JP2007178417A - イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】イオン交換基を有する充填剤粒子表面を溶存オゾンガス濃度が20ppm以上のオゾン水を用いて洗浄することにより親水化する親水化工程を有するイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法であって、前記親水化工程において、促進酸化法による処理を行うイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【選択図】なし
Description
ヘモグロビンA1cは、血液中の糖がヘモグロビンのβ鎖N末端と化学的に結合したものであり、ヘモグロビン中に占めるヘモグロビンA1cが占める割合、すなわち、ヘモグロビンA1cと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンA1cの割合は、1〜2ヶ月の期間の血糖値の平均を反映するものと言われている。そのため、ヘモグロビンA1cが占める割合を示すヘモグロビンA1c値(%)は、一時的に大きく変動し得る血糖値に代えて、糖尿病診断の指標として広く用いられるようになってきている。
以下に本発明を詳述する。
しかしながら、このような方法を用いた場合であっても、得られるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の表面が充分に親水化されないことがあった。
そこで、更に鋭意検討した結果、オゾン水を用いた親水化工程において、促進酸化法による処理を行うことにより、溶存オゾンの分解が促進され、分解によって生じるヒドロキシラジカルによって、親水化処理の効果を更に高めることが可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
従って、このような方法により親水化処理を行った場合には、オゾン水が直接触れた表面部分のみが親水化されることから、水系媒体中でも膨潤したり収縮したりすることがなく、一方、その親水化表面にはタンパク質等が非特異吸着することもない。更に、化学的な親水化処理であることから、物理的な親水化処理方法のように親水性化合物が脱落したりすることもなく、長期間にわたって親水性を維持することができる。
本明細書において、促進酸化法とは、オゾン水の酸化作用を増強させる方法のことをいい、紫外線照射、超音波照射、アルカリ水添加等の溶存オゾンの分解を促進する方法を単独で用いるか又は2種以上を併用することをいう。
このような促進酸化法による処理を行うことで、溶存オゾンの分解が促進され、オゾンの分解によって生じるヒドロキシラジカルの生成量を増加する。このようにして生成したヒドロキシラジカルは、オゾンよりも更に高い酸化力を有するため、親水化処理の効果を更に高めることが可能になるものと考えられる。上記促進酸化法を利用した場合、充填剤粒子の表面における親水基(−OH、−CHO、−COOH等)の生成を更に促進することが可能となる。
上記オゾン水のpHは通常4.0〜5.0の低い値を示すが、pHが高くなると溶解性が不安定になり、分解が促進される。また、オゾン水に超音波を照射することにより、超音波照射時に発生するキャビテーション作用により、一段とヒドロキシラジカルの生成を促進できる。従って、これらを組み合わせることで、親水化処理の効果をより一層高めることが可能となる。
なお、超音波の照射を行う際の超音波照射装置としては、上記周波数を有する超音波を照射できるものであれば、特に限定されない。
また、紫外線は、波長254nmを含むことが特に好ましい。波長254nmの紫外線はオゾン分子に直接作用し、分解する働きがある。この分解過程において、ヒドロキシラジカルが発生するため、親水化処理の効果を一段と高めることが可能となる。
上記粒子の表面にイオン交換基を導入する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、高分子からなる有機系粒子の場合では、官能基を有する高分子からなる粒子を調製した後、該官能基にイオン交換基を有する化合物を化学的に反応させる方法等が挙げられる。
このような高濃度のオゾン水は、例えば、特開2001−330969号公報等に記載されているように、原料水とオゾンガスとを気体のみ通し液体の透過を阻止するオゾンガス透過膜を介して接触させる方法等により調製することができる。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の1つである。
ここで、接触角測定は、高分子材料をはじめ、表面の親水性、疎水性を評価する方法として用いられ、水の接触角が小さいほど親水性が高いと判断される。
本発明においては、タンパク質等の測定対象物質の非特異吸着を充分に抑制することが必要となり、上記範囲が好ましい。より好ましくは50°以下である。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されてなる糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の1つである。
また、本発明の糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いる糖化ヘモグロビンの分析方法もまた、本発明の1つである。
具体的には、例えば、本発明の糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を公知のカラムに充填した後、得られたカラムに所定の条件で溶離液及び測定試料を送液することにより、糖化ヘモグロビンを分析することができる。
(1)イオン交換基を有する充填剤粒子の調製
