KR20190083195A - 식품으로부터 미생물을 검출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 식품(구체적으로 편의점 등에서 판매 중인 즉석 식품)으로부터 장시간에 걸쳐 복잡한 절차를 요하는 종래의 식중독 균과 같은 병원체 검출 방법에 비하여 단시간에 식품 내 미생물을 양호한 신뢰도로 검출할 수 있는 신규 방법이 기재된다.

Description

식품으로부터 미생물을 검출하는 방법{Method for Detecting Foodborne Microorganism}
본 개시 내용은 식품으로부터 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 식품(구체적으로 편의점 등에서 판매 중인 즉석 식품)으로부터 장시간에 걸쳐 복잡한 절차를 요하는 종래의 식중독 균과 같은 병원체 검출 방법에 비하여 단시간에 식품 내 미생물을 양호한 신뢰도로 검출할 수 있는 신규 방법에 관한 것이다.
인간을 포함한 모든 온혈동물의 장 내에는 박테리아, 바이러스 등과 같은 다양한 병원체가 서식하는데 매우 좋은 환경이 제공되고 있다. 병원체는 주변 환경에서 널리 분포되어 있는 바, 구체적으로 박테리아 병원체는 흙, 동물 장기, 동물의 변에 의하여 오염된 물 등에서 발견되고 있다. 인체 역시 평균적으로 인체 내외에 걸쳐 150 타입 이상의 박테리아를 갖고 있으며, 이중 많은 미생물들이 인체에 무해하기는 하나, 몇몇 종류는 식중독(botulism), 콜레라(cholera), 설사(diarrhea), 구토(emesis), 폐렴(pneumonia), 장티푸스(typhoid) 등을 포함하는 다양한 감염성 질환을 유발한다. 특히, 200 종류 이상의 질병이 음식 및 음용수 단독을 통하여 전염될 수 있다. 예를 들면, Escherichia Coli(또는 E.coli) 계열은 섭취시 큰 문제를 일으키지 않지만, 이중 몇몇은 설사 등을 유발하는 독소를 생성하는 병원체로 알려져 있다.
특히, 병원성 대장균 E.coli O157:H7 등은 장 출혈성 대장균으로서 식중독의 원인균으로 널리 알려져 있으며, 전세계적으로 문제시되고 있다. 또한, 감염 시 용혈성 요독 증후군, 출혈성 대장염, 설사, 신장부전, 발작 등을 유발하며, 심한 경우에는 사망에 이르도록 한다(Reisner, A. et al., 2006. Journal of Bacteriology. 188, 3572-3581; Barrientos, R. M. et al., 2009. Brain, Behavior, and Immunity. 23, 450-454; Schrag, S. J. et al., 2006. PEDIATRICS. 118, 570-576). 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium) 역시 식중독을 일으키는 대표적인 병원체로서 장티푸스 및 파라티푸스의 원인균이며, 다양한 가축 및 동물 등에 오염될 수 있다. 또한, 적절한 세척, 가공온도 및 저장조건이 지켜지지 못한다면, 살모넬라균이 번식할 수 있으며, 이렇게 오염된 식수, 식품 등을 통하여 다른 식품과 교차 오염될 수 있다.
한편, 병원체, 특히 식중독균은 일반적으로 오염된 식품을 통하여 쉽게 인간에게 감염될 수 있다. 통상의 조건 하에서 병원체의 번식속도는 매우 빠르기 때문에 아무리 적은 수의 병원체라도 일단 인체 내에 침입할 경우, 이의 생장환경에 매우 적합한 장 속에서 빠르게 성장하여 인간의 건강을 위협할 수 있는 수준까지 이르게 된다. 따라서, 오염된 환경으로부터 빠르고 간편하게 병원체(특히, E.coli)의 유무를 검출할 수 있는 진단 기술이 요구되고 있다.
특히, 편의점 등에서 판매되는 즉석 식품의 경우 소비자가 섭취하기 전에 미생물을 파괴하는 명확한 가열공정이 없기 때문에 균에 오염되어 있을 경우 심각한 식중독을 유발할 수 있다. 따라서, 즉석 식품에 대한 위해 미생물과 같은 위생 규격의 설정 및 검출 과정은 소비자의 식중독 및 식품 사고 예방에 필수적이다. 특히, 즉석 식품 시장의 확대에 따라서 식품 제조과정에서 발생할 수 있는 식중독 사고 예방을 위하여 식품 회사에서는 전수 검사를 실시하고 있어 식품 내 식중독 유발 가능한 미생물 검출을 위한 기술 개발의 필요성이 증가하고 있는 실정이다.
즉석 식품, 음식점에서 제공되는 음식류 등에 함유된 식중독균을 진단하거나 모니터링하기 위한 종래 방법은, 균을 배양하여 수를 증대시켜 정량적 분석을 하는 방식으로서, 균별로 자라나는 배지의 특성이 달라 이들을 이용하여 균을 식별해내고 있으나, 이러한 방법은 최종 결과를 얻기 위하여 장비가 갖추어진 실험실에서 교육받은 전문가에 의해 복잡한 과정을 거쳐 3 내지 5일 정도의 긴 시간이 필요한 단점이 있다. 또한, 식중독균내 유사 종의 검출로 인하여 검사의 혼선을 유발할 수 있고, 현장에서 식중독균을 검출하기는 실질적으로 불가능하다.
이에 대하여, E.coli 등과 같은 병원체를 함유하는 환경 샘플의 진단을 위하여, 근래에는 ATP(adenosine triphosphate) 및 루시페린(luciferin)/루시페라아제(luciferase)가 반응하여 발광하는 원리를 이용하는 ATP 측정법이 적용되고 있다.
ATP 측정법은 발광 물질인 루시페린(Luciferin)이 ATP와 반응하여 활성화된 후에 발광 효소인 루시페라아제(luciferase)의 작용을 받아 산소에 의해 산화되면서 화학에너지를 빛에너지로 전환시켜 광을 방출한다. 즉, 발광물질인 루시페린은 ATP와 결합하여 루시페린-ATP의 복합물을 형성하면서 2개의 무기인산(H3PO4) 분자를 생성하는데, 이때 루시페린은 환원형이다. 상기 반응에서 생성된 환원형 루시페린-AMP는 산소와 반응하여 산화되면서 불안정한 에너지 상태에 있게 되고, 따라서 불안정한 상태의 산화 생성물은 신속하게 분해되어 산화형 루시페린과 AMP를 생성하면서 광(hv)을 방출하게 된다. 이때 방출되는 광의 량을 측정하여 수치화할 수 있는 바, ATP는 생물의 존재를 지시하는 지표에 해당된다. 즉, 미생물이 존재하면 세포 내에 필수적으로 함유된 ATP 역시 존재하므로 광을 방출할 수 있는 것이다.
상술한 방법은 미생물뿐만 아니라 다른 유기물을 검출할 수 있는 장점을 갖고 있으나, 음식물과 같은 샘플 내에도 소량의 ATP가 함유되어 있기 때문에 정확한 진단을 위하여는 음식물 등으로부터 유래하는 ATP를 제거하고, 검출 대상인 미생물-유래 ATP만을 측정해야 한다. 이처럼, APT 측정법 자체는 유해 미생물만을 포집하여 정확한 진단을 수행하는데 근본적인 한계를 갖고 있다. 특히, 샘플 내에 진단하고자 하는 표적 병원체의 농도가 낮은 경우에는 정확한 검출 및 진단의 곤란성은 더욱 악화될 수 있다.
샘플 내 병원체의 존재 유무를 진단하는 택일적인 방법에 대하여 지속적으로 연구가 진행되고 있는 바, 특히 DNA 및 RNA와 같은 핵산 기반의 검출 방식이 이용되고 있다. 상기 방법 중 핵산, 특히 DNA의 경우에는 PCR(polymerase chain reaction)이라는 강력한 증폭 기술에 의하여 진단 감도를 높일 수 있어 널리 이용되고 있다. 일반적으로, PCR은 체외에서 DNA 유전자 샘플을 증폭하는 분자 생물학적인 방법으로서, DNA에 대한 감도를 증가시키기 위하여 DNA 샘플의 량 및 농도를 높이는 기술이다. 이러한 PCR 테크닉은 온도 조절이 매우 중요한 화학 반응으로서, 대상 샘플을 3가지 온도 프로파일(통상, 각각 55-65℃, 72℃ 및 95℃)로 반복하여 가열 및 냉각시키는 방법이다. 그러나, PCR 방법을 이용하는 경우에도, 균의 DNA외의 외부 DNA가 샘플에 존재할 경우 이들을 주형으로 하여 PCR을 하게 되면 전혀 다른 결과가 나올 수 있는 위양성(false positive)의 위험성이 크다.
