CN110044670B - 毛发中毒品提取试剂盒、提取方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种毛发中毒品提取试剂盒、提取方法和检测方法,该提取试剂盒包括复合提取液,所述复合提取液中含有二硫键还原剂、氢键阻断剂、毛发膨胀剂以及溶剂,所述复合提取液呈碱性,pH为8.5~10。该毛发中毒品提取试剂盒使用还原法水解毛发,前处理无需特殊粉碎设备和提取设备,水解时间短,整个提取过程操作简单,相比较传统的酸法、碱法、甲醇溶剂法、缓冲盐溶液法和酶法等方法更适合实验室司法鉴定的快速检测的需求。进一步,该提取试剂盒中复合提取液所用试剂均为水溶性试剂,易于有机试剂液液萃取,从而可以快速分离得到待测溶液,并且所用的试剂对环境基本无污染,对操作人员无毒害,易清除无残留,对仪器设备也基本无损伤。
Description
技术领域
本发明涉及鉴定技术领域,尤其是涉及一种毛发中毒品提取试剂盒、提取方法和检测方法。
背景技术
毛发中毒品定性检测是法医毒物鉴定学科中兴起的检测技术,主要对阿片类、苯丙胺类、氯胺酮等毒品进行定性检测。因毛发具有易保存、化合物稳定、监测时间长等优点,毛发毒品检测现已被用于做吸毒史的鉴定。
药物进入毛发的机制主要有三种途径:(1)药物经血液循环输送到毛囊,在形成毛髓质、毛皮质的过程中与之结合;(2)在毛干形成的过程中通过汗腺、皮脂腺等分泌进入毛发;(3)在毛干形成的过程中通过外层污染进入毛发,分布于毛发中。
目前提取毛发中毒品的方法主要包括:酸法、碱法、甲醇溶剂法、缓冲盐溶液法和酶法等五种,辅助以粉碎、加热、超声等物理手段,得到毛发中的毒品成分用于仪器检测。然而,酸法、缓冲盐溶液法、酶法提取时间通常在3-12小时,时间太长,难以满足实际工作需要;甲醇法提取通常需要采用冷冻研磨仪粉碎毛发后加热超声半小时,技术要求高;强碱法易损伤液相色谱柱。
发明内容
基于此,有必要提供一种毛发中毒品提取试剂盒、提取方法和检测方法,以解决传统的提取方法存在时间长、操作不便且可能对其他仪器造成损伤的问题。
一种毛发中毒品提取试剂盒,包括复合提取液,所述复合提取液中含有二硫键还原剂、氢键阻断剂、毛发膨胀剂以及溶剂,所述复合提取液呈碱性,pH为8.5~10。
在其中一个实施例中,所述二硫键还原剂包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐和巯基乙酸钠,所述三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度是2.80g/100mL~2.95g/100mL,所述巯基乙酸钠的浓度是2.20g/100mL~2.35g/100mL。
在其中一个实施例中,所述氢键阻断剂为十二烷基硫酸钠,所述十二烷基硫酸钠的浓度是0.05g/100mL~0.07g/100mL。
在其中一个实施例中,所述毛发膨胀剂是尿素,所述尿素的浓度是45g/100mL~50g/100mL。
在其中一个实施例中,所述溶剂是超纯水;和/或
所述复合提取液是通过氢氧化钠来调节pH至8.5~10。
在其中一个实施例中,所述毛发中毒品提取试剂盒还包括毛发清洗试剂和纯化浓缩试剂中的至少一种试剂。
一种毛发中毒品提取方法,使用上述任一实施例所述的毛发中毒品提取试剂盒,所述毛发中毒品提取方法包括如下步骤:
将毛发剪成小段清洗干净后,置于容器中,加入所述复合提取液进行水解反应;
纯化浓缩水解反应的产物。
在其中一个实施例中,所述将毛发剪成小段清洗干净,是将毛发剪成3cm~4cm的小段,用甲醇振荡清洗多次;和/或
所述加入所述复合提取液进行水解反应是于55℃~55℃下水解10min~20min;和/或
所述纯化浓缩水解反应的产物是向冷却后的水解反应的产物中加入乙醚,涡旋10s~20s,800rpm~1200rpm下离心2min~4min,之后取有机层于55℃~55℃下用氮气吹干,残留物用甲醇复溶后过0.22μm滤膜,收集滤液。
一种毛发中毒品检测方法,包括如下步骤:
采用上述任一实施例所述的毛发中毒品提取方法对待测毛发进行毒品提取,获得待测溶液;
采用液相色谱串联质谱方法对所述待测溶液进行毒品成分检测。
在其中一个实施例中,所述液相色谱串联质谱方法的检测条件如下:
a)配有电喷雾离子源;
b)液相柱:Allure PFP Propyl 100mm×2.1mm×5μm,接C18保护柱;
c)流动相A为乙腈,流动相B为20mmol/L乙酸胺和0.1%甲酸缓冲液,洗脱梯度如下:
时间/min | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 70 | 30 |
2 | 80 | 20 |
10 | 80 | 20 |
10.01 | 70 | 30 |
12 | 70 | 30 |
d)流速:400μL/min;
e)进样量:10μL;
f)离子源:电喷雾电离-正离子模式;
g)检测方式:多反应监测;
h)碰撞气、气帘气、雾化气及辅助加热气均为高纯氮气,使用前调节各气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求;
i)各毒品化合物的质谱信息如下:
“*”表示定量离子对。
上述毛发中毒品提取试剂盒、提取方法和检测方法使用还原法水解毛发,前处理无需特殊粉碎设备和提取设备,水解时间短,整个提取过程操作简单,相比较传统的酸法、碱法、甲醇溶剂法、缓冲盐溶液法和酶法等方法更适合实验室司法鉴定的快速检测的需求。
进一步,该提取试剂盒中复合提取液所用试剂均为水溶性试剂,易于有机试剂液液萃取,从而可以快速分离得到待测溶液,并且所用的试剂对环境基本无污染,对操作人员无毒害,易清除无残留,对仪器设备也基本无损伤。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种毛发中毒品提取试剂盒,其包括复合提取液,复合提取液中含有二硫键还原剂、氢键阻断剂、毛发膨胀剂以及溶剂,复合提取液呈碱性,pH为8.5~10。
在一个具体示例中,二硫键还原剂包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和巯基乙酸钠,三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度是2.80g/100mL~2.95g/100mL,巯基乙酸钠的浓度是2.20g/100mL~2.35g/100mL;氢键阻断剂为十二烷基硫酸钠,十二烷基硫酸钠的浓度是0.05g/100mL~0.07g/100mL;毛发膨胀剂是尿素,尿素的浓度是45g/100mL~50g/100mL;溶剂是超纯水;复合提取液是通过氢氧化钠来调节pH至8.5~10。
更具体地,在一个优选的示例中,三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度是2.85g/100mL,巯基乙酸钠的浓度是2.28g/100mL;十二烷基硫酸钠的浓度是0.05g/100mL;尿素的浓度是48g/100mL;复合提取液是通过氢氧化钠来调节pH至9.0。
该复合提取液采用还原法原理,其中二硫键还原剂可选择性地将毛发角蛋白中的二硫键还原成巯基,破坏角蛋白的二级和三级结构,改善蛋白的溶解性;氢键阻断剂能够将新生成的巯基保护起来避免重新氧化为二硫键,同时还可以作为表面活性剂,减小角蛋白分子的表面张力,进一步增大溶解性;毛发膨胀剂可以使得角蛋白持续溶胀直至部分溶解。
进一步,在一个具体示例中,该毛发中毒品提取试剂盒还包括毛发清洗试剂和纯化浓缩试剂中的至少一种试剂。其中,毛发清洗试剂可以是但不限于甲醇等,纯化浓缩试剂可以是但不限于乙醚等。
本发明还提供了一种毛发中毒品提取方法,其使用上述毛发中毒品提取试剂盒,该毛发中毒品提取方法包括如下步骤:
将毛发剪成小段清洗干净后,置于容器中,加入复合提取液进行水解反应;
纯化浓缩水解反应的产物。
