CN107764909A - 一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法 - Google Patents

一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，包括以下步骤：1）供试品溶液的制备；2）对照品溶液的制备；3）检测。本发明提供的一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，采用优化条件的前处理和HPLC检测方法，能够使目标组分和干扰物有效分离，准确地测定盐酸阿莫罗芬及其干扰物含量，实现了对盐酸阿莫罗芬乳膏产品中盐酸阿莫罗芬及其干扰物的控制，保证了盐酸阿莫罗芬产品的质量。

Description

一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法
技术领域
本发明属于药物成分分析检测技术领域，涉及一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，具体涉及一种采用高效液相色谱法分析测定盐酸阿莫罗芬及其干扰物的方法。
背景技术
盐酸阿莫罗芬，化学名称为rac-顺式-4[3-[4-(1,1-二甲基-丙基)苯基]-2-甲基丙烷]-2,6-二甲基-吗啉盐酸盐，是一种广谱抗真菌药。在机体内，盐酸阿莫罗芬，作为主要药效成分，抑制次麦角类固醇转化成麦角甾醇所需的还原酶和异构酶，促使次麦角类醇蓄积，麦角类固醇大量减少；从而损害细胞膜结构和功能，起到抑制和杀灭真菌的功效；同时，盐酸阿莫罗芬还引发异常几丁质蓄积，导致真菌生长的障碍，进而抑制NADH氧化酶和琥珀细胞色素C还原酶等活性，具有极高的体外药理活性。盐酸阿莫罗芬，在乳膏剂中的规格为0.25％；在临床上，用于治疗由皮肤真菌引起的皮肤真菌病：足癣(脚癣、运动员脚)、股癣、体癣、皮肤念珠菌病。
近年来，关于盐酸阿罗莫芬的研制方面的研究较多，而对于盐酸阿罗莫芬的检测的研究则相对较少，检测方法目前只局限于HPLC检测，且流动相的组分繁多，配制复杂，目标物质和干扰物分离效果不理想。例如湖北中医药大学彭秀菊等公开了一种盐酸阿莫罗芬乳膏的研究(彭秀菊.盐酸阿莫罗芬乳膏的研制及质量研究.湖北中医药大学,2014,硕士论文)，其有关物质检测使用色谱条件为：试验条件：C18柱(厂家：DIKMA,型号：Diamonsil，250mm×4.6mm×5μm)，UV检测器(波长214nm)，流速为1.0ml/min。流动相A：pH3.0混合溶液(取枸橼酸0.63g、盐酸0.6ml、氢氧化钠0.24g，加水稀释至1000ml，该溶液-水-三乙胺(25：175：0.3)比例混合，再以稀盐酸调节pH值至3.0)；流动相B：甲醇；采用梯度洗脱方式，程序如下表1。
表1.高效液相梯度表
时间(min) A(％) B(％)
0 31 69
9 31 69
10 17 83
20 17 83
21 31 69
31 31 69
根据该研究中的色谱图(见附图1)，可见约12min后有一明显基线漂移，且有已知干扰物保留时间在漂移基线上，影响目标物质检测以及含量测定，对于后续的研究带来较大的困难，繁多的流动相组分增加了检测生产成本。
例如北京市药品检验所王成刚等在“HPLC法测定盐酸阿莫罗芬搽剂的含量”中公开了一种HPLC方法，采用的流动相为缓冲液-甲醇(体积比1∶4)，缓冲液的配制：取柠檬酸0.63g、盐酸0.6ml、氢氧化钠0.24g，加水稀释至1000ml，此溶液与水和三乙胺按25∶175∶0.3比例混合，再以稀盐酸调pH至3.0。当缓冲液-甲醇的比例为1∶3时，盐酸阿莫罗芬的保留时间延长约5min；当缓冲液的pH值为4.0时，盐酸阿莫罗芬的保留时间延长近一倍。当流动相中甲醇的比例再提高和缓冲液的pH值再降低时，则盐酸阿莫罗芬与干扰物的分离度不理想，同时对ODS柱有损害。其存在的问题是流动相的组分繁多，配制工艺复杂，增加了检测的生产成本，造成资源浪费。