따라서, 종래기술의 문제점을 해소하고, 특히 식중독 균과 같은 병원체가 저 농도로 존재하는 식품류, 특히 즉석 식품의 샘플에 대하여 보다 신속하면서도(예를 들면, 약 4 시간 이내), 신뢰성 있는 검출 방법이 절실히 요구되고 있다.
본 개시 내용에 따른 구체예에서는 종래기술의 한계를 극복하기 위하여, 특정한 전 처리 과정을 수행하여 식품 내 미생물(구체적으로 식중독균과 같은 병원체)을 검출하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 개시 내용에 따른 구체예에서는 식품 샘플 내 병원체의 검출에 수일이 소요되고 검출 한계가 낮은 종래 방법과 달리 수 시간의 짧은 시간 내에 신뢰성 있는 검출 방법을 제공하고자 한다.
본 개시 내용의 구체예에 따르면,
a) 식품 샘플에 버퍼액을 주입하여 샘플-함유 버퍼액을 제조하는 단계;
b) 상기 샘플-함유 버퍼액을 100 내지 5000 rpm의 회전 속도 조건 하에서 원심분리하여 미립자 형태의 식품 샘플을 함유하는 상층액 및 펠릿(pellet)으로 분리시키는 단계;
c) 상기 상층액을 멤브레인 필터를 통하여 전처리하는 단계;
d) 상기 멤브레인 필터의 보유물(retentate)을 용해(lysis)시켜 상기 보유물로부터 유전자를 추출하는 단계;
e) 상기 추출된 유전자를 증폭하는 단계; 및
f) 상기 단계 e)의 결과로서 생성된 증폭산물로부터 미생물을 정량적, 정성적 또는 정량적/정성적으로 검출하는 단계;
를 포함하는 식품으로부터 미생물을 검출하는 방법이 제공된다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 식품은 라이스(rice)류 또는 베이커리류일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 b)에 앞서 상기 샘플-함유 버퍼액 내 샘플의 사이즈를 감소시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 멤브레인 필터는,
상기 상층액의 주입구가 형성된 상부 기판;
상기 상부 기판의 하측에 위치하며, 메쉬 구조가 구비된 제1 및 제2 중간 지지 기판 사이에 멤브레인이 개재된 필터 구조물; 및
상기 필터 구조물의 하측에 위치하며, 상기 필터 구조물에 의하여 필터링된 여과액을 배출하기 위한 배출 채널이 형성된 하부 기판;
을 포함할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 상부 기판과 상기 필터 구조물 사이에 상부 기판으로부터 주입된 상층액을 상기 필터 구조물로 가이드하는 채널 및 캐비티가 구비된 제1 가이드 기판이 개재되고,
상기 필터 구조물과 상기 하부 기판 사이에 상기 여과액을 상기 하부 기판으로 가이드하기 위한 채널 및 캐비티가 구비된 제2 가이드 기판이 개재될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 제1 중간 지지 기판과 상기 멤브레인 사이, 그리고 상기 멤브레인과 상기 제2 중간 지지 기판 사이 각각에 멤브레인과 부합되는 형상의 캐비티가 형성되어 조합 시 멤브레인을 수용하고 고정하는 제3 및 제4 중간 지지 기판이 개재될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 e)는 미세유체 기반의 유전자 증폭 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 미세유체 기반의 유전자 증폭 장치는,
(i) 적어도 하나의 미세채널 형태의 유전자 증폭용 챔버를 구비하는 유전자 증폭부;
(ii) 상기 유전자 증폭부와 접촉하거나 인접하여 배치되어 유전자 증폭 반응에 필요한 열 에너지를 공급하는 가열 부재; 및
(iii) 상기 유전자 증폭 반응을 제어하는 제어부;
를 포함할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 유전자 증폭부는 상측이 개방된 적어도 하나의 트렌치(trench) 또는 홈(groove)이 형성된 하부 시트; 및 상기 하부 시트 상에 접합되어 상기 상측이 개방된 적어도 하나의 트렌치 또는 홈을 덮어 유전자 증폭용 챔버를 형성한 것으로, 상기 유전자 증폭용 챔버는 추출된 유전자를 함유하는 유체의 수용 및 유전자 증폭 반응 공간을 제공할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 유전자 증폭부는 미세채널 내로 도입된 유체의 유입 및 배출을 제어하기 위한 미세밸브를 더 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 구체예에 따라 제공되는 식품, 구체적으로 즉석 식품으로부터 미생물을 검출하는 방법은 종래에 식품 샘플 내 병원체의 검출에 수일이 소요되 점을 극복하여 수 시간의 짧은 시간 내에도 신뢰성 있는 병원체 검출 결과를 제공할 수 있다.
특히, 저농도의 미생물(예를 들면, 식중독 균과 같은 병원체 등)을 함유하는 샘플에 대하여도 효과적으로 적용 가능한 만큼, 현장 테스트 기술로서 적용 가능하다.
도 1은 일 구체예에 따라 즉석 식품으로부터 미생물을 검출 또는 진단하는 일련의 방식을 보여주는 순서도이고;
도 2는 예시적 구체예에 있어서 원심분리에 의하여 얻어진 상층액을 보유물 및 여과물(여액)로 분리하기 위한 멤브레인 필터의 구조를 개략적으로 도시하는 도면이고;
도 3은 예시적 구체예에 있어서 유전자 증폭을 위한 미세유체 기반의 디바이스로서 유전자 증폭 장치 중 유전자 증폭부를 개략적으로 도시하는 도면이고;
도 4는 즉석 식품으로부터 추출된 샘플 내 박테리아의 농도를 변화시키면서 PCR을 통하여 얻은 증폭산물의 전기영동 분석 결과를 나타내고; 그리고
도 5는 샘플 내 박테리아의 농도를 변화시키면서 RT-PCR을 통하여 얻은 유전자 증폭산물의 표준 곡선(standard curve), 그리고 실시예에서 500 내지 2000 rpm 범위 내에서 수행된 원심 분리로부터 얻어진 상층액을 멤브레인 필터를 거쳐 추출된 샘플 내 박테리아의 농도를 변화시키면서 RT-PCR을 통하여 얻은 유전자 증폭 검사 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다.
또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위하여 실제 층의 두께(또는 높이) 또는 다른 층과의 비율에 비하여 다소 과장되게 표현된 것일 수 있으며, 그 의미는 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
"즉석 식품"은 완전히 또는 부분적으로 요리된 임의의 식품류를 의미할 수 있는 바, 전형적으로는 편의점과 같은 소매 시장에서 판매되어 즉석으로, 또는 가열과 같은 간단한 가공에 의하여 섭취될 수 있는 식품류를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
"샘플"는 검출하고자 하는 미생물을 함유할 수 있는 한, 특정 종류 또는 형태로 한정되는 것은 아니지만, 본 명세서의 취지 상 주로 라이스류, 베이커리류 등과 같이 텍스츄어 질감을 갖는 탄화수소류 식품으로부터 유래된 종류를 의미할 수 있다.
"미생물"은 광의로는 임의 타입의 생물학적 유기체(biological organism)로부터 유래하는 물질을 의미할 수 있으며, 구체적으로는 복수의 세포로 이루어질 수 있고, 예를 들면 병원체(병원성 세포, 박테리아 등)일 수 있다.
"박테리아"는 외막(bacterial envelope)은 구조에 따라 그람(Gram) 염색반응이 구별되는 바, 그람 음성 박테리아(얇은 뮤레인(murein) 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 외막의 지질 이중층을 가짐)와 그람 양성 박테리아(두꺼운 뮤레인 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 이로써 Crystal violet을 보유함)로 구분된다. 그람 음성 박테리아의 세포막은 포스포리피드(phospholipid)와 기타 글리코프로테인(glycoprotein)으로 이루어져 있으며, 포스포리피드의 대부분은 (-)의 하전을 띄고 있다(net negative charge). 그 종류로는 살모넬라균, 수막염균, 스피로헤타 콜레라균, 페스트균, 티푸스균, 이질균, 대장균, 임균 등이 있다. 반면, 그람 양성 박테리아의 경우, 세포벽은 주로 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 타이코산(teichoic acid)으로 구성되는 바, 그 표면은 거의 중성에 가까운 하전 특성을 갖고 있으며, 포도상구균, 연쇄상구균, 탄저균, 디프테리아균, 파상풍균, 폐렴균 등을 들 수 있다.
"핵산"은 유기 염기(사이토신, 티미딘 또는 우라실과 같은 치환된 피리미딘이거나 아덴 또는 구아닌과 같은 치환된 퓨린)에 연결된 당으로 이루어지는 복수의 뉴클레오티드를 의미할 수도 있다. 즉, 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고, c-DNA, cRNA, miRNA, siRNA, 압타머(aptamer) 등을 예시할 수 있고, 천연적으로 발생하거나 인공적으로 합성된 것 모두 포함하는 개념일 수 있다. 다만, 보다 전형적으로는 DNA, RNA 등일 수 있다.