在一个具体示例中,所述将毛发剪成小段清洗干净,是将毛发剪成3cm~4cm的小段,用甲醇振荡清洗多次;加入复合提取液进行水解反应是于55℃~55℃下水解10min~20min;纯化浓缩水解反应的产物是向冷却后的水解反应的产物中加入乙醚,涡旋10s~20s,800rpm~1200rpm下离心2min~4min,之后取有机层于55℃~55℃下用氮气吹干,残留物用甲醇复溶后过0.22μm滤膜,收集滤液。
更具体地,在一个优选的示例中,该毛发中毒品提取方法可按照如下步骤进行:
(1)将毛发剪至3cm~4cm小段,称取约50mg置于15mL离心管中;
(2)加入4mL甲醇,振荡清洗两次;
(3)加入复合提取液于50℃水解15min,取出冷却;
(4)加入乙醚3mL,涡旋15s,1000rpm下离心3min;
(5)取有机层于50℃下氮气吹干,残留物用200μL甲醇复溶,过0.22μm滤膜。
进一步,本发明还提供了一种毛发中毒品检测方法,其包括如下步骤:
采用上述毛发中毒品提取方法对待测毛发进行毒品提取,获得待测溶液;
采用液相色谱串联质谱方法(LC-MS/MS)对待测溶液进行毒品成分检测。
在一个具体示例中,该液相色谱串联质谱方法的检测条件如下:
a)配有电喷雾离子源;
b)液相柱:Allure PFP Propyl 100mm×2.1mm×5μm,接C18保护柱;
c)流动相A为乙腈,流动相B为20mmol/L乙酸胺和0.1%甲酸缓冲液,洗脱梯度如下表1所示:
表1
时间/min | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 70 | 30 |
2 | 80 | 20 |
10 | 80 | 20 |
10.01 | 70 | 30 |
12 | 70 | 30 |
d)流速:400μL/min;
e)进样量:10μL;
f)离子源:电喷雾电离-正离子模式;
g)检测方式:多反应监测;
h)碰撞气、气帘气、雾化气及辅助加热气均为高纯氮气,使用前调节各气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求;
i)各毒品化合物的质谱信息如下表2所示:
表2
“*”表示定量离子对。
更具体地,可以采用但不限于岛津LC-20A液相色谱仪串联API 4000Q-trap质谱进行LC-MS/MS检测。
本发明创造性地将还原水解法引入到毛发中毒品的司法鉴定过程中,该毛发中毒品提取试剂盒、提取方法和检测方法前处理无需特殊粉碎设备和提取设备,水解时间短,整个提取过程操作简单,如下表3所示,相比较传统的酸法、碱法、甲醇溶剂法、缓冲盐溶液法和酶法等方法更适合实验室快速检测的需求。
表3
提取方法 | 特殊处理 | 水解时间 | 提取与纯化 |
还原法 | 无 | 15min | 液液/固相萃取 |
碱法 | 无 | 15min | 液液/固相萃取 |
甲醇法 | 研磨仪/人工粉碎 | 30min | 吹干复溶 |
酸法 | 研磨仪/人工粉碎 | 1.5-3h | 液液/固相萃取 |
酶法 | 无 | 12h以上 | 液液/固相萃取 |
进一步,该提取试剂盒中复合提取液所用试剂均为水溶性试剂,易于有机试剂液液萃取,从而可以快速分离得到待测溶液,并且所用的试剂对环境基本无污染,对操作人员无毒害,易清除无残留,对仪器设备也基本无损伤。
以下结合具体检测实施例对本发明的毛发中毒品提取试剂盒、提取方法和检测方法作进一步详细的说明。
1.材料和试剂
1.1标准品
1.1.1苯丙胺、甲基苯丙胺、MDA、MDMA、哌替啶、甲卡西酮、美沙酮标准品,化合物的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量详见表4,纯度均≥99.9%,浓度均为1.0mg/mL。
表4标准品中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量
1.1.2 10μg/mL储备液:精密吸取各化合物标准液100μL分别置于10mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配制成浓度为100μg/mL的标准储备液。
