수성이 증가할수록 고-액 계면 에너지가 작아 수접촉각이 감소하게 된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 고체 표면의 수접촉각은 약 50° 이하, 보다 바람직하게는 약 30° 미만일 수 있다. 수접촉각이 증가할수록 친수성이 낮아지므로 소수성 상호작용에 의한 박테리아의 흡착 메커니즘은 감소하게 된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 고체 표면은 단일 챔버 내에 충진된 구조물일 수 있는데, 예를 들면 구, 타원, 디스크 또는 다각 형상을 갖는 복수의 비드, 또는 단일체 와이어(예를 들면, 나선형 구조)일 수 있으나, 본 발명이 특정 형상의 충진 구조물로 한정되는 것은 아니다. 상기 단일 챔버의 경우, 바람직하게는 상측 단부에 유입구, 그리고 하측 단부에 배출구를 구비한 단일 튜브 타입의 챔버를 사용할 수 있으며, 특히 바람직하게는 코니컬 형상의 단일 튜브 타입의 챔버일 수 있다.
또한, 상기 고체 표면의 재질은 글래스, 실리콘 웨이퍼, 실리카, 금속 등일 수 있는 바, 고체 표면 재질의 선정 시 농축 이후의 프로세스를 고려하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 니켈 재질을 선정하는 경우, 추후 농축된 박테리아를 세포 용해하는 과정에서 인덕션(induction) 가열 방식을 용이하게 적용할 수 있다.
만약, 고체 표면이 친수성을 나타내지 않는 경우(즉, 수접촉각이 50°를 초과하는 경우), 또는 친수성 고체 표면에 보다 높은 친수성을 부여하고자 하는 경우, 선택적으로 고체표면에 친수화 처리를 수행함으로써 수접촉각을 낮출 수 있다. 이러한 친수화 처리 물질로서 TEOS(테트라에톡시 실란)를 비롯하여 APTS(3-아미노프로필트리에톡시 실란), HMTS(하이드록시메틸트리메톡시 실란), CETES(카르복시메틸티오에틸트리메틸 실란) 등과 같은 아민기, 히드록시기 또는 카르복실기를 갖는 실란계열 화합물을 사용할 수 있다. 바람직하게는 TEOS를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 상술한 박테리아의 농축(및/또는 증폭) 단계는 약 10 ㎖/min 정도의 높은 로딩 유속(loading flow rate)에서도 적용 가능한 바, 이때 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 10 ㎖/min, 특히 바람직하게는 약 0.1 내지 2 ㎖/min의 로딩 유속으로 조절할 수 있다. 따라서, 대용량의 시료 농축에 유리할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 고체 표면의 표면적(예를 들면, 충진된 구조물의 전체 표면적)이 증가할수록 농축에 유리할 수는 있으나, 후속 단계, 예를 들면 핵산 증폭 과정 등을 고려하면 바람직하게는 약 10 내지 150 ㎟, 보다 바람직하게는 약 50 내지 100㎟ 범위일 수 있다. 상기 수치 범위는 예시적 목적으로 제시되는 것으로서, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 농축하고자 하는 박테리아-함유 시료는 수계(aqueous) 시료로서, 예를 들면 완충 용액을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 완충 용액의 종류가 반드시 특정 종류로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 인산나트륨 완충용액, 트리스-아세테이트(Tris-acetate) 완충용액 등을 사용할 수 있다. 특히, 당업계에서 시판 중인 인산나트륨(포스페이트) 표준 완충용액(pH 4)을 사용할 수 있다. 이때, 완충용액 내 버퍼 성분의 농도는 약 50 내지 100 mM 정도이면 무난하다. 완충 용액을 사용할 경우, 프로세스 전반에 걸쳐 pH를 일정하게 유지할 수 있다는 점에서 바람직하기는 하나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체예에 따르면, 타겟 박테리아의 특성에 따라 하기와 같이 구분하여 시료를 제조할 수 있다.
- 타겟 박테리아가 그람 음성 박테리아인 경우, 시료 내에 적어도 1종의 2가 양이온을 포함한다. 이와 같이 2가 양이온을 첨가할 경우, 상기 2가 양이온이 (-) 하전된 표면을 갖는 그람 음성 박테리아와 응집하여, 결과적으로 박테리아 세포 간의 효과적인 응집을 유도할 수 있는 것으로 판단된다.
상기 2가 양이온으로서, 바람직하게는 Ca2+ 및 Mg2+, 보다 바람직하게는 Mg2+을 들 수 있다. Mg2+가 바람직한 이유는 효소, 프라이머 등의 바이오물질에 미치는 영향이 적기 때문에 후속 프로세스인 증폭 단계(특히, NASBA) 등에 유리하기 때문이다.
또한, 상기 2가 양이온의 소스(source)는 반드시 특정 형태로 한정되는 것은 아니지만, 염(salt) 형태로 시료 내에 도입하는 것이 바람직하다. 이러한 2가 양이온 염으로서 CaCl2, CaCO3, MgCl2, MgSO4 등이 예시될 수 있는 바, 이때 코스모트로픽 염의 형태는 가급적 배제하는 것이 바람직하다.