"증폭(amplification)"은 주형(template)으로서 핵산 분자 중 적어도 하나를 이용하여 핵산 분자에 대한 복수의 복제물 또는 핵산 분자에 상보적인 복수의 복제물을 형성하는 것을 의미할 수 있는 바, 이러한 증폭 시스템 또는 증폭 수단은, 예를 들면 PCR 시스템, 리가아제 체인 반응(LCR) 시스템, 핵산 서열 기반의 증폭(NASBA), Q-베타 리플리카아제(Q-Beta Replicase) 시스템, 전사-기반 증폭 시스템(TAS) 및 스트랜드 변위 증폭(SDA) 등을 포함할 수 있으며, 증폭 생성물을 앰플리콘으로 지칭한다.
"버퍼액(buffer)"은, 예를 들면 25℃에서 약 6 내지 약 9의 pKa로, pH 값을, 예를 들면 6 내지 9(구체적으로 약 7.5 내지 9, 보다 구체적으로 약 7.8 내지 8.5)로 효과적으로 유지할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 이때, 버퍼액은 전형적으로 효소 활성의 기능과 조화되고, 생물학적 분자의 정상적인 생리적 및 생화학적 기능을 유지할 수 있도록 생리학적으로 상용성이 있는(physiologically compatible) 완충액을 의미할 수 있다.
"세포 용해 또는 용해(lysis)"는 세포 등의 분해에 따라서 세포막이 파열되는 동시에 세포 내용물이 노출되는 현상을 의미할 수 있는 바, 통상적으로 PCR과 같은 증폭 과정의 전단계에서 DNA 또는 RNA를 추출 또는 분리하기 위하여 많이 사용되고 있다.
"PCR"은 사이클 프로세스(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 하나의 최초 주형으로부터 다량의 동일한 DNA 스트랜드가 형성되는 반응을 의미하는 바, 통상적으로 PCR 혼합물은 (i) 증폭하고자 하는 염기서열을 갖는 주형인 이중나선형 DNA 분자, (ii) 프라이머(주형 DNA 내 상보적 DNA 염기서열과 결합할 수 있는 단일 스트랜드 DNA 분자), (iii) dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP의 혼합물(PCR 증폭 과정에서 새로운 DNA 분자를 형성하도록 합쳐지는 뉴클레오티드 서브유닛)인 dNTP, 및 (iv) Taq DNA 폴리머라아제(dNTP)를 사용하여 새로운 DNA 분자를 합성하는 효소)를 포함할 수 있다.
"미세채널(microfluidic channel)"은 유체가 흐르는 연장된 통로의 단면적에 있어서 가장 큰 치수가 전형적으로 1000 ㎛ 이하, 구체적으로 약 1 내지 500 ㎛, 보다 구체적으로 약 10 내지 300 ㎛ 범위인 채널을 의미할 수 있다.
"삽입 염료(intercalating dye)"는 핵산, 특히 DNA 이중 스트랜드의 주된 홈(major groove)에 결합하는 성질을 갖는 염료를 의미할 수 있다.
"형광(fluorescence)"이라는 용어는 전자기적 여기에 의하여 짧은 시간 동안 생성되는 발광 타입을 의미할 수 있다. 즉, 형광은 특정 물질이 짧은 파장에서 광 에너지를 흡수한 후에 보다 긴 파장에서 광 에너지를 방출할 때 생성되는 현상을 의미한다. 예시적으로, 흡수와 방출 간의 시간 길이는 통상적으로 비교적 짧은데, 예를 들면 약 10-9 내지 10-8 초 수준일 수 있다.
"Ct 값"은 real time PCR에 있어서 역치(백그라운드 레벨을 초과하는 값)를 초과하는 형광 시그널에 필요한 사이클의 수로 정의될 수 있는 바, 샘플 내 표적 핵산의 량에 반비례한다(즉, Ct 값이 작을수록 샘플 내 표적 핵산의 량이 커짐).
"상에" 및 "위에"라는 표현은 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐만 아니라, 그 사이에 다른 층(중간층) 또는 구성 요소가 개재되거나 존재할 수도 있다. 이와 유사하게, "하측에", "하부에" 및 "아래에"라는 표현 및 "사이에"라는 표현 역시 위치에 대한 상대적 개념으로 이해될 수 있을 것이다. 또한, "순차적으로"라는 표현 역시 상대적인 위치 개념으로 이해될 수 있다.
도 1은 본 개시 내용의 구체예에 따라 즉석 식품으로부터 미생물을 검출 또는 진단하는 일련의 방식을 보여주는 순서도로서, 상기 도면을 참조하여 세부 단계를 설명하기로 한다.
식품 샘플-함유 버퍼액의 제조
본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 검출 또는 진단 대상은 식품, 구체적으로 즉석 식품으로서 판매 중인 상태 그대로는 정확한 진단 또는 검출이 곤란하여 별도의 처리를 요하는 종류일 수 있는 바, 즉석 김밥, 삼각 김밥과 같은 라이스류, 샌드위치와 같은 베이커류 등을 예시할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 식품 샘플에 버퍼액을 주입하여 샘플-함유 버퍼액을 제조하는 바, 버퍼액의 전형적인 예는 PBS(Phosphate buffered saline)으로서, 주로 인산수소이나트륨 및 염화나트륨을 함유하는 수계 염 용액일 수 있다. 버퍼액은 후속 처리(특히, 원심 분리)에 적합한 량으로 첨가될 수 있는 바, 예를 들면 진단 대상인 식품 샘플 100 중량부에 대하여, 약 10 내지 150 중량부(구체적으로 약 20 내지 120 중량부, 보다 구체적으로 약 50 내지 100 중량부)의 버퍼액을 주입할 수 있다. 다만, 상기 버퍼액의 주입량 범위는 식품의 종류 등에 따라 변경 가능하다.
다만, 경우에 따라서는 식품 샘플에 따라서는 적정 사이즈를 갖도록 하는 사이즈 감소 단계를 선택적으로 수행하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 선택적 단계로서, 시빙(sieving), 파쇄(예를 들면, 습식 파쇄), 블렌더 또는 믹서를 이용한 분쇄, 등을 예시할 수 있으며, 이러한 조작을 2 이상 조합하여 수행할 수도 있다.
식품 샘플-함유 버퍼액의 원심 분리
상술한 바와 같이 샘플-함유 버퍼액을 제조한 후에는 원심 분리를 통하여 상측의 상층액 및 하측의 펠릿(pellet)으로 분리할 수 있다. 이때, 상층액 내에는 작은 입자 형태의 식품 샘플이 분산되어 있다.
예시적 구체예에 따르면, 원심 분리되는 샘플-함유 버퍼액 내 식품 샘플의 사이즈는, 예를 들면 약 10 메쉬 이하, 구체적으로 약 20 내지 120 메쉬, 보다 구체적으로 약 50 내지 100 메쉬 범위일 수 있는 바, 전술한 바와 같이 적정 사이즈를 벗어날 경우에는 후속 원심 분리에 의하여 형성되는 상층액 내에 지나치게 많거나 적은 량의 샘플 입자가 함유됨에 따라 멤브레인에 의한 전처리 또는 검출 과정에 바람직하지 않은 영향을 줄 수 있다.
한편, 일 구체예에 따르면, 원심 분리 과정에서 회전 속도는 소정 범위 내에서 조절될 필요가 있다. 즉, 지나치게 높은 회전 속도 조건 하에서는 검출하고자 하는 미생물(구체적으로 병원체)까지 식품 덩어리와 결합하여 침전되는 반면, 회전 속도가 지나치게 낮으면 식품 덩어리가 펠릿으로 침전되지 않는 경향을 나타내기 때문이다. 상기의 점을 고려하여, 일 구체예에서는, 예를 들면 약 100 내지 5000 rpm, 구체적으로 약 300 내지 3000 rpm, 보다 구체적으로 약 500 내지 2000 rpm의 범위에서 선정되는 회전 속도에서 원심분리를 수행할 수 있다.
또한, 원심분리 시간은, 예를 들면 약 20 내지 50초, 보다 구체적으로 약 25 내지 45초, 보다 구체적으로 약 30 내지 40초 범위일 수 있으나, 이는 예시적 목적으로 이해되어야 한다.
이외에도, 원심분리 시 온도는 지나치게 높지 않는 범위에서 유지하는 것이 버려지는 식품 샘플의 펠릿과 상층액 내 분산되는 식품 샘플 입자 간의 효과적인 분리에 유리할 수 있다. 예를 들면, 약 2 내지 15℃, 구체적으로 약 3 내지 10 ℃, 보다 구체적으로 약 4 내지 7 ℃ 범위 내에서 선정될 수 있다.
