JP2006088073A - イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 イオン交換基を有する充填剤粒子表面をプラズマ処理することにより親水化するイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【選択図】 なし
Description
ヘモグロビンA1cは、血液中の糖がヘモグロビンのα鎖N末端と化学的に結合したものであり、ヘモグロビン中に占めるヘモグロビンA1cが占める割合、すなわち、ヘモグロビンA1cと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンA1cの割合は、1〜2ヶ月の期間の血糖値の平均を反映するものと言われている。そのため、ヘモグロビンA1cが占める割合を示すヘモグロビンA1c値(%)は、一時的に大きく変動し得る血糖値に代えて、糖尿病診断の指標として広く用いられるようになってきている。
以下に本発明を詳述する。
上記粒子の表面にイオン交換基を導入する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、高分子からなる有機系粒子の場合では、官能基を有する高分子からなる粒子を調製した後、該官能基にイオン交換基を有する化合物を化学的に反応させる方法等が挙げられる。
上記イオン交換基を有する単量体を含む単量体混合物を重合して粒子とする方法としては、例えば、イオン交換基を有する単量体と架橋性単量体とを混合し、重合開始剤の存在下で重合する方法等が挙げられる。また、特公平8−7197号公報に記載された方法ように、架橋性重合体粒子を調製した後、イオン交換基を有する単量体を添加し、重合体粒子の表面付近にイオン交換基を有する単量体を重合させる方法;(メタ)アクリル酸メチルや(メタ)アクリル酸エチル等の重合性エステル化合物を架橋性単量体等と混合し、重合開始剤の存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステル化合物を陽イオ
ン交換基に変換する方法等も用いることができる。
プラズマ処理の方法としては特に限定されないが、装置及び操作を簡便化できることから常圧プラズマ処理が好適である。
なお、本明細書において常圧とは、大気圧近傍の圧力下のことを意味し、具体的には1.333×104〜10.664×104Paの圧力下のことを意味する。なかでも、圧力調整が容易で、装置が簡便になる9.331×104〜10.397×104Paの範囲における常圧プラズマ処理が好適である。
また、経済性及び安全性の観点から、処理ガス単独雰囲気よりも、ヘリウム、ネオン、アルゴン、キセノン等の希ガスや窒素ガス等の希釈ガスを併用することが好ましい。これらの希釈ガスは単独でも用いてもよく、2種以上を併用してもよい。なかでも、併用によりプラズマ密度を高め高速処理を可能とすることができ、また、入手が容易で安価でもあることから、アルゴンガス、窒素ガスが好適である。
この場合の電界としては、パルス電界が好ましく、特に、電界の立ち上がり及び/又は立ち下がり時間が10μs以下であるパルス電界が好適である。パルス電界の立ち上がり及び/又は立ち下がり時間が10μsを超えると、放電状態がアーク放電に移行しやすく不安定なものとなり、高密度プラズマ状態を保持しにくくなることがある。より好ましくは5μs以下である。電界の立ち上がり及び/又は立ち下がり時間は、短いほどプラズマ発生の際のガスの電離が効率よく行われ、効率よくプラズマ化したガスを得ることができるが、現時点では40ns未満の立ち上がり時間のパルス電界を実現することは困難である。
なお、本明細書において電解の立ち上がり時間とは、電圧(絶対値)が連続して増加する時間を意味し、立ち下がり時間とは、電圧(絶対値)が連続して減少する時間を意味する。
なお、本明細書においてひとつのパルス継続時間とは、ONとOFFとの繰り返しからなるパルス電界における、ひとつのパルスの連続するON時間を意味する。
また、このときのOFF時間の好ましい下限は0.5μs、好ましい上限は1000μsであり、より好ましい上限は500μsである。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の1つである。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものである糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の1つである。
本発明の糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いる糖化ヘモグロビンの分析方法もまた、本発明の1つである。
(1)イオン交換基を有する充填剤粒子の調製
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸200g、ジエチレングリコールジメタクリレート400g、2−ヒドロキシ−1,3−ジメタクリロキシプロパン80g、及び、ベンゾイルパーオキサイド1.5gを混合し、2.5Lの4重量%ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。これを窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、80℃で8時間重合した後、洗浄・分級して、スルホン酸基を有する充填剤粒子を得た。
得られた充填剤粒子についてレーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は8μm、CV値は14%であった。
得られた充填剤粒子10gを常圧プラズマ処理装置(積水化学工業社製)を用いて、アルゴンガス:アンモニアガスを90:10の割合で混合したガスを装置内が10.100×104Paになるまで導入し、電極間に電圧14.0kV、周波数6.0kHzのパルス電界を印加してグロー放電プラズマを発生させ、300秒間プラズマ処理を行った。