이와 관련하여, MgSO4의 경우, SO4 2-으로 인하여 Mg2+가 박테리아와의 정전기적 인력을 중화하기 때문에 상대적으로 박테리아의 흡착에 미치는 영향이 감소할 수 있다. 더욱이, 후술하는 바와 같이 폴리에틸렌글리콜을 첨가할 경우, 코스모트로픽염이 고체 표면과 박테리아 세포 사이의 상호작용보다는 친수성 표면과 폴리에틸렌글리콜 사이의 상호 작용에 보다 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 흡착율을 낮출 수 있다. 상기의 점을 고려할 때, 코스모트로픽염이 아닌 MgCl2 및/또는 CaCl2을 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 상기 2가 양이온의 농도는 바람직하게는 약 1 M 이하, 보다 바람직하게는 약 10 내지 100 mM일 수 있다. 만약, 2가 양이온이 과량으로 사용될 경우, 박테리아 이외의 다른 부속 물질의 응집 또는 흡착 현상이 야기될 수 있기 때문에 후속 프로세스(증폭 반응 등)에 불리한 영향을 미칠 수도 있다. 따라서, 전술한 범위 내에서 적정량을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 박테리아-함유 시료의 pH는 약 5 이하, 바람직하게는 약 3 내지 5의 범위로 조절하는 것이 바람직하다. 특히, 친수성 고체 표면, 특히 TEOS로 개질되거나, 실리콘 웨이퍼(silicon wafer), 글래스(glass) 재질 등으로 이루어진 고체 표면은 실란올기(Si-OH)를 갖는데, 이와 같이 표면에 존재하는 히드록시기(OH-)는 수소이온농도가 높아짐에 따라(즉, 산성 조건 하에서) 수소 이온과 OH-가 결합하여 (-) 하전이 감소함으로써 소수성 상호작용에 의한 흡착 메커니즘이 더욱 두드러질 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 그람 음성 박테리아 함유 시료는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 더 포함할 수 있다. 이러한 폴리에틸렌글리콜 성분이 갖는 친수성 물질에 대한 친화성(dipole)으로 인하여 세포에 흡착되어 박테리아 세포 간 응집을 더욱 촉진할 수 있는 것으로 판단된다. 상기 폴리에틸렌글리콜의 평균분자량(특히, Mw)은 약 10,000 이하, 바람직하게는 약 2,000 내지 10,000, 보다 바람직하게는 약 4,000 내지 10,000 범위일 수 있다. 이때, 폴리에틸렌글리콜의 농도는 바람직하게는 약 0.1 내지 15%(w/v), 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 10%(w/v) 범위일 수 있다.
한편, 저농도 조건 하에서 박테리아 농축 곤란성을 더 완화시키기 위하여, 그람 음성 박테리아 시료에 대하여는 하기와 같은 방안을 추가적으로 고려할 수 있다. 즉, 타겟 박테리아가 (-) 하전된 표면을 갖는 그람 음성 박테리아인 경우, 친수성 고체 표면이 (+) 하전을 갖도록 개질함으로써 정전기적 상호작용 및 수소결합(특히, 정전기적 상호작용)에 의한 농축 메커니즘을 강화할 수 있다. 이를 위하여, APTS(3-아미노프로필트리에톡시 실란)으로 고체 표면을 처리할 경우, 표면에 NH4 +가 존재하기 때문에 고체 표면을 (+)로 하전시킬 수 있다. 상기의 경우, TEOS(테트라에톡시실란)으로 처리한 경우에 비하여 친수성은 저하되므로(여전히, 친수성은 보유하고 있음), 고농도 조건 하에서는 박테리아 흡착율이 감소한다. 그러나, 저농도 조건 하에서는 정전기적 상호작용에 따른 흡착 메커니즘이 더 우세하여 그람 음성 박테리아의 농축에 유리할 수 있다.
이와 같이 정전기적 상호작용을 강화하여 박테리아(즉, 그람 음성 박테리아)를 고체 표면에 흡착하는 방식은 다시 용액 속으로 박테리아를 방출하는 가역적 분리가 곤란할 수 있기 때문에 이후의 프로세스(예를 들면, 증폭, 검출 등)에 응용하는데 곤란할 수 있다. 그러나, 정전기적 상호작용에 의하여 농축된 박테리아를 별도의 수단을 통하여 분리하고, 이를 후속 프로세스에서 활용할 수도 있음을 감안하면, 본 발명에서 반드시 친수성 고체 표면이 (+) 하전을 나타내도록 하는 경우를 배제할 필요는 없을 것이다. 다만, 후술하는 바와 같이, 단일 공간 또는 챔버 내에서 시료의 농축-증폭-검출 프로세스 모두를 수행하고자 하는 경우에는 적합하지 않을 수 있기 때문에, 상기 경우에는 가급적 친수성 고체 표면이 (+) 하전을 갖지 않도록 하는 것이 바람직하다.
- 타겟 박테리아가 그람 양성 박테리아인 경우, 시료는 적어도 1종의 코스모트로픽 음이온을 함유한다. 이때, 코스모트로픽 음이온은 전술한 바와 같이, Hofmeister 시리즈에서 Cl- 왼쪽에 위치하는 음이온을 의미하는데, SO4 2-, HPO4 2-, OH-, F-, HCOO-, CH3COO- 등을 예시할 수 있다. 이와 같이, 코스모트로픽 음이온을 사용할 경우, 그람 양성 박테리아 표면에 단백질 성분을 함유하는 펩티도글리칸이 다수 존재하기 때문에 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있는 코스모트로픽 음이온에 민감하게 반응하여 흡착이 증가되는 것으로 추측할 수 있다. 더 나아가, 코스모트로픽 음이온으로 인하여 친수성 계면이 증가할 수 있고, 박테리아 세포와 고체 표면(기재)의 표면 특성 모두에 영향을 미치는 작용을 하는 것으로 판단된다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 코스모트로픽 음이온 중 2가 음이온(예를 들면, SO4 2 - 및 HPO4 2 -)을 사용하는 것이 바람직한 바, 특히 SO4 2 -를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 코스모트로픽 음이온의 소스(source)는 반드시 특정 형태로 한정되는 것은 아니지만, 염(salt) 형태로 시료 내에 도입하는 것이 바람직하다. 이러한 염으로서 (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4, Na2CO3 등이 예시될 수 있는 바, 다만 MgSO4의 경우, Mg2+가 SO4 2-에 의한 흡착능을 일정 수준까지 감소시킬 가능성이 있다. 이와 관련하여, Na2SO4를 사용하는 것이 특히 바람직할 수 있다.
한편, 코스모트로픽 음이온이 과량으로 사용될 경우, 세척과정 없이는 증폭 반응용 효소를 응집시켜 증폭 과정 중 문제점을 야기할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 코스모트로픽 음이온의 농도는 바람직하게는 약 1 M 이하, 보다 바람직하게는 10 내지 100 mM일 수 있는 바, 상기 수치는 예시적 목적으로 이해되어야 한다.
또한, 그람 양성 박테리아용 시료의 pH는 약 5 이하, 바람직하게는 약 3 내지 4의 범위로 조절하는 것이 바람직한 바, 전형적으로는 그람 음성 박테리아용 시료에 비하여 pH를 다소 낮게 유지하는 것이 보다 바람직할 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면, MgSO4와 같이 2가 양이온 및 코스모트로픽 음이온을 동시에 갖는 염을 사용할 경우, 전술한 바와 같이 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아 각각의 농축 과정에 있어서는 상대적으로 낮은 농축율을 나타낼 수 있다. 그러나, 하나의 용액으로 그람 음성 및 양성 박테리아의 농축에 모두 적용할 수도 있다는 점에서는 편의성도 존재하므로 본 발명의 범위에서 배제할 필요는 없을 것이다.