在现有的技术里，对盐酸阿莫罗芬的检测，都未能简化流动相的组分与繁琐的配制工艺，未能同时兼顾流动相组分配比和干扰物分离度的问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，采用优化条件的前处理和HPLC检测方法，能够使目标组分和干扰物有效分离，准确地测定盐酸阿莫罗芬及其干扰物含量，实现了对盐酸阿莫罗芬乳膏产品中干扰物的控制，保证了盐酸阿莫罗芬产品的质量。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：称取盐酸阿莫罗芬乳膏样品，加入含磷酸的甲醇溶液混合后，超声提取、冷却、定容，再摇匀、冷冻离心、过滤，取续滤液作为供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：取盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ的对照品，加入溶剂溶解并定容，摇匀，得到对照品溶液；
3)检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分的含量。
优选地，步骤1)中，所述含磷酸的甲醇溶液为含0.4～0.6％(体积百分比)磷酸的甲醇溶液。更优选地，所述含磷酸的甲醇溶液为含0.5％(体积百分比)磷酸的甲醇溶液。所述磷酸为市售的HPLC级含80～90％(体积百分比)纯磷酸的磷酸水溶液。
优选地，步骤1)中，所述盐酸阿莫罗芬乳膏样品加入的质量(g)，与含磷酸的甲醇溶液加入的体积(ml)之比为3:14～3:16。更优选地，所述盐酸阿莫罗芬乳膏样品加入的质量(g)，与含磷酸的甲醇溶液加入的体积(ml)之比为3:15。
优选地，步骤1)中，所述混合是采用涡旋仪进行振荡摇晃15～25min。更优选地，所述振荡摇晃的时间为20min。
优选地，步骤1)中，所述超声提取的条件为：超声温度为45～55℃，超声时间为10～20min。更优选的，所述超声提取的条件为：超声温度为50℃，超声时间为15min。
优选地，步骤1)中，所述冷却至室温。所述室温为20～25℃。
优选地，步骤1)中，所述定容为用水稀释定容。所述水为纯水。
优选地，步骤1)中，所述冷冻离心的条件为：离心温度：-5～0℃；离心时间为15～30min；离心转速为8000～14000rpm。
优选地，步骤1)中，所述过滤为滤膜过滤。所述滤膜过滤采用的滤膜为0.45μm滤膜。
优选地，步骤1)中，所述续滤液是指：过滤膜时，初滤液后的溶液即为续滤液。
优选地，步骤1)中，所述盐酸阿莫罗芬的CAS号为78613-38-4。所述盐酸阿莫罗芬为rac-顺式-4[3-[4-(1,1-二甲基-丙基)苯基]-2-甲基丙烷]-2,6-二甲基-吗啉盐酸盐(cis-4-[3-[4-(1,1-Dimethylpropyl)phenyl]-2-methylpropyl]-2,6-dimethylmorpholine hydrochlorat e)。所述盐酸阿莫罗芬的分子式为C21H35NO.HCL。
优选地，步骤2)中，所述干扰物Ⅰ的通用名称为Ro 16-865，所述干扰物Ⅰ的中文名称为4-[3-[4-(1,1-二甲基-丙基)苯基]-2-甲基丙基]-2,6-二甲基吗啉-4-氧化物(4-[3-[4-(1,1-dimethylpropyl)-phenyl]-2-methylpropyl]-2,6-dimethylmorpholine 4-oxide)。所述干扰物Ⅰ的CAS号为78613-39-5。所述干扰物Ⅰ的分子式为C21H35NO2。
优选地，步骤2)中，所述干扰物Ⅱ的通用名称为Ro 40-1021，中文名称N-[2-(乙酰氧基)丙基]-N-[3-[4-(1,1-二甲基丙基)苯基]-2-甲基丙基]-甲酰胺(N-[2-(acetyloxy)propyl]-N-[3-[4-(1,1-dimethylpropyl)phenyl]-2-methylpropyl]-formamide)。所述干扰物Ⅱ的CAS号为142347-84-0。所述干扰物Ⅱ的分子式为C21H33NO3。