상술한 조건의 원심 분리를 수행함에 따라 상층액 내에서 분산된 식품 샘플 입자의 사이즈는, 예를 들면 약 20 ㎛에서 3 mm, 구체적으로 약 100 ㎛에서 약 2 mm, 보다 구체적으로 약 100 ㎛에서 1 mm 범위일 수 있다.
멤브레인 필터링
일 구체예에서는 상술한 원심 분리를 통하여 분리된 상층액을 회수하여 검출 대상으로 사용한다. 그러나, 상층액은 검출하고자 하는 샘플 입자의 량에 비하여 다량의 액상 성분이 함유되어 있는 등, 후속 과정(구체적으로 세포 용해를 통한 핵산 추출)에 바로 적용하기는 곤란하다. 따라서, 액상 성분을 제거하고, 농축된 형태의 샘플 입자를 얻을 필요가 있다.
이를 위하여, 멤브레인 필터를 이용한 전처리 단계를 수행할 수 있는 바, 도 2에서 원심 분리에 의하여 얻어진 상층액을 보유물 및 여과물(여액)로 분리하기 위한 멤브레인 필터의 예시적인 구조를 도시한다.
도 2를 참조하면, 멤브레인 필터(100)는 상측으로부터 크게 상부 기판(A), 필터 구조물(B) 및 하부 기판(C)을 포함한다.
예시적으로, 상부 기판(A), 필터 구조물(B)의 프레임 및 하부 기판(C) 각각은, 예를 들면 플라스틱 재질, 구체적으로 광 투과성을 갖는 플라스틱 재질일 수 있다. 투명성이 필터링 기능에 실질적인 영향을 미치지는 않으나, 멤브레인 필터의 작동, 필터링 정도 등을 용이하게 모니터링할 수 있도록 필요시 투명성이 높은 플라스틱 기판을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예시적으로, 플라스틱 재질은 폴리에스테르(구체적으로, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리이미드(PI), 폴리스틸렌(PS), 폴리카보네이트(PC), 폴리우레탄, 폴리비닐리덴플루오라이드, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리비닐클로라이드(PVC), 사이클릭올레핀 공중합체(COC), 액정 고분자(LCP), 폴리아미드(PA), 폴리이미드(PI), 폴리(페닐렌 에테르) (PPE), 폴리옥시메틸렌(POM), 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 폴리에테르 설폰(PES), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 아크릴 계통의 수지 등일 수 있다. 보다 구체적으로는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 주입된 상층액은 필터 구조물(B)로 도입되는 바, 상층액이 원활하게 필터 구조물(B)로 도입될 수 있도록 선택적으로 상부 기판(A)과 필터 구조물(B) 사이에 제1 가이드 기판(102)이 구비될 수 있다. 이때, 상층액의 주입 압력은, 멤브레인 필터 내에서 효과적인 여과 과정이 수행될 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들면 약 10 kPa에서 10 MPa, 구체적으로 약 50 kPa에서 5 MPa, 보다 구체적으로 약 100 kPa에서 1 MPa 범위일 수 있다.
제1 가이드 기판(102)은 상부 기판(A)으로부터 주입된 상층액을 중앙 영역에 형성된 캐비티로 가이드하기 위하여 기재 내에 트렌치 또는 홈 형태의 채널을 구비한다. 이러한 채널의 폭은, 예를 들면 약 0.3 내지 2 mm, 구체적으로 약 0.5 내지 1.5 mm, 보다 구체적으로 약 0.8 내지 1.2 mm 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 목적으로 이해될 수 있다. 또한, 제1 가이드 기판(102) 내에 형성된 캐비티의 형상 및 사이즈는 하측 방향으로 순차적으로 배치되는 메쉬 구조 및 멤브레인의 형상 및 사이즈에 따라 적절히 정하여질 수 있을 것이다. 일 예로서, 캐비티의 형상은, 예를 들면 원형일 수 있고, 또한 이의 사이즈(직경)은, 예를 들면 약 10 내지 30 mm, 구체적으로 약 15 내지 25 mm, 보다 구체적으로 약 18 내지 23 mm 범위일 수 있다.
제1 가이드 기판(102)의 캐비티를 통과한 상층액은 필터 구조물(B)의 메쉬 구조가 구비된 제1 중간 지지 기판(103)을 통과하게 된다. 제1 중간 지지 기판(103)은 1차적으로 하측에 배치되는 멤브레인(105)을 지지하기 위한 기능을 가지며, 추가적으로 상층액 내에 존재할 수 있는 지나치게 큰 사이즈의 식품 덩어리를 걸러낼 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 메쉬 구조의 홀 사이즈는, 예를 들면 약 1 내지 3 mm, 구체적으로 약 1.5 내지 2.5 mm, 보다 구체적으로 약 1.7 내지 2.3 mm 범위일 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 멤브레인(105) 하측에도 이를 고정하기 위한 제2 중간지지 기판(107)이 배치되는 바, 제1 중간 지지 기판(103)에서와 유사하게 메쉬 구조가 형성되어 있어 멤브레인(105)에 의하여 여과된 여과물(여액)이 하부 기판(C)으로 이송되도록 한다. 이때, 제2 중간 지지 기판(107)과 하부 기판(C) 사이에도 제1 가이드 기판(102)과 대응되는 제2 가이드 기판(108)이 배치되어 여과물(여액)이 제2 가이드 기판(108)에 형성된 채널을 통하여 캐비티를 거쳐 하부 기판(C)으로 모일 수 있도록 한다.
도시된 구체예에 따르면, 제1 중간 지지 기판(103)의 하측에는 멤브레인(105)이 고정 설치될 수 있다. 예시적으로, 멤브레인(105)을 보다 용이하게 고정할 수 있도록, 선택적으로 제1 중간 지지 기판(103)과 멤브레인(105) 사이에 멤브레인 형상과 부합되는 캐비티가 형성된 제3 중간 지지 기판(104)이 배치될 수 있고, 또한 이와 유사하게 멤브레인(105)과 제2 중간 지지 기판(107) 사이에는 멤브레인 형상과 부합되는 캐비티가 형성된 제4 중간 지지 기판(106)이 배치될 수 있다. 따라서, 제3 및 제4 중간 지지 기판(104, 108)의 조합 시 각각에 형성된 캐비티에 의하여 멤브레인(105)을 수용하고 소정 위치에 용이하게 고정할 수 있다.
한편, 멤브레인(105)은 식품 샘플 입자(또는 미생물 함유(부착) 식품 샘플 입자)의 농축물을 보유물(retentate)로 회수할 수 있도록 한다.
예시적 구체예에 따르면, 멤브레인(105)은, 전형적으로 수계의 상층액을 통과시켜야 하는 만큼, 친수성을 갖는 재질을 사용할 수 있다. 예시적으로, 멤브레인은 셀룰로오스 니트레이트, 셀룰로오스 아세테이트(예를 들면, 셀룰로오스 트리아세테이트 및 셀룰로오스 디아세테이트의 혼합물), 혼합 셀를로오스 에스테르(예를 들면, 셀룰로오스 니트레이트 및 셀룰로오스 아세테이트를 포함함), 코팅된 셀룰로오스 에스테르(예를 들면, 부직포 폴리에스테르 지지체 상에 셀룰로오스 아세테이트를 캐스팅함), 친수성 PTFE, 나일론(예를 들면, 나일론 고분자로 폴리에스테르 웹을 함침시켜 제조됨), 폴리카보네이트 등의 재질일 수 있다.
멤브레인(105)의 포어 사이즈(직경)은, 예를 들면 약 0.5 내지 4 ㎛, 구체적으로 약 0.8 내지 3.5 ㎛, 보다 구체적으로 약 1 내지 3 ㎛ 범위일 수 있다. 또한, 멤브레인의 두께는, 예를 들면 약 100 ㎛에서 1 mm, 구체적으로 약 100 내지 500 ㎛, 보다 구체적으로 약 100 내지 300 ㎛ 범위일 수 있다.
또한, 멤브레인의 수분 흐름 속도는, 예를 들면 약 50 내지 400 mL/min/㎠, 구체적으로 약 100 내지 350 mL/min/㎠, 보다 구체적으로 약 200 내지 300 mL/min/㎠ 범위일 수 있다.
한편, 도시된 구체예에서 상부 기판(A), 멤브레인 필터(B) 및 하부 기판(C), 그리고 멤브레인 필터(B)를 구성하는 부재 각각은 접착제가 개재되는 방식으로 상호 결합(또는 접합)될 수 있다. 이러한 접착제는 멤브레인 필터를 구성하는 각각의 층을 상호 접합시키는데 충분한 접착성을 갖는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 고무계 접착제, 아크릴 수지계 접착제, 실리콘계 접착제, 광학계 접착제, 가열성 잡착제 등을 사용할 수 있다. 이때, 접착제는, 구체적으로 일면 또는 양면 접착 테이프, 보다 구체적으로 양면 접착 테이프 형태로 적용 가능한 바, 감압 접착 테이프, 열 활성 접착 테이프, 화학적 활성 접착 테이프, 광 활성 접착 테이프 등을 예시할 수 있다.