이처럼, 본 발명의 구체예에 따르면, 고농도 시료는 물론 저농도 박테리아 시료(심지어 30 c.f.u./100mL까지도)에 대하여도 농축이 가능하고, 이를 이용하여 박테리아의 진단(검출)을 수행할 수 있는 바, 이때 적용 가능한 시료 농도의 범위는, 예를 들면 101 내지 107 c.f.u./100mL 단위일 수 있다.
본 발명의 제2 구체예에 따르면, 상술한 방법으로 고체 표면 상에 농축된 박테리아는 후속 증폭 단계에 앞서 핵산 성분을 추출하기 위하여 세포 용해(cell lysis) 과정을 거치게 된다. 이러한 세포 용해 과정은 당업계에서 알려진 다양한 기계적(기계적 마찰이나 분쇄), 화학적(효소 이용), 레이저 방식(레이저빔을 이용한 열적, 화학적 용해), 초음파, 열적 용해, 고전압 이용 방법 등이 특별한 제한 없이 채택 가능하다. 이외에도, 이와 관련하여, 국내특허공개번호 제2010-27698호 등에 개시된 마이크로파에 의한 가열 방식 등도 이용 가능하며, 상기 선행문헌은 본 발명의 참고자료로서 포함된다.
이와 관련하여, 농축된 박테리아를 별도의 단계, 예를 들면, 세척을 통한 박테리아 정제를 통하여 별도로 분리하여 이송한 다음, 세포 용해 단계를 수행할 수도 있다. 다만, 후술하는 바와 같이 인시튜로(in-situ) 단일 챔버 내에서 농축-세포 용해-증폭-검출을 일괄 수행하고자 할 경우, 농축된 박테리아에 대한 별도의 분리 단계를 거치지 않고도 간편하게 세포를 용해할 수 있는 히터를 이용한 직접가열, 또는 인덕션을 이용한 유도가열 방식이 바람직할 수 있다.
상술한 박테리아의 세포 용해 과정 이후에는 당업계에서 알려진 방법에 따라 추출된 핵산(DNA, RNA 등)에 대한 증폭 반응을 수행한다.
상기 방법 중 핵산, 특히 DNA의 경우에는 PCR(polymerase chain reaction)이라는 강력한 증폭기술에 의하여 진단의 감도를 높일 수 있어 널리 이용되고 있다. 일반적으로, PCR법은 체외에서 DNA 유전자 시료를 증폭하는 분자 생물학적인 방법으로서, DNA에 대한 감도를 증가시키기 위하여 DNA 시료의 양 및 농도를 높이는 기술인데, 온도 조절이 매우 중요한 화학반응으로서, 대상 시료를 3가지 온도 프로파일(통상, 각각 53℃, 72℃ 및 92℃)로 반복하여 가열 및 냉각시키는 방법이다. 따라서, 신속한 온도 응답, 정확한 온도 및 균일한 온도 분포를 정밀하게 제어하는 것이 중요하다.
한편, DNA를 이용한 종래의 검출방법의 정확성에 한계가 존재할 수 있기 때문에, RNA, 특히 mRNA를 이용한 증폭 반응 역시 이용될 수 있다. 이와 관련하여, EP 0 329 822 B1은 Nucleic Acid Sequence Based Amplification(NASBA)법 등의 RNA 등온 증폭(isothermal amplification) 방식을 개시하고 있는 바, 상기 증폭 방식은 통상 3가지 효소, 즉 RNase H, AMV 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 T7 RNA 폴리머라제가 사용된다. 또한, 전형적으로 약 41ㅁ0.5℃의 등온 조건 하에서 증폭 반응이 수행된다. NASBA 방식의 세부 원리는 미국특허번호 제6,110,681호 등에 예시되어 있으며, 본 발명의 개시내용에 포함된다.
다만, NASBA법과 같이 RNA를 이용한 방법의 경우, 수질 시료뿐만 아니라 식품에서 살균 후, 감염성 병원체의 생존율 측정에도 사용하고 있을 뿐만 아니라, 병원체의 생존율을 확실하게 검증할 수 있고, 인체 감염 시에도, 박테리아 진단도 가능하므로 DNA를 대상으로 하는 PCR 법보다 유리하다. 특히, 복잡한 온도 컨트롤러를 요하지 않기 때문에, 간단한 장치 구성이 가능하므로 본 발명에서는 NASBA 법이 바람직하게 적용 가능하다.
한편, 상술한 바와 같이 증폭 산물은 당업계에서 알려진 방법에 의하여 검출(detection)될 수 있는데, 예를 들면 겔 전기영동(gel electrophoresis), ELGA(enzyme-linked gel assay), ECL(electrochmiluminescent) 등을 이용할 수 있다. 그러나, 상기 방식은 증폭 반응의 결과를 확인하기 위하여 각 샘플에 대하여 검출 단계를 별도로 수행해야 하는 불편한 점이 있기 때문에 분자 비콘 프로브 또는 TaqMan 프로브 등의 형광을 이용한 검출 방법을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 구체예에 있어서, 분자 비콘 또는 TaqMan 프로브를 이용한 형광 검출 방식이 특히 유리한데, 이는 단일 챔버 내에서 샘플의 농축, 증폭 및 검출을 모두 수행할 수 있기 때문이다.
분자 비콘 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 5’ 말단을 형광체(fluorescent dye)로, 3’ 말단을 소광제(quencher)로 결합시킨 것이다. 올리고뉴클레오타이드 스트랜드는 타겟서열에 상보적인 루프형 프로브 부분과 그 양쪽 끝에 5 내지 6개의 뉴클레오타이드의 자기상보(self-complementary) 영역으로 구성되는데, 타겟이 없을 경우에는 프로브의 상보부분이 인접된 머리핀 형태로 형광체와 소광제가 인접하여 강한 소광 효과를 나타낸다. 반면, 타겟과 반응하면 루프형의 배열이 펴지며 직선으로 되어 형광체와 소광제의 거리가 멀어지게 되어 형광이 관찰된다.