実施例1で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子を、常温プラズマ処理を行わずにそのままイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤とした。
実施例1で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子20gにリン酸緩衝液(pH5.7)に溶解させた0.2重量%ウシ血清アルブミン(BSA)200mLを加え、2分間超音波処理し、80℃の恒温水槽中で24時間ゆるやかに撹拌したのち、恒温水槽から取り出し、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を除去し、リン酸緩衝液(pH8.5)を200mL添加し、再度遠心分離により上清を除去した。次いで、リン酸緩衝液(pH5.7)を200mL添加し、再々度遠心分離にて上清を除去し、物理吸着によるBSAが固定されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
実施例1及び比較例1、2で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について以下の評価を行った。
実施例1及び比較例1で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコHbコントロールレベル2(国際試薬社製、参考数値10.4±0.5%)を200μLの注射用水で溶解した後、希釈液(0.1%トリトンX−100を含有するリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンA1c量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンA1cと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンA1cの割合(ヘモグロビンA1c値(%))を求めた。測定は10検体連続で行い、その後半5検体の平均値を測定値とした。
結果を表1に示した。
システム:送液ポンプ LC−9A(島津製作所社製)
オートサンプラー ASU―420(積水化学工業社製)
検出器 SPD−6AV(島津製作所社製)
溶離液:第1液 170mMリン酸緩衝液(pH5.7)
第2液 300mMリン酸緩衝液(pH8.5)
溶出法:0〜3分は第1液を、3〜3.2分は第2液を、3.2〜4分は第1液にて溶出
流速:1.0mL/分
検出波長:415nm
資料注入量:10μL
実施例1及び比較例2で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコHbコントロールレベル2(国際試薬社製、参考数値10.4±0.5%)を200μLの注射用水で溶解した後、希釈液(0.1%トリトンX−100を含有するリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍
に希釈したものを調製し、測定試料とした。また、負荷試料として、健常人血をNaF採血し、溶血希釈液(0.1重量%トリトンX−100を含有するリン酸緩衝液(pH7.0))で溶血し、150倍に希釈したものを用いて、1日に300検体を測定した。
各負荷検体数測定した後のカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンA1c量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンA1cと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンA1cの割合(ヘモグロビンA1c値(%))を求めた。測定は10検体連続で行い、その平均値を測定値とした。また、ヘモグロビンA1cの保持時間も測定した。
結果を表2に示した。
システム:送液ポンプ LC−9A(島津製作所社製)
オートサンプラー ASU―420(積水化学工業社製)
検出器 SPD−6AV(島津製作所社製)
溶離液:第1液 170mMリン酸緩衝液(pH5.7)
第2液 300mMリン酸緩衝液(pH8.5)
溶出法:0〜3分は第1液を、3〜3.2分は第2液を、3.2〜4分は第1液にて溶出
流速:1.0mL/分
検出波長:415nm
試料注入量:10μL
Claims (7)
- イオン交換基を有する充填剤粒子表面をプラズマ処理することにより親水化することを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- プラズマ処理は、常圧プラズマ処理であることを特徴とする請求項1記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- 処理ガスとしてアンモニアガスを用いることを特徴とする請求項1又は2記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- イオン交換基がスルホン酸基であることを特徴とする請求項1、2又は3記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
- 請求項1、2、3又は4記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
- 請求項1、2、3又は4記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とする糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
- 請求項6記載の糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いることを特徴とする糖化ヘモグロビンの分析方法。
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