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸200g、ジエチレングリコールジメタクリレート400g、2−ヒドロキシ−1,3−ジメタクリロキシプロパン80g、及び、ベンゾイルパーオキサイド1.5gを混合し、2.5Lの4重量%ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。これを窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、80℃で8時間重合した後、洗浄・分級して、スルホン酸基を有する充填剤粒子を得た。
得られた充填剤粒子についてレーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は8μm、CV値は14%であった。
得られた充填剤粒子10gを溶存オゾンガス濃度150ppmのオゾン水300mLに浸漬し、撹拌しながら1NのNaOH(和光純薬工業社製)を滴下し、溶液のpHを11.0に調整した。pHを調整後、速やかに水槽内の温度を50℃に設定した超音波照射装置(アズワン社製USD−2)内で周波数が28kHzの超音波を30分間照射した。
超音波照射後、遠心分離機(日立製作所社製Himac CR20G)を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を2回繰り返し親水化処理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径15cm×長さ20cmの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径0.5mm×厚さ0.04mm×長さ350cmの中空管状のオゾンガス透過膜400本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム(積水化学工業社製)を用いて調製した。
実施例1で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子を、オゾン水による親水化処理を行わずにそのままイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤とした。
オゾン水による親水化処理において、溶存オゾンガス濃度を10ppmとした以外は実施例1と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
オゾン水による親水化処理において、pH調整及び超音波照射の操作を行わなかった以外は、実施例1と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
実施例1で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子10gにリン酸緩衝液(pH5.7)に溶解させた0.2重量%ウシ血清アルブミン(BSA)200mLを加え、2分間超音波処理し、80℃の恒温水槽中で24時間ゆるやかに撹拌したのち、恒温水槽から取り出し、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を除去し、リン酸緩衝液(pH8.5)を200mL添加し、再度遠心分離により上清を除去した。次いで、リン酸緩衝液(pH5.7)を200mL添加し、再々度遠心分離にて上清を除去し、物理吸着によるBSAが固定されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
実施例1及び比較例1〜4で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について以下の評価を行った。
実施例1及び比較例1〜3で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコHbコントロールレベル2(国際試薬社製、参考数値10.4±0.5%)を200μLの注射用水で溶解した後、希釈液(0.1%トリトンX−100を含有するリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンA1c量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンA1cと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンA1cの割合(ヘモグロビンA1c値(%))を求めた。測定は10検体連続で行い、その後半5検体の平均値を測定値とした。
結果を表1に示した。
システム:送液ポンプ LC−9A(島津製作所社製)
オートサンプラー ASU―420(積水化学工業社製)
検出器 SPD−6AV(島津製作所社製)
溶離液:第1液 170mMリン酸緩衝液(pH5.7)
第2液 300mMリン酸緩衝液(pH8.5)
溶出法:0〜3分は第1液を、3〜3.2分は第2液を、3.2〜4分は第1液にて溶出
流速:1.0mL/分
検出波長:415nm
資料注入量:10μL
実施例1及び比較例4で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコHbコントロールレベル2(国際試薬社製、参考数値10.4±0.5%)を200μLの注射用水で溶解した後、希釈液(0.1%トリトンX−100を含有するリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。また、負荷資料として、健常人血をNaF採血し、溶血希釈液(0.1重量%トリトンX−100を含有するリン酸緩衝液(pH7.0))で溶血し、150倍に希釈したものを用いて、1日に300検体を測定した。
各負荷検体数測定した後のカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンA1c量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンA1cと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンA1cの割合(ヘモグロビンA1c値(%))を求めた。測定は10検体連続で行い、その平均値を測定値とした。また、ヘモグロビンA1cの保持時間も測定した。