TaqMan 프로브의 경우, 5’말단은 형광체(FAM 등)로, 3’말단은 소광제(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 증폭 용액에 첨가하는 방법으로서, TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서는 주형 핵산에 특이적으로 혼성화되지만 프로브 상의 소광제에 의하여 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→3' 핵산말단분해효소(exonuclease)의 활성으로 주형에 혼성화된 TaqMan 프로브가 분해됨에 따라 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광제에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다. 다만, 검출 특이성 면에서 분자 비콘을 사용하는 것이 보다 바람직할 수 있다.
전술한 프로브는 증폭 용액에 첨가하여 사용하는데, 이와 같이 증폭에 앞서 첨가할 경우에는 프라이머가 핵산과 결합함에 있어서 프로브와 경쟁적 관계를 형성한다. 즉, 프로브와 타겟 핵산의 혼성화에 의하여 비특이적(non-specific) 결합이 증가한다. 따라서, 과량을 사용할 경우에는 증폭 반응의 저해제로 작용할 수 있는 것이다. 반면, 프로브의 량이 일정 수준 미만인 경우에는 증폭된 핵산에 비하여 불충분한 형광 특성으로 인하여 원하는 검출 효과를 기대하기 어렵게 된다. 결국, 증폭 방식을 고려하여 프로브의 사용량, 기타 반응 조건을 실험적으로 적절히 조절하는 것이 바람직하다.
이러한 문제 가능성을 해소하기 위하여, 예를 들면 증폭 반응 시간을 증가시킴으로써 프로브 첨가가 증폭 반응에 미치는 영향을 억제하면서 프로브의 최대 한계 사용량을 증가시킬 수 있다. NASBA 방식을 예로 들면, 형광에 의한 검출 효과를 높이기 위하여, 예를 들면 증폭 용액 내의 프로브(특히, 분자 비콘 프로브)의 농도를 바람직하게는 약 10 내지 200 nM 범위 내에서 선정하고, 바람직하게는 약 90 분 내지 3 시간 범위에서 실험을 통하여 최적 반응 시간을 조절할 수 있다.
한편, 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상술한 농축, 또는 농축-세포용해-증폭-검출 과정은 단일 튜브 타입의 챔버를 구비한 바이오 칩을 사용하여 수행할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 있어서 바람직하게 사용 가능한 바이오 칩의 구조를 개략적으로 도시하는 사시도이다.
상기 도면에 따르면, 바이오 칩(1)은 코니컬(conical) 형상의 관(2)에 복수의 비드(3)가 삽입되어 있다. 이때, 상기 관의 상부에는 박테리아 함유 시료(농축 단계) 또는 증폭 용액(증폭 단계)의 도입을 위한 유입구(4)가 형성되어 있는 한편, 하부에는 농축 또는 증폭 과정에서 바이오 칩을 투과(통과)한 액(즉, 박테리아 함유 시료의 농축 과정에서 비드(3)에 의하여 고정되지 않은 투과액 또는 증폭 산물 함유액)을 배출하기 위한 배출구(5)가 형성되어 있다. 이때, 복수의 비드(3)의 친수성 고체 표면을 제공할 수 있어야 하는 바, 전술한 바와 같이 50ㅀ 이하의 수접촉각을 갖는 재질 또는 상기 수접촉각을 갖도록 표면 처리된 것일 수 있다.
본 명세서에서 "코니컬"이라는 용어는 편의상 상부 단면으로부터 하부 단면 방향으로 갈수록 사이즈가 감소하는 관의 형상을 모두 포함하는 것으로 이해될 수 있는 바, 그 단면은 본 발명의 기술적 특징을 달성할 수 있는 한, 원형 또는 다각형 모두 채택될 수 있다. 다만, 유체 흐름 과정에서 압력 강하를 최소화하면서 비드(3)에 의한 흡착을 최적화하기 위해서는 원형(즉, 순수한 의미의 코니컬 관)이 보다 바람직하다. 따라서, 코니컬 관(2)의 유입구(4)의 단면 사이즈는 배출구(5)의 단면 사이즈에 비하여 크도록 구성된다.
상기 코니컬 관의 재질은 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, PET(polyethylene terephthalate) 등, 추후 형광 측정 시 빛을 투과할 수 있도록 투명성을 나타내면서 농축(흡착) 및 증폭 반응에 영향을 주지 않는 재질을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 유입구(4)의 사이즈는 바람직하게는 약 1.5 내지 2.5 ㎜, 보다 바람직하게는, 약 1.7 내지 2 ㎜, 그리고 배출구(5)의 사이즈는 약 200 내지 1,000 ㎛, 보다 바람직하게는 약 500 내지 700 ㎛일 수 있다. 한편, 상기 코니컬 관(2)의 길이는, 예를 들면 농축 후 증폭 단계에서 삽입(첨가)되는 증폭 용액의 사용량(예를 들면, NASBA 증폭 용액의 경우, 전형적으로 약 2 내지 200 ㎕, 보다 전형적으로는 약 20 ㎕ 수준임)에 대응하는 관 내부 부피로부터 결정될 수 있다.
한편, 상기 비드(3)의 사이즈는 비드가 바이오 칩으로부터 이탈되지 않도록, 배출구(5)의 사이즈를 고려하여 적절하게 정할 수 있는데, 바람직하게는 약 200 내지 500 ㎛, 보다 바람직하게는 약 200 내지 300 ㎛ 범위이다.
또한, 코니컬 관(2)에 삽입되는 비드의 수는 농축 또는 증폭 반응에 적합한 표면적 등에 의하여 결정될 수 있다. 삽입되는 비드의 개수를 증가시킴에 따라(즉, 전체 표면적이 증가함에 따라) 박테리아의 농축율도 증가할 것으로 예상되나, 지나치게 많은 개수의 비드를 사용할 경우에는 과도한 표면적으로 인하여 증폭 반응에 사용되는 효소, 프라이머 등이 흡착되는 현상이 발생되므로 증폭 과정에 문제점을 야기할 수 있는 만큼, 적정한 개수로 조절하는 것이 바람직하다. 특히, 증폭 방식으로 NASBA법을 채택할 경우, 표면적을 약 20 ㎟ 정도로 하여 조절하는 것이 바람직할 수 있다.
상술한 바와 같이, 코니컬 관(2)을 사용할 경우에는 다음과 같은 장점을 얻을 수 있다. 즉, 같은 수의 비드를 삽입하였을 때, 다른 형상의 관에 비하여 압력 강하 현상을 효과적으로 억제할 수 있어(즉, 내부 압력의 발생을 최소화할 수 있어) 대용량의 저농도 시료에 대하여도 효율적인 농축 과정을 수행할 수 있다.