용해(lysis)를 통한 유전자 추출
일 구체예에 따르면, 멤브레인에 의한 여과 과정에서 잔류하는 보유물에 함유되어 있는 미생물(구체적으로 박테리아 등의 병원체)을 용해(lysis)시켜 유전자를 추출하는 단계가 수행될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상술한 미생물은 구체적으로 식품-유래(foodborne) 병원체일 수 있는 바, 보다 구체적으로 대장균 E. coli O157:H7, 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium), 황색포도상구균, 리스테리아속균(Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi), 콜레라균, 적리균, 백일해균, 디프테리아균, 장티푸스균, 페스트균, 용혈성 연쇄구균 또는 스타필로코커스 아우레우스일 수 있으며, 특히 구체적으로는 E.coli O157:H7, Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi, S. enteritidis, Y. enterocolitica, S. aureus, B. cereus, L. monocytognes 등일 수 있다.
이와 관련하여, 미생물의 용해를 위하여 당업계에서 알려진 다양한 방식을 적용할 수 있는 바, 조절된 온도 조건 하에서 포집된 미생물을 약 70 내지 95 ℃(구체적으로 약 80 내지 90 ℃)에서 가열하는 방법. 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 펄스 온(pulse on) 및 펄스 오프(pulse off)를 교대로 실시하는 방법, 용해 버퍼액(lysis buffer)을 사용하는 방법 등이 적용 가능하다.
특정 구체예에 따르면, 용해 버퍼액을 이용한 핵산 추출 방식을 이용할 수 있다. 이러한 용해 완충액에 첨가 가능한 버퍼(buffer) 성분의 예로서, HEPES((4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 산(Tricine), 트리스(히드록시메틸)메틸아민 산(Tris), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼(K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, 및/또는 NaH2PO4), 또는 이의 조합 등을 들 수 있으나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용해 버퍼액 내 버퍼 성분의 농도는, 예를 들면 약 3 내지 30 mM, 구체적으로 약 5 내지 20 mM, 보다 구체적으로 약 6 내지 10 mM 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 것으로 반드시 상기 수치 범위에 한정되는 것은 아니다. 선택적으로, 용해 버퍼액은 프로테나아제 K, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 스트렙토그리신 등과 같이 당업계에서 핵산 추출을 위하여 사용되는 프로테아제를 더 함유할 수도 있다. 예시적 구체예에 따르면, 핵산 추출을 위하여, 시판 중인 Helix one ™ 키트, G-spin™ 핵산 추출 키트, easy-spin™ 핵산 추출 키트, Pathogen-spin™ 핵산 추출 키트, QIAamp　 DNA Mini Kit 등을 사용할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 보유물에 대한 용해 온도는 사용되는 효소의 종류 등을 고려하여 선정할 수 있는데, 가열 블록(heating block) 등을 이용하여 조절할 수 있으며, 예를 들면 약 50 내지 98 ℃(전형적으로 약 70 내지 95 ℃) 범위 내에서 정하여질 수 있다. 상기 온도 범위는 예시 목적으로 기술되는 바, 본 개시 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
추출된 유전자의 증폭
일 구체예에 따르면, 용해를 거쳐 추출된 유전자(핵산)에 대한 증폭 반응을 수행한다. 증폭 반응을 위하여, 대표적으로 PCR과 같이 당업계에서 공지된 증폭 기술을 활용할 수 있다. 예를 들면, PCR 방식은 국내특허번호 제593687호 등에 기재되어 있는 바, 전술한 선행문헌들은 본 발명의 참고자료로 포함된다. PCR 방식으로서, 어셈블리-PCR, 비대칭(asymmetric) PCR, 디지털(digital) PCR, 종점(endpoint) PCR, 인버스(inverse) PCR, 메틸화-특이성 PCR, 정성(qualitiative) PCR, 정량화(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR, RT(reverse transcription)-PCR 등을 예시할 수 있으며, 구체적으로는 실시간(real-time) PCR을 적용할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 유전자의 증폭 단계는 미세유체 기반의 유전자 증폭 장치를 이용하여 수행할 수 있는 바, 이때 미세유체 기반의 유전자 증폭 장치는 PCR 장치일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 미세유체 기반의 유전자 증폭 장치는, 크게 유전자 증폭부, 증폭 과정 중 사이클 프로세스에 요구되는 온도 조절을 위한 가열 부재 및 유전자 증폭 반응을 제어하기 위한 제어부를 구비할 수 있다.
이와 관련하여, 유전자 증폭부는 적어도 하나의 미세채널 형태의 유전자 증폭용 챔버를 구비할 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 유전자 증폭부는 상측이 개방된 적어도 하나의 트렌치(trench) 또는 홈(groove)이 형성된 하부 시트 상에 상부 시트가 접합하도록 함으로써 상측이 개방된 트렌치 또는 홈을 덮어 유전자 증폭용 챔버를 형성할 수 있다. 이때, 유전자 증폭용 챔버는 추출된 유전자를 함유하는 유체를 수용하여 온도 사이클에 따라 증폭 반응이 일어나는 공간에 해당된다.
한편, 가열 부재는 유전자 증폭부와 접촉하거나 인접하여(비접촉하여) 배치되어 유전자 증폭 반응에 필요한 열 에너지를 공급하는 기능을 수행하는 바, 미세유체 기반의 증폭부에 열을 공급할 수 있는 한, 반드시 특정 종류의 가열 수단으로 한정되는 것은 아니다. 이러한 가열 수단의 예로서 접촉 방식으로서 펠티어 소자와 같은 열전 소자, 저항 열을 이용하는 히터 등을 예시할 수 있으며, 또한 이의 형태는 가열 블록일 수 있다. 비접촉 방식의 경우, 근적외선 방사장치, 원적외선 방사장치, 열풍기 등을 예시할 수 있다.
또한, 유전자 증폭 반응을 제어하는 제어부는 유전자 증폭을 위한 전체 프로세스를 제어하는 기능을 담당하는 바, 예를 들면 상기 가열 부재를 구동시키거나 이의 온도를 조절하는 등과 같이 유전자 증폭을 위한 온도 제어, 증폭 반응의 개별 단계에서의 처리 시간 제어 등의 기능을 수행할 수 있다. 또한, 제어부는 유전자 증폭 프로세스에서 발생하는 데이터를 저장 및 가공할 수 있으며, 별도의 단말과 통신하는 기능을 수행할 수도 있다. 이러한 기능 이외에, 유전자 증폭 반응과 관련된 전자적 제어가 필요한 모든 부재들을 제어할 수도 있다. 제어부는, 전형적으로 전자제어 회로, 제어를 위하여 특정 기록 매체에 저장되는 컴퓨터 프로그램, 어플리케이션 등의 형태로 구현될 수 있다. 한편, 제어부는 유전자 증폭 반응 프로세스, 결과 및 제어 내용을 외부에 표시하는 디스플레이부, 조작부를 더 포함할 수 있다. 디스플레이부의 예는 액정디스플레이일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 공지의 디스플레이를 사용할 수 있다. 조작부 역시 버튼식, 터치식 등과 같은 공지의 입력 수단을 적용할 수 있다. 이와 관련하여, 조작부를 통하여 진단하고자 하는 샘플 유체의 온도, 시간 등의 조건을 설정할 수 있으며, 디스플레이부를 통하여 증폭 반응의 설정 값을 확인하고, 증폭 반응이 진행됨에 따른 온도, 시간 등의 변화를 확인할 수 있다.
도 3은 예시적 구체예에 있어서 유전자 증폭을 위한 미세유체 기반의 유전자 증폭 장치 중 유전자 증폭부(200)를 개략적으로 도시한다.
상기 도면을 참조하면, 유전자 증폭부(200)는 일종의 칩 형태일 수 있는 바, 크게 상부 시트(201) 및 하부 시트(202)를 포함한다. 이때, 상부 시트(201)의 일 부위에는 용해에 의한 유전자 추출액의 주입구(도시되지 않음)가 형성되어 있고, 하부 시트(202)에는 채널이 홈 형태로 형성되어 있다. 도시된 예에 따르면, 하부 시트(202) 상에는 주입된 추출액을 챔버(213) 근처까지 유도하는 가이드 채널(211), 또한 복수의 챔버(213)로 분기하기 위한 분기 채널(212)이 형성되어 있다. 따라서, 1회의 추출액 주입으로 복수의 챔버에서 증폭 반응을 수행할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상부 시트(201) 및 하부 시트(202) 각각의 재질은 서로 같거나 상이한 재질로 구성할 수 있으며, 전체적으로 멤브레인 필터와 관련하여 예시된 재질을 사용할 수 있다. 다만, 유체의 흐름을 육안으로 확인할 수 있도록 투명성의 PET, 폴리카보네이트 재질 등이 유리할 수 있다.