結果を表2に示した。
システム:送液ポンプ LC−9A(島津製作所社製)
オートサンプラー ASU―420(積水化学工業社製)
検出器 SPD−6AV(島津製作所社製)
溶離液:第1液 170mMリン酸緩衝液(pH5.7)
第2液 300mMリン酸緩衝液(pH8.5)
溶出法:0〜3分は第1液を、3〜3.2分は第2液を、3.2〜4分は第1液にて溶出
流速:1.0mL/分
検出波長:415nm
試料注入量:10μL
(1)イオン交換基を有する充填剤粒子の調製
攪拌機付き反応器中にて、3%ポリビニルアルコール(日本合成化学社製)水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学社製)300g、トリエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学社製)100g、及び、過酸化ベンゾイル(キシダ化学社製)1.0gの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて80℃1時間重合した。次に、イオン交換基を有する単量体として、2−メタクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸(東亜合成化学社製)100g、ポリエチレングリコールメタクリレート(日本油脂社製、エチレングリコール鎖n=4)100gをイオン交換水に溶解した。この混合物を同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下で80℃で2時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、イオン交換基としてスルホン酸基を有する充填剤粒子を得た。
得られた充填剤粒子について、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は8μm、CV値は14%であった。
得られた充填剤粒子10gを溶存オゾンガス濃度130ppmのオゾン水300mLに浸漬し、撹拌しながら、波長254nmを含む紫外線を照射できるスポットタイプUV照射装置(アイグラフィックス社製UP−200G)を用いて、1cmの距離から照射強度95mW/cm2で300秒間紫外線を照射して親水化処理を施した。紫外線照射後、遠心分離機(日立製作所社製Himac CR20G)を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を2回繰り返し親水化処理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径15cm×長さ20cmの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径0.5mm×厚さ0.04mm×長さ350cmの中空管状のオゾンガス透過膜400本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム(積水化学工業社製)を用いて調製した。
実施例2で調製したイオン交換基としてスルホン酸基を有する充填剤粒子を、オゾン水による親水化処理を行わずにそのままイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤とした。
オゾン水による親水化処理において、溶存オゾンガス濃度を10ppmとしたこと以外は、実施例2と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
オゾン水による親水化処理において、促進酸化法による処理を行わなかったこと以外は、実施例2と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
実施例2で調製したイオン交換基としてスルホン酸基を有する充填剤粒子10gにリン酸緩衝液(pH5.7)に溶解させた0.2重量%ウシ血清アルブミン(BSA)200mLを加え、2分間超音波処理し、80℃の恒温水槽中で24時間ゆるやかに撹拌したのち、恒温水槽から取り出し、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を除去し、リン酸緩衝液(pH8.5)を200mL添加し、再度遠心分離により上清を除去した。次いで、リン酸緩衝液(pH5.7)を200mL添加し、再々度遠心分離にて上清を除去し、物理吸着によるBSAが固定されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
実施例2及び比較例5〜8で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について以下の評価を行った。結果を表3〜5に示した。
実施例2及び比較例5、7で得られた充填剤粒子について、接触角測定を行った。測定は、協和界面科学社製Dropmaster500を用いて行った。乾燥させた充填剤粒子をスライドガラス上に貼付した両面テープ上に均一になるようにのせ、その後エアースプレーで余分な粒子を除去した。これにより、両面テープ上に充填剤粒子1層分を固定化した。この様子は、マイクロスコープで確認した。
イオン交換水1μLの液滴を作製し、スライドガラス上に固定化した充填剤粒子上に着液させ、接触角をθ/2法により算出した。なお、接触角が90°より小さい場合、着液後の水滴は濡れ広がろうとする。従って、着液後の接触角は、経時的に小さくなる。そこで、着液後0.5秒後の接触角値を用いて評価を行うこととした。
結果を表3に示した。