상술한 바이오 칩을 적용함에 있어서, 약 10 ㎖/min 정도의 높은 로딩 유속(loading flow rate)이 가능하다. 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 10 ㎖/min, 특히 바람직하게는 약 0.1 내지 2 ㎖/min의 범위로 조절할 수 있다. 이때, 상기 복수의 비드 전체 표면적은 바람직하게는 약 10 내지 150 ㎟, 보다 바람직하게는 약 50 내지 100㎟ 범위일 수 있으며, 상기 전체 표면적을 고려하여 비드의 개수를 조절할 수 있을 것이다.
상기 도시된 바이오 칩은 유속을 증가시키는데 한계가 있는 종래의 칩에 비하여 유속을 증가시킬 수 있기 때문에 대용량 시료의 농축에 적합하다. 다만, 지나치게 높은 유속에서는 농축에 불리할 수 있기 때문에 전술한 범위로 조절하는 것이 보다 바람직할 것이다.
도 2a 내지 2c는 각각 본 발명의 일 구체예에 있어서 바람직하게 사용 가능한 바이오 칩의 예시적인 외관을 도시하는 사시도, 정 단면도 및 측 단면도이다.
상기 도면에 따르면, 바이오 칩(11)은 크게 아래로부터 코니컬 관(12), 형광 관찰부(16) 및 액상 주입부(17)로 구성되어 있다. 전술한 바와 같이, 상기 코니컬 관에는 비드(13)가 삽입되어 있다. 상기 도면에서 형광 관찰부(16)는 사각형의 단면을 갖는 것으로 일종의 스크린 역할을 하여 후술하는 바와 같이 프로브로부터 유래하는 형광을 보다 용이하게 관찰 또는 측정할 수 있도록 한다. 상기 형광 관찰부(16)의 하부와 코니컬 관(12)의 상부의 연결 부위(14)가 유입구에 상당하고, 코니컬 관(12)의 하부에는 배출구(15)가 형성되어 있다. 원활한 유체이동이 이루어지도록 형광 관찰부(16)와 액상 주입부(17) 사이에 연결부(상측으로 갈수록 사이즈가 커짐)가 형성되어 있다. 상기 액상 주입부(17)는 비교적 큰 단면 사이즈로 구성되어 박테리아 함유 시료 또는 증폭 용액을 쉽게 주입할 수 있을 뿐만 아니라 취급 용이성을 제고할 수 있고, 또한 착탈식 덮개(18)와 연결되어 있어 시료 또는 용액 주입 후에 외부의 오염 물질의 혼입을 방지할 수 있다.
이상에서 설명된 바이오 칩의 구조는 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아님을 주목해야 한다. 따라서, 복수의 비드 대신에 와이어 단일체를 예를 들면 나선형으로 칩 내에 충진 또는 삽입하여 사용할 수도 있으며, 적절한 로딩 유속, 표면적 등을 제공할 수 있는 한, 기타 형상도 가능하다.
본 발명의 제3 구체예에 따르면, 시료 내 박테리아의 농축 키트가 제공된다.
본 구체예에 있어서, "농축용 키트"는 본 발명에 따른 박테리아 농축 방법을 실시하기 위한 시스템으로서, 예를 들면 타겟 박테리아가 그람 음성인지 또는 그람 양성인지에 따라 구별하여 사용할 수 있는 농축용 용액을 구비한다.
또한, 박테리아 농축을 위하여, 전술한 바와 같이, 상측 단부에 유입구 및 하측 단부에 배출구가 형성된 단일 튜브 타입 챔버, 및 상기 챔버에 충진되어 박테리아 고정(흡착)을 위한 친수성 고체 표면(50° 이하의 수접촉각)을 제공하는 구조물(비드, 와이어 등)이 구비된 바이오 칩을 포함한다.
이때, 바람직하게는 그람 음성 박테리아 농축용 용액은 Ca2+ 및 Mg2+로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 2가 양이온, 보다 바람직하게는 Mg2+을 함유하고, pH가 5 이하인 완충용액으로 이루어진다. 한편, 그람 양성 박테리아 농축용 용액은 적어도 1종의 코스모트로픽 음이온, 보다 바람직하게는 SO4 2-을 함유하고 pH가 5 이하인 완충용액으로 이루어진다. 이와 관련하여, 각각의 농축용 용액을 구성하는 성분, 농도 등에 관한 세부사항은 앞서 기술한 바와 같다. 또한, 상기 키트는 후속적으로 당업계에서 알려진 세포용해 수단, 증폭 수단 및 검출 수단을 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예에서 사용된 물질 및 장치는 하기와 같다.
사용물질
- E.coli O157:H7 (ATCC 43895)는 American Type Culture Collection (Washington DC, USA)으로부터 구입하였으며, B.cereus(ATCC 14579)는 고려대학교(한국)로부터 제공받았다.
- 쇠고기 샘플은 본 발명자들의 연구실 근처의 일반 마트에서 구입하였다.
- 테트라에톡시실란(Tetraethoxysilane; TEOS), 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-Aminopropyltrimethoxysilane; APTS), 트리에톡시실릴부티알데하이드 (Triethoxsilylbutyraldehyde;TEB), (트리데카플르오로-1,1,2,2-테트라히드로데실)트리메톡시실란(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trimethoxysilane; TDF) 및 (헵타데카플루오로-1,1,2,2-테트라히드로데실)트리메톡시실란(Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl) trimethoxysilane; HDF)은 Gelest, Inc.(Morrisville, PA, USA)로부터 구입하였다.
- 이외에 본 실시예에서 사용되는 모든 생물학적 화학 물질 및 바이오물질은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
- 니켈 마이크로 비드의 제작
E-빔(CVC Products)을 이용하여 글래스 슬라이드의 상면에 시드 층(seed layer)을 부착시켰다. 상기 시드 층은 구리층 및 티타늄층으로 구성되었다(Cu/Ti; 30 200nm/30nm). 포토리소그래피 프로세스를 이용하여 상기 시드 층 상에 300×300 어레이의 홀(hole; 직경 250㎛, 깊이 100㎛)이 구비된 SU-8 몰드를 형성하였다. 광 마스크 어라이너(aligner)를 사용하여 원형 패턴을 갖는 표준 포토마스크를 상기 시드 층을 구비한 글래스 기판 상의 SU-8과 접촉시켰고, 상기 SU-8을 포토마스크를 통하여 자외선에 노광시켰다. 노출되지 않은 SU-8은 기판을 현상액에 함침시켜 제거하였다. 와트 배합조(Watts formulation bath; Technic, Cranston,. RI)를 사용하여 전기도금(electroplating)을 수행하였다. 카운터 전극(니켈 포일)이 전원(E3611A DC Power Supply, Hewlett-Packard, Houston, TX)에 유사한 방식으로 연결되었다. 그 다음, 상기 쌍을 이루는 전극(paired electrodes)을 교반되는 전기도금 배스(300 rpm)에 담구었다. 그 결과, 구리를 희생층으로 하는 용해를 통하여 구리 층으로부터 분리시킴으로써 유리된 Ni 마이크로 비드를 얻었다.