또한, 미세채널(211, 212)은 직선 또는 곡선 패턴(나선형, 서펜틴형, 지그재그형 등)으로 형성될 수 있는 바, 도 3에 도시된 직선 패턴으로 한정되는 것은 아니다. 이러한 미세채널의 형성은 레이저 컷팅, 컷팅 플로터 가공, 컷팅 프린팅법 등을 이용할 수 있으며 이들 각각의 세부적인 내용들은 당업계에 알려진 사항인 바, 구체적 설명은 생략하도록 한다. 미세채널의 폭(width) 및/또는 깊이(depth)는 특정 수치로 한정되는 것은 아니며, 주로 마이크로미터 수준의 치수를 갖도록 구성할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 증폭 반응이 일어나는 챔버(213)의 사이즈는, 액상 성분의 체적이, 예를 들면 약 10 내지 30 ㎕, 구체적으로 약 15 내지 25 ㎕, 보다 구체적으로 약 18 내지 22 ㎕ 범위가 되도록 설계할 수 있으나, 이는 예시적인 의미로 이해될 수 있다.
또한, 유전자 증폭부(200)에는 상부 시트(201)로부터 추출액이 주입되고 챔버(213) 내에서 수행된 증폭 반응 산물을 배출할 수 있는 주입구 및 배출구(도시되지 않음)가 형성될 수 있는 바, 증폭부 내에서의 유체의 흐름, 즉 유입 및 배출을 제어하기 위하여 미세밸브(도시되지 않음)가 더 구비될 수 있다. 이와 관련하여, 미세채널 내 소정 부위에 적어도 하나의 밸브 홀(도시되지 않음)이 형성될 수 있고, 이에 상기 미세밸브가 삽입됨으로써 증폭 과정에서 유체의 증발 등에 따른 손실을 방지할 수 있을 것이다.
이와 같이, 증폭 대상인 유전자 추출액은 주입구를 통하여 증폭부(200) 내로 주입되어 미세채널(211, 212)을 따라 챔버(213)까지 도달하고, 증폭 반응 후에 배출구를 통하여 외부로 배출될 수 있다. 예시적으로, 주입구 및 배출구는 기계적 천공, 레이저 천공, 화학적 에칭 등을 이용할 수 있으며 이들 각각의 세부적인 내용들은 당업계에 알려져 있다.
미생물(병원체 또는 식중독균)의 검출
상술한 바와 같이 식품 샘플 내 미생물의 증폭산물은 당업계에서 알려진 방법에 의하여 진단 또는 검출(detection)될 수 있는 바, 예를 들면 겔 전기영동(gel electrophoresis), ELGA(enzyme-linked gel assay), ECL(electrochmiluminescent) 등을 이용할 수 있다. 다만, 상기 방식은 증폭 반응의 결과를 확인하기 위하여 각 샘플에 대하여 검출 단계를 별도로 수행해야 하는 불편한 점이 있기 때문에 택일적으로 형광을 이용한 검출 방법을 이용할 수도 있다.
예시적 구체예에 따르면, 증폭된 생성물은 라벨화된 프로브, 구체적으로는 형광 라벨화된 프로브를 이용하여 검출될 수 있다. 이러한 형광 라벨화된 프로브의 대표적인 예로서, 엄벨리페론(umbelliferone), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC), 로다민(rhodamine), 탐라(TAMRA), 디클로로트리아지닐아민플루오레신(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실클로라이드(dansyl chloride), 양자점(quantum dots), 피코에리스린(phycoerythrin), FAM(fluorecein amidite) 등을 포함하는 플루오세인계(fluorescein), 알 렉사플로어계 (alexa fluor) 및 Cy3, Cy5, Cy7, 인도시아닌그린을 포함하는 시아닌계(cyanine) 등의 형광 물질 등을 들 수 있으며, 이중 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다. 다만, 본 발명이 상기 예시된 형광 물질로 한정되는 것은 아니다. 이와 관련하여, 형광 물질은 특정 파장의 광에 의하여 여기된 후, 또 다른 파장의 광을 방출하여 잉여 에너지를 배출하는 바, FITC와 같은 형광 물질은 550 nm 파장의 광을 방출한다
또 다른 구체예에서는 분자 비콘 프로브 또는 TaqMan 프로브의 형광을 이용한 검출 방법을 이용할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 바이오 칩을 사용할 경우에는 분자 비콘 또는 TaqMan 프로브를 이용한 형광 검출 방식이 특히 유리한 바, 이는 단일 바이오 칩 내에서 샘플의 농축, 증폭 및 검출을 모두 수행할 수 있기 때문이다.
분자 비콘 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 형광체(fluorescent dye)로, 3' 말단을 소광제(quencher)로 결합시킨 것이다. 올리고뉴클레오타이드 스트랜드는 타겟서열에 상보적인 루프형 프로브 부분과 그 양쪽 끝에 5 내지 6개의 뉴클레오타이드의 자기상보(Self-complementary) 영역으로 구성되는데, 타겟이 없을 경우에는 프로브의 상보부분이 인접된 머리핀 형태로 형광체와 소광제가 인접하여 강한 소광 효과를 나타낸다. 반면, 타겟과 반응하면 루프형의 배열이 펴지며 직선으로 되어 형광체와 소광제의 거리가 멀어지게 되어 형광이 관찰된다.
TaqMan 프로브의 경우, 5' 말단을 형광체(FAM 등)로, 3' 말단을 소광제(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 증폭 용액에 첨가하는 방법으로서, TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서는 주형 핵산에 특이적으로 혼성화되지만 프로브 상의 소광제에 의하여 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→3' 핵산말단분해효소(exonuclease)의 활성으로 주형에 혼성화된 TaqMan 프로브가 분해됨에 따라 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광제에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다. 다만, 검출 특이성 면에서 분자 비콘을 사용하는 것이 보다 바람직할 수 있다.
전술한 프로브는 증폭 용액에 첨가하여 사용하는데, 이와 같이 증폭에 앞서 첨가할 경우에는 프라이머가 핵산과 결합함에 있어서 프로브와 경쟁적 관계를 형성할 수 있다. 즉, 프로브와 타겟 핵산의 혼성화에 의하여 비특이적(non-specific) 결합이 증가할 수 있다. 따라서, 과량을 사용할 경우에는 증폭 반응의 저해제로 작용할 수 있다. 반면, 프로브의 량이 일정 수준 미만인 경우에는 증폭된 핵산에 비하여 불충분한 형광 특성으로 인하여 원하는 검출 효과를 기대하기 어렵게 된다. 결국, 증폭 방식을 고려하여 프로브의 사용량, 기타 반응 조건을 실험적으로 적절히 조절하는 것이 바람직하다. 이러한 문제 가능성을 해소하기 위하여, 예를 들면 증폭 반응 시간을 증가시킴으로써 프로브 첨가가 증폭 반응에 미치는 영향을 억제하면서 프로브의 최대 한계 사용량을 증가시킬 수 있다.
다른 예시적 구체예에 따르면, 증폭 단계에 앞서 또는 증폭 과정 중 삽입 염료가 증폭 혼합물에 첨가될 수 있다. 이때, 핵산으로서 DNA를 증폭할 경우, 삽입 염료는 이중 스트랜드 DNA(dsDNA) 사이에 삽입되어, 추후 형광 검출에 따른 강도(intensity)를 측정함으로써 증폭 정도를 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 삽입 염료는 증폭 과정에서 이중 스트랜드 내로 삽입 가능한 염료로서, SYBR Green, PicoGreen, Hoechst 시리즈(series), BOBO, TOTO, YOYO, JOJO, POPO, LOLO, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, LO-PRO, SYTO 시리즈 등을 포함할 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 전형적으로는, SYBR Green, TOTO 시리즈 중 TOTO-3, POPO 시리즈 중 POPO-3, BOBO 시리즈 중 BOBO-3 등을 사용할 수 있다. 본 발명이 상술한 종류로 반드시 한정되는 것은 아니며, 증폭 반응 중 이중 스트랜드에 삽입되어 이로부터 유래하는 형광 특성을 검출할 수 있는 한, 다양한 종류를 사용할 수도 있다. 또한, 첨가되는 삽입 염료의 량은, 삽입 염료의 특성 등을 고려하여 적절히 조절할 수 있는 바, 예를 들면 약 0.1 내지 20 μM 중량%(구체적으로, 약 1 내지 5 μM) 범위일 수 있다. 다만, 본 개시 내용이 상기 수치 범위로 한정되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이, 증폭 생성물로부터 유래된 형광은, 예를 들면 공초점 현미경(confocal microscope), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광계(fluorometer), 형광 스캐너(fluorescence scanner), 플로우사이토메터(flow cytometer) 등과 같이 당업계에 알려진 검출 수단(또는 장치)를 통하여 확인할 수 있는데, 형광의 유무 및 강도를 고려하여 타겟 핵산의 존재 여부 및 농도를 분석할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 형광 검출을 위하여, 예를 들면 레이저-유도 공초점 형광 현미경을 이용할 수 있다. 이외에도, 핵산(표적 핵산)의 존재에 따른 형광 유무 및 형광 세기의 변화를 확인할 수 있는 장비라면 특별한 제한 없이 사용 가능한 바, 예를 들면 QuantaMaster PTI spectrofluorimeter (PTI), SPEX Fluorolog 3 (ISA) 등을 예시할 수 있다.