1.1.3 1000ng/mL工作液:精密吸取储备液(100μg/mL)各1mL置于同一10mL容量瓶中,用甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,制成浓度为1000ng/mL的标准工作。
1.1.4 100ng/mL工作液:精密吸取储备液(100μg/mL)各100μL,置于同一10mL容量瓶中,用甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,制成浓度为100ng/mL的标准工作。
1.2检材
1.2.1临床毛发样本A:自愿戒毒医院患者,共258mg,用甲醇清洗两次,晾干后,剪至2~3cm小段。
1.2.2临床毛发样本B:自愿戒毒医院患者,共154mg,用甲醇清洗两次,晾干后,剪至2~3cm小段。
1.2.3临床毛发样本C:自愿戒毒医院患者,共421mg,用甲醇清洗两次,晾干后,剪至2~3cm小段。
1.2.4阴性毛发样本:鉴定所工作人员,约5g,用甲醇清洗两次,晾干后,剪至2~3cm小段。
1.3试剂
乙腈(色谱纯);乙酸胺(色谱纯);甲酸98%(色谱纯);乙醚(分析纯);甲醇(色谱纯);超纯水(电阻率18.2MΩ·cm);10%NaOH溶液;乙酸胺(20mmol/L)和甲酸(0.1%)缓冲液:分别称取1.54g乙酸铵和1.0mL甲酸,置于1000mL容量瓶中,加超纯水定容,摇匀备用,pH值约为4。
复合提取液:按配方表5配制。
表5
1.4仪器
分析天平(感量0.1mg);高速离心机;旋涡混合器;氮吹仪;液相色谱-串联质谱联用仪(LC-MS/MS)。
2.检测方法
2.1还原法:称取50mg剪碎的毛发样本置于15mL离心管中,加入3mL复合提取液50℃下加热超声提取15min后取出冷却至室温。加入乙醚3mL,涡旋15s,1000rpm下离心3min。吸取有机层,50℃下氮吹,残留物用200μL甲醇复溶,过0.22μm有机相滤膜,待LC-MS/MS检测。
2.2甲醇法:称取50mg磨碎的毛发样本置于15mL离心管中,加入3mL甲醇50℃下加热超声提取15min后取出冷却至室温。加入乙醚3mL,涡旋15s,1000rpm下离心3min。吸取有机层,50℃下氮吹,残留物用200μL甲醇复溶,过0.22μm有机相滤膜,待LC-MS/MS检测。
3.检测结果
3.1线性与范围:配置浓度为0、20、40、80、120、150、200pg/mg浓度加标样本,以目标物含量与各定量离子色谱峰面积为横纵坐标,求得还原法的线性回归方程。
表5
目标物 | 回归方程 | r | 检出限(pg/mg) | 定量限(pg/mg) |
甲基苯丙胺 | Y=(4.93e+004)X+(1.10e+005) | 0.9995 | 10 | 20 |
苯丙胺 | Y=(1.37e+004)X+(1.08e+005) | 0.9972 | 10 | 20 |
美沙酮 | Y=(1.84e+005)X+(1.88e+005) | 0.9999 | 10 | 20 |
MDMA | Y=(2.28e+004)X+(5.45e+004) | 0.9995 | 10 | 20 |
MDA | Y=(1.28e+004)X+(1.45e+005) | 0.9949 | 10 | 20 |
甲卡西酮 | Y=(5.50e+003)X+(5.10e+004) | 0.9954 | 10 | 20 |
哌替啶 | Y=(8.59e+004)X+(2.21e+005) | 0.9995 | 10 | 20 |
3.2检出限与定量限:检出限的信噪比S/N至少大于3,定量限的S/N至少大于10,为方便7种化合物同时检测,将方法的检出限与定量限设定为10pg/mg、20pg/mg。
3.3日内与日间精密度:配置40pg/mg与150pg/mg两个水平含量的加标样本,进行色谱测定,用标准曲线检测计算含量。1日内连续测定5次,得到日内精密度(RSD%);连续5天每天测定1次,得到日间精密度(RSD%)。如表7所示,结果表明具有良好的精密度。