- 니켈 마이크로 비드의 표면 개질
니켈 마이크로 비드를 상온에서 1시간 동안 TEOS 용액(99.99% 에탄올에 TEOS 0.5%(v/v), NH4OH 0.5% 함유) 내에서 교반시켰다. 에탄올을 사용하여 3회에 걸쳐 세척 처리하였고, 그 다음 1 내지 2 시간에 걸쳐 70℃에서 베이킹하였다.
다양한 실란 용액(APTS, TEB, TDF 및 HDF, 농도: 5% 수분 함유 에탄올 용매 내에서 각각 100 mM의 농도)에 상기 TEOS 처리된 니켈 마이크로 비드를 투입하여 교반하였으며, 상온에서 1시간 처리하고, 건조시켰다. 개질된 표면은 마이크로 비드에 적용된 방법과 동일한 방법에 의하여 처리된 니켈 슬라이드를 이용하여 개질된 표면의 접촉각을 측정하였다(사용장치: PHX300, S.E.O, Korea).
- 바이오 칩은 도 2에 도시된 구조에 따라 폴리프로필렌 재질을 사용하여 자체 제작되었으며, 상측 단부에 유입구, 그리고 하측 단부에 배출구를 구비한 단일 튜브 타입(코니컬 형상) 챔버를 구비하였다. 상기 바이오 칩의 치수는 하기와 같다:
(1) 코니컬 관: 유입구의 내부 직경(1.7 mm), 배출구의 내부 직경(600 ㎛), 길이(14 ㎜), 내부 용량(20 ㎕)
(2) 형광 관찰부: 1.7×1.7×2 ㎜
(3) 액상 주입부: 직경 (10 ㎜), 길이 (10 ㎜)
- 쇠고기 시료 제조
E.coli O157:H7 및 B.cereus는 흡착테스트를 위하여 인산나트륨염 완충용액(pH 14, 100 mM)에 첨가되었다. 쇠고기 시료의 경우, 인산나트륨염 완충용액(pH 14, 100 mM) 9mL에 1g을 쇠고기를 투입하였고, 2분 동안 유지시켰다. 그 다음, 중간 범위 시료 용액을 사용하였다.
- 박테리아 흡착 및 측정
박테리아 흡착을 최적화하기 위하여, 2가지 다른 농도의 박테리아 시료(각각 포스페이트 완충 용액 내에 105 c.f.u/mL(고농도) 및 102 c.f.u/10mL(저농도))를 제조하였다. 테스트를 위하여, 각각 100, 101 및 102 c.f.u의 E.coli O157:H7가 첨가된 1g의 쇠고기를 사용하였다. 박테리아 흡착율을 측정하기 위하여 2가지 방법이 사용되었다. E.coli O157:H7 및 B.cereus 각각에 적합한 프라이머 셋을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 저농도 박테리아의 경우, 마이크로 비드 상에 흡착된 박테리아를 아가 플레이팅(agar plating)함으로써 직접 카운팅하였다. 니켈 비드 상의 박테리아 흡착을 관찰하기 위하여 주사전자 현미경(SEM; Field Emission Scanning Electron Microscope Cathode Luminescence System, S-4700 Mono CL, HITACHI GATAN, Japan)을 사용하였다.
박테리아가 흡착된 니켈 비드를 상온에서 1시간 동안 2% 파라포름알데하이드(Sigma) 내에 고정시켰다. 상기 용액은 20㎛ 메쉬 크기를 갖는 체(sieve)를 이용하여 여과시켰고 에탄올 농도를 점차 증가시키는 방식으로 탈수시켰다. 상기 시료는 24시간 동안 동결 건조시켰고(Freeze Dry DC400, YAMATO Scientific), 그 후 스퍼터 내에서 금 코팅시켰다. 상기 비드는 주사전자현미경을 이용하여 이미지화하였다. 모든 실험은 5회 반복하였다.
- 증폭 및 검출
쇠고기 내의 활성 E.coli O157:H7를 측정하기 위하여, 단일 챔버(마이크로 비드 상에 쇠고기 내 박테리아가 흡착되어 있음) 내에서 세척 단계없이 제조사에 의하여 제공된 수정 프로토콜을 이용한 NucliSensㄾ Basic Kit(Biomerieux, France)를 사용하여 NASBA 증폭 프로세스를 수행하였다. E.coli O157:H7에 특이적인 염기서열을 갖는 NASBA 증폭용 프라이머 셋을 사용하였는 바, 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112010047286631-pat00001
B.cereus에 대한 프라이머의 염기서열은 하기 표 2에 나타내었다.
염기서열
프라이머
 BCN1 5'-aattctaatacgactcactatagggagaaggGCAGGGTGGCAGCGTAT-3'
BCN2 5'-CTGCGGCTGCGGCTGCTATT-3'
증폭 단계는 랩 칩(Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)을 사용하여 모니터링되었다. 상기 코니컬 타입의 바이오 칩을 사용하여 활성 E.coli를 검출하기 위하여, 비콘 타입 검출 프로브를 상기 NASBA 혼합물에 첨가하였다. 상기 비콘 타입 검출 프로브는 FAM-5`-cccgtgTGTCTGGTGAATTGGTTCCGGGTAcacggg-3`-DABCYL이었다. 상기 검출 프로브가 NASBA 혼합물에 함유되었을 때, 증폭은 3시간 동안 수행되었다. 형광 신호는 자외선 조사 하에서 측정되었다. 형광 신호를 정량화하기 위하여, CW-램프 필터(485 nm)를 구비한 VICTOR 3TM 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, USA)를 사용하였다.