예시적 구체예에 따른 진단 시스템의 검출 한계(LOD)는, 예를 들면 약 10 내지 102 CFU/ml 범위일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예에 있어서 도 2 및 도 3 각각에 도시된 멤브레인 필터 및 미세유체 기반의 디바이스를 사용하였는 바, 이의 구조 및 재질은 하기와 같다:
- 멤브레인 필터: 시판 중인 폴리카보네이트 재질의 고분자를 이용하여 자체 설계에 따라 제작하여 사용하였다.
- 멤브레인: 3 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 친수성 멤브레인
- 양면테이프 : 주문제작한 양면 접착형 필름을 이용하여 소정 형태로 가공한 후 멤브레인 필터 및 미세유체 기반의 디바이스 제작 시 접착에 적용하였다.
- 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 필름: 고투명성 필름을 사용하였다.
도 2에 도시된 멤브레인 필터의 치수를 하기 표 1에 나타내었다.
구성 부재 치수
상부 기판 및 하부 기판(A, C) 40 mm × 40 mm
제1 및 제2 가이드 기판(102, 108) 채널 1 mm, 캐비티 직경: 18 mm
제1 및 제2 중간 지지 기판(103, 107) 메쉬 홀 사이즈: 2 mm
멤브레인(105) 포어 사이즈: 3 ㎛
제3 및 제4 중간지지 기판(104, 106) 캐비티 직경: 18 mm
또한, 도 3에 도시된 미세유체 기반 디바이스의 증폭부에 있어서 총 사이즈는 40 mm × 40 mm이었고, 4개의 증폭 챔버 각각에 수용되는 핵산 추출액의 체적은 20 ㎕이었다.
실시예에서 사용된 샘플은 하기와 같이 제조되었다.
- 박테리아 함유 샘플
E.coli O157:H7 ((ATCC 43895): American Type Culture Collection (Washington DC, USA))를 선택하였으며, 병원체를 튜브에 넣고 15mL의 Luria-Bertani (LB) 배지와 함께 250 rpm으로 37℃에서 교반하면서 24 시간 동안 배양하였다. 이때, UV 흡광도 측정법(600 nm)에 의한 광학 밀도(optical density; OD) 값이 1이 되었을 때 배양을 종료하여 배양물을 회수하고 이를 원하는 농도로 희석한 후 시판 중인 즉석 식품에 주입하여 사용하였다. 이때, 즉석 식품으로 편의점에서 판매 중인 삼각 김밥을 구입하여 사용하였다(상품명: 스팸 & 참치마요 110g(미니스톱)스팸 & 김치볶음 100g(미니스톱), 참치마요네즈 110g(세븐일레븐), 전주비빔밥 105g(세븐일레븐) 및 제육볶음 145g(미니스톱)). 구입한 즉석 식품은 지퍼백에 넣고 손으로 고르게 섞어주었다.
50 ㎖ 튜브에 각각의 삼각 김밥 25g 및 1ㅧ PBS 20 ㎖를 넣고 약 30번에 걸쳐 흔들어 섞어준 후에 이를 메쉬(시브)에 넣고 가압하여 짖누르는 방식으로 내용물의 사이즈를 감소시켰다.
이후, 얻어진 샘플을 새로운 튜브로 옮겼고, 카피(copy) 수가 108인 E. coli 를 단계적으로 희석하였다(serial dilution). 구체적으로, 1.5 ㎖ 튜브 10개에 PBS 90 ㎕씩 넣고, 튜브 2개에 E. coli 108을 10㎕ 씩 넣은 후 볼텍싱(vortexing)하여 E. coli 농도가 107가 되도록 하였다. 그 다음, E. coli 107에서 파이펫으로 10 ㎕ 취출하여 다른 2개의 튜브에 각각 넣은 후 볼텍싱함으로써 E. coli 농도를 106으로 조절하였다. 상기 과정을 반복하여 E. coli 농도가 105에서 102까지의 샘플을 제조하였다. 즉, 상술한 절차를 통하여 5종의 즉석 식품 각각에 대한 107 내지 100까지의 샘플을 제조하였다.
- 원심 분리
각각의 샘플이 담겨져 있는 튜브에 E. coli를 카피 수(106 내지 102) 별로 10 ㎕ 씩 투입한 후에 하기 표 2와 같은 조건 하에서 원심 분리를 수행하였다.
구분 조건
회전속도 2000 rpm
원심분리 시간 30초
온도 4℃
- 멤브레인 필터링
원심 분리에 따라 상층액 및 펠릿으로 분리된 내용물 중 상층액을 취출하여 멤브레인 필터에 주입하여 멤브레인에 잔류하는 보유물을 회수하였다. 이때, 상층액은 마이크로피펫을 이용한 방식으로 주입하였다.
- 핵산 추출
상술한 바와 같이 얻어진 멤브레인 필터링의 보유물을 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 세포 용해 시약으로서 하기 표 3의 조성을 갖는 Helix one™ kit를 첨가하였다.
구분 조건
DNA-미함유 물 69 ㎕
10X 버퍼액 10 ㎕
Helix one 1 ㎕
이후, 볼텍싱한 후에 히팅 블록을 이용하여 하기 표 4와 같은 가열 프로토콜에 따라 온도를 조절하였다.
구분 온도 시간
단계 1 75 ℃ 5분
단계 2 95 ℃ 5분
상술한 절차에 따라 미생물(E. Coli)로부터 핵산을 추출하였다. 이때, 샘플 내 박테리아 농도는 107 cell/mL에서 100 cell/mL까지 변화시킨 것이었고, 음성 대조군으로 탈이온수를 사용하였다. 이들 각각에 대하여 하기 표 5에 기재된 조성을 갖는 i-StarMAX™을 증폭 시약으로 사용하였고, 미세유체 기반의 PCR 장치를 이용하여 증폭 반응시켰다.
조성 Add vol. (㎕)
탈 이온수 12.5
10X 반응 버퍼(reaction buffer) 2
Forward primer 1
Reverse primer 1
dNTP 2
추출된 바이러스 용해물(Extracted viral lysate) 1
polymerase 0.5
이때, 유전자 증폭 조건은 95℃에서 10초(해리 단계), 58℃에서 5초(결합 단계), 및 72℃에서 10초(연장 단계)를 1 사이클(cycle)로 하여 총 35 사이클(cycle)을 반복 진행하였으며, 이후 72℃에서 약 2분 동안 연장 단계(extension step)를 수행하는 방식이었다.
이와 같이 증폭된 유전자의 전기영동 분석을 위한 아가로오스 겔(2%)을 제조하기 위하여, 1X TAE 버퍼 100 mL 및 Agarose LE(intron, Cat No. 32034) 2 g을 혼합한 후에 전자레인지 내에서 녹였고, 이에 형광 염료(red safe)를 첨가하여 혼합한 다음, 겔 플레이트에 부어 응고시켰다.
전기영동 겔 실험은 PCR에 의한 증폭 생성물 샘플 6 ㎕ 및 6X 로딩 버퍼 1 ㎕를 혼합한 후, 앞서 제조된 2% 아가로오스 겔에 5 ㎕를 로딩시켰으며, 전기 영동 장치에서 20분 동안 겔을 내려준 후에 UV로 측정하였다. 이때, 표준 유전자를 추출하고 동일한 조건에서 유전자 증폭 산물을 비교하였으며 그 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, 상기 겔 전기영동 실험을 통하여 얻은 이미지에서 좌측 이미지는 DNA를 추출하여 진행한 결과인 한편, 우측 이미지는 실시예에 따른 유전자 증폭 결과물로부터 얻은 결과이다. 즉, 표준 샘플(좌측)의 경우 107 cell/mL에서 100 cell/mL까지 검출이 가능하였고, 실시예에서도 107 cell/mL에서 101 cell/mL까지 검출 가능함을 확인하였다.