3.4准确度:平行配置5份40pg/mg与150pg/mg的加标样本得到方法准确度,即回收率。如表7所示,结果表明具有良好的准确度。
表7准确度、日内与日间精密度实验(n=5)
3.5三例真实样本检出情况
选择三例吸毒患者的临床样本,采用还原法、甲醇法分别进行检测。如表8所示,两种方法检出结果一致,且还原法目标物的信号与甲醇法接近。
表8真实样本检出情况
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种毛发中毒品提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
将毛发剪成小段清洗干净后,置于容器中,加入复合提取液于55℃~65℃下水解10min~20min;
纯化浓缩水解反应的产物;
所述复合提取液中含有二硫键还原剂、氢键阻断剂、毛发膨胀剂以及溶剂,所述复合提取液呈碱性,pH为8.5~10;
所述二硫键还原剂包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐和巯基乙酸钠,所述三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度是2.80g/100mL~2.95g/100mL,所述巯基乙酸钠的浓度是2.20g/100mL~2.35g/100mL;
所述氢键阻断剂为十二烷基硫酸钠,所述十二烷基硫酸钠的浓度是0.05g/100mL~0.07g/100mL;
所述毛发膨胀剂是尿素,所述尿素的浓度是45g/100mL~50g/100mL。
2.如权利要求1所述的毛发中毒品提取方法,其特征在于,所述三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度是2.86g/100mL,所述巯基乙酸钠的浓度是2.28g g/100mL。
3.如权利要求1所述的毛发中毒品提取方法,其特征在于,所述十二烷基硫酸钠的浓度是0.06g/100mL。
4.如权利要求1所述的毛发中毒品提取方法,其特征在于,所述尿素的浓度是48g/100mL。
5.如权利要求1所述的毛发中毒品提取方法,其特征在于,所述溶剂是超纯水。
6.如权利要求1所述的毛发中毒品提取方法,其特征在于,所述复合提取液是通过氢氧化钠来调节pH至8.5~10。
7.如权利要求1所述的毛发中毒品提取方法,其特征在于,所述将毛发剪成小段清洗干净,是将毛发剪成3cm~4cm的小段,用甲醇振荡清洗多次;和/或
所述纯化浓缩水解反应的产物是向冷却后的水解反应的产物中加入乙醚,涡旋10s~20s,800rpm~1200rpm下离心2min~4min,之后取有机层于55℃~65℃下用氮气吹干,残留物用甲醇复溶后过0.22μm滤膜,收集滤液。
8.一种毛发中毒品检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
采用如权利要求1~7中任一项所述的毛发中毒品提取方法对待测毛发进行毒品提取,获得待测溶液;
采用液相色谱串联质谱方法对所述待测溶液进行毒品成分检测。
9.如权利要求8所述的毛发中毒品检测方法,其特征在于,所述液相色谱串联质谱方法的检测条件如下:
a)配有电喷雾离子源;
b)液相柱:Allure PFP Propyl 100mm×2.1mm×5μm,接C18保护柱;
c)流动相A为乙腈,流动相B为20mmol/L乙酸胺和0.1%甲酸缓冲液,洗脱梯度如下:
d)流速:400μL/min;
e)进样量:10μL;
f)离子源:电喷雾电离-正离子模式;
g)检测方式:多反应监测;
h)碰撞气、气帘气、雾化气及辅助加热气均为高纯氮气,使用前调节各气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求;
i)各毒品化合物的质谱信息如下:
“*”表示定量离子对。
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