실험 결과
- 고체 표면 특성에 따른 박테리아의 흡착 특성 평가
다수의 마이크로 비드(1,000개)가 구비된 단일 고분자 튜브 챔버 구조의 바이오 칩을 먼저 도 3(a)에 도시된 바와 같이 제작하였다. 박테리아(E.coli O157:H7 또는 B.cereus) 용액 1 mL(인산염 완충용액 105 c.f.u/mL, pH 4)를 2mL/min의 유속으로 상기 바이오 칩 내로 충진하였다. 도 3(b)는 박테리아(E.coli O157:H7)가 고체 표면 상에 흡착되는 상태를 순차적으로 보여주는 사진으로서, 시계방향으로 각각 비드(니켈 비드), 확대된 비드 표면, 비드-TEOS 표면, 및 비드-TEOS 표면-박테리아 흡착 상태를 나타낸다.
또한, 도 4(a)는 니켈 마이크로 비드의 표면 개질에 사용된 물질(TEOS, APTS, TEB, TDF 및 HDF)에 따른 접촉각(water contact angle)과 E.coli O157:H7의 흡착율 그래프 및 TEOS-개질된 고체 표면으로의 흡착 상태를 도시하는 SEM 사진(inset)이다.
도 3(b) 및 도 4(a)로부터, E.coli O157:H7 대부분은 응집(clustering)된 상태에서 TEOS-개질 니켈 비드 상으로 흡착되었으며, 개별 박테리아는 극소수만이 마이크로 비드 상에 존재하였음을 알 수 있다.
상기 도면에 나타낸 바와 같이, 박테리아는 친수성 표면(낮은 수접촉각)에서 보다 높은 흡착 특성을 나타내었다. 도 4(b)는 동일 실험 조건 하에서 니켈 마이크로 비드의 표면 개질에 사용된 물질(TEOS 및 HDF)에 따른 접촉각과 B.cereus의 흡착율을 나타내는 그래프이다. 상기 그래프에 따르면, E.coli O157:H7에서와 유사한 결과가 관찰되었다.
상기 결과에 비추어, 비록 세포와 고체 표면 간의 부착(고정) 메커니즘이 명확히 규명된 것은 아님에도 불구하고 부착 프로세스 초기의 비특이적 상호 작용을 제어하는데 세포와 고체 표면의 소수성이 주요 파라미터에 해당되는 것으로 판단된다.
비드의 개수 및 부하 유속(loading rate)이 박테리아 흡착 및 증폭에 미치는 영향을 도 5에 나타내었다(E.coli O157:H7 농도: 105 c.f.u./1mL). 상기 도면은 마이크로 비드 개수의 최적화 조건을 도출하기 위하여, 각각 비드 개수에 따른 E.coli O157:H7의 흡착율(a), 증폭 산물의 전기 영동 패턴(b), 그리고 로딩 유속에 따른 E.coli O157:H7 흡착율(c)을 나타낸다.
상기 도면에 고려하면, 본 실험에서의 최적 비드 개수 및 로딩 유속은 각각 500개 및 2 mL/min임을 알 수 있다. 다만, 도 5(c)에 따르면, 유속이 클수록 흡착율이 다소 감소하기는 하지만, 이에 크게 영향을 받지 않고 비교적 양호한 흡착율을 나타내었다. 이는 고농도 조건 하에서 친수성 고체 표면에 박테리아가 용이하게 흡착될 수 있다는 점뿐만 아니라, 특히 사용된 바이오 칩을 코니컬 타입으로 구성하여 칩 내에 충진된 비드에 시료가 수직으로 유입되도록 함으로써 일종의 필터 효과를 유도하고, 다수의 비드를 충진함으로써 비교적 높은 유속을 견딜 수 있음을 시사한다.
한편, 도 6은 저농도의 박테리아 시료를 사용하는 경우에 있어서의 박테리아(E.coli O157:H7 또는 B.cereus) 흡착율을 나타내는 그래프이다. 도시된 바와 같이, 박테리아 시료의 농도가 낮은 경우, E.coli O157:H7 또는 B.cereus에 대한 흡착 특성은 고농도인 경우에 비하여 다른 거동을 나타내었다. 친수성 TEOS 표면임에도 불구하고 저농도에서는 2가지 박테리아 모두 흡착율이 낮았다. 이는 박테리아가 시료 내에 저농도로 존재할 경우, 친수성 표면을 이용하는 것만으로는 농축이 용이하지 않음을 의미한다.
도 7은 박테리아 시료의 농도가 낮은 경우(102 c.f.u/10mL)에 있어서, 표면 전하가 박테리아 흡착에 미치는 영향을 도시하는 그래프이다. E.coli O157:H7의 경우, APTS 농도가 증가함에 따라 흡착율 역시 증가하였다. 반면, B.cereus의 흡착율은 표면이 (+)로 하전됨에도 불구하고 유의미할 정도로 변화하지는 않았다.
상술한 결과는 E.coli O157:H7의 표면 전하가 음인 반면, B.cereus의 표면은 중성에 가깝다는 것을 의미한다. 따라서, (+)로 하전된 개질 표면은 (-) 전하의 표면을 갖는 박테리아, 즉 그람 음성 박테리아를 농축하는데 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 그러나, 도 8에 나타낸 바와 같이, 표면이 (+) 전하를 나타내도록 APTS로 처리된 비드의 경우, 증폭 회수에 따른 형광 강도의 증가가 상대적으로 미미하였는 바, 이는 후속 증폭(rt-PCR) 과정에 적합하지 않음을 의미한다.
- 박테리아 함유 시료의 조성에 따른 흡착 특성의 평가
박테리아 함유 시료에 첨가되는 염에 따라 친수성 TEOS 표면에 고정되는 그람 음성 박테리아(MgCl2) 및 그람 양성 박테리아(Na2SO4)의 흡착율을 각각 측정하였다. 그람 음성 박테리아(E.coli O157:H7)의 경우, 시료 제조시 포스페이트 완충용액(pH 4, 100 mM)에 MgCl2(각각 0 mM. 10 mM 및 100 mM)을 첨가하였다. 그람 양성 박테리아(B. cereus)의 경우, MgCl2 대신에 Na2SO4(각각 0 mM. 10 mM 및 100 mM)를 사용하였다. 이때, 폴리에틸렌글로콜(PEG; Mw: 8000)을 첨가하지 않은 경우 및 첨가한 경우(1%(w/v))로 구분하여 실시하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, MgCl2(10 mM)을 첨가할 경우, E. coli O157:H7의 흡착율은 약 60%이었다(PEG 1%). 반면, B. cereus의 경우, Na2SO4의 농도가 증가함에 따라(특히, 10 mM 이상에서) 흡착율 역시 증가하였으며, E. coli O157:H7와는 달리 PEG를 함유하지 않을 때 오히려 흡착율이 증가하였다.