실시예 2
즉석 식품으로 삼각 김밥(참치마요네즈) 샘플을 실시예 1에서와 같이 원심 분리에 의하여 분리된 상층액을 멤브레인 필터에 주입하였고, 이로부터 회수된 보유물에 대하여 세포 용해 버퍼액을 첨가하여 샘플 내 박테리아(E. coli)의 농도에 따라 정량 중합요소연쇄반응(Real time PCR) 검출 테스트를 수행하였다. 이때, 샘플 내 박테리아 농도는 107 cell/mL에서 100 cell/mL까지 변화시켰고, 음성 대조군으로 탈이온수를 사용하였다.
구체적으로, 유전자 추출액을 각각의 튜브에 주입한 후에 real-time PCR을 이용하여 농도 별 정량 분석을 통한 검출 실험을 진행하였다. 이때, real-time PCR의 조건을 하기 표 6에 나타내었다.
조성 Add vol. (㎕)
탈 이온수 7
Forward primer 1
Reverse primer 1
RbTAG premix 10
추출된 바이러스 용해물(Extracted viral lysate) 1
상기 검출 테스트 결과로서 Ct 값을 하기 표 7에 나타내었고, 형광 특성을 표준 곡선과 함께 도 5에 나타내었다. 또한, 상기 표 및 도면에 상층액을 얻기 위한 원심 분리 과정에서의 회전 속도를 500 rpm 및 1000 rpm으로 각각 변화시키면서 얻은 결과를 함께 나타내었다.
107 106 105 104 103 102 101 100
표준곡선 14.85 14.61 20.33 22.3 26.65 29.53 33.56 36.97
2000rpm 　 20.93 24.09 27.69 30.78 33.49 　 　
2000rpm 　 19.85 22.35 26.57 30.23 32.15 　 　
1000rpm 23.19 25.42 29.56 32.33 32.18
1000rpm 21.26 25.13 28.36 30.28 31.96
500rpm 21.01 25.08 28.43 31.71 32.53
500rpm 21.23 25.18 28.73 31.41 32.51
상기 표 및 도면을 참조하면, 도시된 그래프는 표준 샘플을 기초로 한 real time PCR 결과를 기준으로 실제 샘플에 대한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 실시예에 있어서 실제 투입된 샘플의 량이 많을수록 유전자 증폭이 빠르게 진행되어 상대적으로 낮은 Ct값을 나타내는 반면, 샘플의 량이 적을수록 샘플 내에 존재하는 미생물의 량이 적어 주형 DNA의 량이 적기 때문에 상대적으로 높은 Ct 값을 나타낸다. 이처럼, DNA의 농도에 따라 정량적 및/또는 정성적 분석이 가능하고, 이를 기준으로 real time PCR에서 검출할 수 있는 결과의 범위를 표현할 수 있다.
상기 표 및 도면에 따르면, 실시예에 따른 real time PCR의 형광 특성은 표준 곡선과 거의 부합되었는 바, 실시예에 따른 검출 결과가 신뢰성을 확보하고 있음을 지시한다. 따라서, 본 실시예에 따른 검출 플랫폼을 적용할 경우, 낮은 농도의 박테리아 함유 샘플에 대하여도 유효하게 진단할 수 있다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (19)

  1. a) 식품 샘플에 버퍼액을 주입하여 샘플-함유 버퍼액을 제조하는 단계;
    b) 상기 샘플-함유 버퍼액을 100 내지 5000 rpm의 회전 속도 조건 하에서 원심 분리하여 미립자 형태의 식품 샘플을 함유하는 상층액 및 펠릿(pellet)으로 분리시키는 단계;
    c) 상기 상층액을 멤브레인 필터를 통하여 전처리하는 단계;
    d) 상기 멤브레인 필터의 보유물(retentate)을 용해(lysis)시켜 상기 보유물로부터 유전자를 추출하는 단계;
    e) 상기 추출된 유전자를 증폭하는 단계; 및
    f) 상기 단계 e)의 결과로서 생성된 유전자 증폭산물로부터 미생물을 정량적, 정성적, 또는 정량적 및 정성적으로 검출하는 단계;
    를 포함하는 식품으로부터 미생물을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 b)에 앞서 상기 샘플-함유 버퍼액 내 샘플의 사이즈를 감소시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 샘플의 사이즈를 감소시키는 단계는 시빙(sieving), 파쇄, 블렌더 또는 믹서를 이용한 분쇄, 또는 이의 조합을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 멤브레인 필터는,
    상기 상층액의 주입구가 형성된 상부 기판;
    상기 상부 기판의 하측에 위치하며, 메쉬 구조가 구비된 제1 및 제2 중간 지지 기판 사이에 멤브레인이 개재된 필터 구조물; 및
    상기 필터 구조물의 하측에 위치하며, 상기 필터 구조물에 의하여 필터링된 여과액을 배출하기 위한 배출 채널이 형성된 하부 기판;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 상부 기판과 상기 필터 구조물 사이에 상부 기판으로부터 주입된 상층액을 상기 필터 구조물로 가이드하는 채널 및 캐비티가 구비된 제1 가이드 기판이 개재되고,
    상기 필터 구조물과 상기 하부 기판 사이에 상기 여과액을 상기 하부 기판으로 가이드하기 위한 채널 및 캐비티가 구비된 제2 가이드 기판이 개재된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 중간 지지 기판과 상기 멤브레인 사이, 그리고 상기 멤브레인과 상기 제2 중간 지지 기판 사이 각각에 멤브레인과 부합되는 형상의 캐비티가 형성되어 조합 시 멤브레인을 수용하고 고정하는 제3 및 제4 중간 지지 기판이 개재된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 멤브레인의 포어 사이즈(직경)는 0.5 내지 4 ㎛, 그리고상기 멤브레인의 두께는 100 ㎛에서 1 mm 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 멤브레인은 셀룰로오스 니트레이트, 셀룰로오스 아세테이트, 혼합 셀를로오스 에스테르, 코팅된 셀룰로오스 에스테르, 친수성 PTFE, 나일론 또는 폴리카보네이트 재질인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단계 e)는 미세유체 기반의 유전자 증폭 장치를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 미세유체 기반의 유전자 증폭 장치는,
    (i) 적어도 하나의 미세채널 형태의 유전자 증폭용 챔버를 구비하는 유전자 증폭부;
    (ii) 상기 유전자 증폭부와 접촉하거나 인접하여 배치되어 유전자 증폭 반응에 필요한 열 에너지를 공급하는 가열 부재; 및
    (iii) 상기 유전자 증폭 반응을 제어하는 제어부;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 유전자 증폭부는 상측이 개방된 적어도 하나의 트렌치(trench) 또는 홈(groove)이 형성된 하부 시트; 및 상기 하부 시트 상에 접합되어 상기 상측이 개방된 적어도 하나의 트렌치 또는 홈을 덮어 유전자 증폭용 챔버를 형성하며,
    상기 유전자 증폭용 챔버는 추출된 유전자를 함유하는 유체의 수용 및 유전자 증폭 반응 공간을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 유전자 증폭부는 미세채널 내로 도입된 유체의 유입 및 배출을 제어하기 위한 미세밸브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균 E. coli O157:H7, 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium), 황색포도상구균, 리스테리아속균(Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi), 콜레라균, 적리균, 백일해균, 디프테리아균, 장티푸스균, 페스트균, 용혈성 연쇄구균 또는 스타필로코커스 아우레우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 샘플-함유 버퍼액은 식품 샘플 100 중량부에 대하여 10 내지 150 중량부의 버퍼액을 주입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 단계 b) 중 원심 분리 온도는 2 내지 15℃이고, 원심 분리 시간은 20 내지 50초 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 단계 d)는 상기 보유물에 용해 버퍼액을 첨가하는 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단계 d)는 50 내지 98 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 단계 e)는 실시간(real-time) PCR에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. a') 라이스류 및 베이커리류로부터 적어도 하나가 선택되는 즉석 식품 샘플에 버퍼액을 주입하여 샘플-함유 버퍼액을 제조하는 단계;
    b') 상기 샘플-함유 버퍼액을 500 내지 2000 rpm의 회전 속도 조건 하에서 원심 분리하여 미립자 형태의 식품 샘플을 함유하는 상층액 및 펠릿으로 분리시키는 단계;
    c') 상기 상층액을, 0.5 내지 4 ㎛의 포어 사이즈 및 100 내지 300 ㎛의 두께를 갖는 멤브레인이 장착된 멤브레인 필터를 통하여 전처리하는 단계;
    d') 상기 멤브레인 필터의 보유물에 용해 버퍼액을 첨가하여 용해시켜 상기 보유물로부터 유전자를 추출하는 단계;
    e') 상기 추출된 유전자를 미세유체 기반의 유전자 증폭장치를 이용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및
    f') 상기 단계 e')의 결과로서 생성된 유전자 증폭산물로부터 식중독균을 정량적, 정성적, 또는 정량적 및 정성적으로 검출하는 단계;
    를 포함하는 즉석 식품으로부터 식중독 균을 검출하는 방법.
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