実施例2及び比較例5〜7で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコHbコントロールレベル2(国際試薬社製、参考数値10.4±0.5%)を200μLの注射用水で溶解した後、希釈液(0.1%トリトンX−100を含有するリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンA1c量及びヘモグロビンA1cと非糖化ヘモグロビンとの合計量をクロマトグラムのピーク面積で評価した。測定は10検体連続で行い、その後半5検体のヘモグロビンA1cピークの面積値及びヘモグロビンA1cピークと非糖化ヘモグロビンピークとの面積値の平均値を測定値とした。
結果を表4、図1に示した。実施例2で得られたヘモグロビンA1cピーク面積値及びヘモグロビンA1cと非糖化ヘモグロビンピークの面積値合計を100%とし、比較例5〜7で得られた各ピーク面積を比較した。
システム:送液ポンプ LC−9A(島津製作所社製)
オートサンプラー ASU―420(積水化学工業社製)
検出器 SPD−6AV(島津製作所社製)
溶離液:第1液 170mMリン酸緩衝液(pH5.7)
第2液 300mMリン酸緩衝液(pH8.5)
溶出法:0〜3分は第1液を、3〜3.2分は第2液を、3.2〜4分は第1液にて溶出
流速:1.0mL/分
検出波長:415nm
資料注入量:10μL
実施例2及び比較例8で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコHbコントロールレベル2(国際試薬社製、参考数値10.4±0.5%)を200μLの注射用水で溶解した後、希釈液(0.1%トリトンX−100を含有するリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。また、負荷試料として、健常人血をNaF採血し、溶血希釈液(0.1重量%トリトンX−100を含有するリン酸緩衝液(pH7.0))で溶血し、150倍に希釈したものを用いた。
測定試料、負荷試料合わせて約1000検体の測定を行い、任意の間隔で測定試料10検体を連続で測定し、その平均値を用いて評価した。下記の条件により測定試料中のヘモグロビンA1c量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンA1cと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンA1cの割合(ヘモグロビンA1c値(%))を求めた。また、ヘモグロビンA1cの保持時間も測定した。
結果を表5に示した。
システム:送液ポンプ LC−9A(島津製作所社製)
オートサンプラー ASU―420(積水化学工業社製)
検出器 SPD−6AV(島津製作所社製)
溶離液:第1液 170mMリン酸緩衝液(pH5.7)
第2液 300mMリン酸緩衝液(pH8.5)
溶出法:0〜3分は第1液を、3〜3.2分は第2液を、3.2〜4分は第1液にて溶出
流速:1.0mL/分
検出波長:415nm
試料注入量:10μL
表4、図1に示すように、促進酸化法による処理を行った実施例2が、A1cArea、TotalAreaともに比較例5〜7より大きいことがわかる。すなわち、充填剤粒子の表面へのヘモグロビンA1c成分や他のヘモグロビン成分の吸着が抑制されていることがわかる。
表5に示すように、実施例2で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、1000検体測定の間、ヘモグロビンA1c値(%)の変動、保持時間の変動がともに非常に小さく、正確な測定が可能であることがわかる。一方、比較例8の場合には、保持時間が大きく変動している。これは、親水性を向上させるためにコーティングしたタンパク質が測定中に脱離していることに起因していると考えられる。
Claims (9)
- イオン交換基を有する充填剤粒子表面を溶存オゾンガス濃度が20ppm以上のオゾン水を用いて洗浄することにより親水化する親水化工程を有するイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法であって、前記親水化工程において、促進酸化法による処理を行うことを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- 促進酸化法による処理として、オゾン水のpHを7以上とし、かつ、超音波の照射を行うことを特徴とする請求項1記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- 周波数が20kHz〜1MHzの超音波を照射することを特徴とする請求項2記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- 促進酸化法による処理として、紫外線の照射を行うことを特徴とする請求項1記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- 紫外線は、254nmの波長を含むことを特徴とする請求項4記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- 促進酸化法による処理を20℃以上で行うことを特徴とする請求項1、2、3、4又は5記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- イオン交換基がスルホン酸基であることを特徴とする請求項1、2、3、4、5又は6記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- 請求項1、2、3、4、5、6又は7記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
- 請求項1、2、3、4、5、6又は7記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とする糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
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