시료 내 MgCl2 및 PEG 농도를 변화시키면서, E.coli O157:H7 및/또는 B.cereus 각각의 농도(저농도 조건 하)에 따른 흡착율 변화를 측정하여 도 10에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, 그람 음성 박테리아인 E.coli O157:H7는 Mg2+ 및 PEG의 존재 하에서 박테리아 흡착율이 증가한 반면, B.cereus의 경우 Mg2+ 및 PEG의 존재가 흡착율에 영향을 미치지 않았는데, 이는 B.cereus의 표면전하가 E.coli O157:H7의 표면전하와 상이하기 때문으로 판단된다.
- 초저농도의 E.coli O157:H7 및 B.cereus의 검출
대용량 시료 내의 E.coli O157:H7 및 B.cereus의 검출 감도에 대한 박테리아 흡착의 영향을 평가하기 위하여, 500개의 TEOS 개질 니켈 비드를 충진한 바이오칩(도 3(a) 참조) 내에서 일련의 프로세스(박테리아 농축 및 증폭)를 수행하였다.
시료는 3가지 박테리아 농도(～100, ～101, 및 ～102 c.f.u./100mL)로 제조되었으며, 정량이송 펌프(peristaltic pump)를 사용하여 2ml/min의 유속으로 로딩되었다. 튜브는 자체적으로 제작된 인덕션 장치를 이용하여 8초 동안 유도 가열되었다. 박테리아 농축 단계를 수반하지 않는 경우("before"로 표시함), 오직 시료 1ml를 불순물 제거 처리하고 통상의 프로세스(가열 세포용해 및 Nuclisense NASBA basic kit)를 이용하여 증폭 반응시켰다. 농축 단계를 수반하지 않은 경우(before) 및 농축 단계를 수반한 경우("after"로 표시함) 각각의 증폭 산물에 대한 전기 영동 패턴을 도 11에 나타내었다.
상기 도면에 도시된 바와 같이, 101 c.f.u./100mL(100 E. coli 미만)의 E.coli O157:H7가 검출되었다(PEG 10% 및 MgCl2 10 mM 조건 하에서). 반면, E. coli O157:H7 농축 단계가 수반되지 않은 경우, ～102 c.f.u./100mL라는 상대적으로 높은 농도의 시료에 대하여도 박테리아를 검출할 수 없었다.
- 쇠고기 내 E.coli O157:H7의 검출
바이오 칩(도 3(a) 참조)에 시료를 로딩하기 전에 1g의 쇠고기를 함유하는 용액(stomached solution) 9ml를 81ml의 로딩 완충 용액(E.coli O157:H7용)에 첨가하였다. 분자 프로브를 함유하는 NASBA 혼합물을 상기 바이오 칩에 첨가하였고 41℃에서 인큐베이팅시켰다. 상기 로딩 완충 용액은 포스페이트 완충용액(pH 4, 100 mM)에 MgCl2(10 mM) 및 PEG(1%(w/v))를 첨가하여 제조되었다.
상기 조건 하에서, 박테리아 농축, 세포 용해, mRNA 증폭 및 시그널 검출을 수행하였다. 그 결과, NASBA 산물은 NASBA 용액에 들어있던 비콘 프로브에 의하여 즉시 형광을 방출하였는 바, victor를 이용하여 형광 시그널을 측정하였는 바, 저농도(쇠고기 1g 내에 10 미만의 E.coli O157:H7) 시료 내의 박테리아의 존재를 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로, 본 발명의 구체적인 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.
1, 11: 바이오 칩
2: 코니컬 형상의 챔버
3, 13: 비드
4: 유입구
5, 15: 배출구
12: 형광 관찰부
14: 연결부위
16: 형광관찰부
17: 액상 주입부
18: 착탈식 덮개

Claims (23)

  1. 수접촉각이 50° 이하인 친수성 고체 표면에 박테리아-함유 시료를 접촉하는 단계를 포함하는 시료 내 박테리아의 농축 방법으로서,
    (i) 타겟 박테리아가 그람 음성 박테리아인 경우, 상기 시료는 Ca2+ 및 Mg2+으로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 2가 양이온을 함유하고 pH가 5 이하인 수계 시료이고; 그리고
    (ii) 타겟 박테리아가 그람 양성 박테리아인 경우, 상기 시료는 적어도 1종의 코스모트로픽 음이온을 함유하고 pH가 5 이하인 수계 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 고체 표면은 단일 챔버 내에 충진된 구조물로서, 상기 구조물은 복수의 비드 또는 단일체 와이어 형상인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 단일 챔버는 상측 단부에 유입구, 그리고 하측 단부에 배출구를 구비한 코니컬 형상의 단일 튜브 타입의 챔버인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 고체 표면은 TEOS(테트라에톡시실란), APTS(3-아미노프로필트리에톡시 실란), HMTS(하이드록시메틸트리메톡시 실란) 및 CETES(카르복시메틸티오에틸트리메틸 실란)로 이루어진 군으로부터 선택되는 실란 화합물로 친수화처리된 것임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 고체 표면은 아민기, 하이드록시기 및 카르복실기로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용기를 포함하는 실란 화합물로 친수화처리된 것임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 고체표면과 접촉하는 시료의 로딩 유속은 0.01 내지 10 ㎖/min 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 고체 표면의 표면적은 10 내지 150㎟ 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서,
    상기 2가 양이온의 염은 CaCl2 또는 MgCl2인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 시료 내 2가 양이온의 농도는 10 내지 100 mM 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 (i)의 시료는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜의 평균분자량은 2,000 내지 10,000이고, 상기 시료 내 폴리에틸렌글리콜의 농도는 0.5 내지 10%(w/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 코스모트로픽 음이온은 SO4 2-, HPO4 2-, OH-, F-, HCOO- 및 CH3COO-으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 코스모트로픽 음이온은 염 형태로 상기 (ii)의 시료에 도입되며, 상기 염은 (NH4)2SO4 또는 Na2SO4인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 코스모트로픽 음이온의 농도는 10 내지 100 mM 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
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