优选地，步骤2)中，所述干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ为盐酸阿莫罗芬降解过程中产生的物质。
优选地，步骤2)中，所述对照品溶液的制备，包括以下步骤：
A)取盐酸阿莫罗芬对照品，加入溶剂溶解并定容，配制盐酸阿莫罗芬储备溶液；
B)分别取干扰物Ⅰ对照品和干扰物Ⅱ对照品，加入溶剂溶解并定容，配制干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ的混合储备溶液；
C)再取步骤A)中的盐酸阿莫罗芬储备溶液、步骤B)中的干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ的混合储备溶液，加入甲醇水溶液溶解并定容，配制为对照品溶液。
更优选地，步骤A)或B)中，所述溶剂为铵盐甲醇水溶液与甲醇的混合溶液。
进一步地，所述铵盐甲醇水溶液与甲醇加入的体积之比为1:3～1:5。更进一步地，所述铵盐甲醇水溶液与甲醇加入的体积之比为1:4。
进一步地，所述铵盐甲醇水溶液中的铵盐选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三乙胺、碳酸铵或碳酸氢铵中的一种或几种。更进一步地，所述铵盐甲醇水溶液中的铵盐为三乙胺。
进一步地，所述铵盐甲醇水溶液中铵盐水溶液的浓度为0.55～3g/L。更进一步地，所述铵盐甲醇水溶液中铵盐水溶液的浓度为2.3g/L。
进一步地，所述铵盐甲醇水溶液中铵盐水溶液的pH值为2.5～3.5。更进一步地，所述铵盐甲醇水溶液中铵盐水溶液的pH值为3.0。所述pH值采用盐酸调节。所述盐酸为常规使用调节pH值的盐酸水溶液。
进一步地，所述铵盐甲醇水溶液中，铵盐水溶液与甲醇加入的体积之比为55:45～65:35。更进一步地，所述铵盐甲醇水溶液中，铵盐水溶液与甲醇加入的体积之比为60:40。
更优选地，步骤A)中，所述盐酸阿莫罗芬储备溶液中，盐酸阿莫罗芬的浓度为0.167mg/ml。
更优选地，步骤B)中，所述干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ的混合储备溶液中，所述干扰物Ⅰ的浓度为0.63mg/ml，所述干扰物Ⅱ的浓度为0.49mg/ml。
更优选地，步骤C)中，所述甲醇水溶液为含45～55％(体积百分比)甲醇的水溶液。进一步优选地，所述甲醇水溶液为含50％(体积百分比)甲醇的水溶液。
更优选地，步骤C)中，所述对照品溶液选自单一浓度的盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ的混合溶液或一系列不同浓度的盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ的混合溶液中的一种。进一步优选地，所述对照品溶液为单一浓度的盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ的混合溶液。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；检测波长：210nm～220nm；流速：0.8～1.2ml/min；流动相：铵盐甲醇水溶液-甲醇，其中，A相为0.55～3g/L铵盐水溶液-甲醇，铵盐水溶液中盐酸调节pH值至2.5～3.5，铵盐水溶液与甲醇的体积比为55:45～65:35，B相为甲醇；分析时间：30min；梯度洗脱。所述盐酸为常规使用调节pH值的盐酸水溶液。
更优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；检测波长：214nm；流速：1.0ml/min；流动相：铵盐甲醇水溶液-甲醇，其中，A相为2.3g/L铵盐水溶液-甲醇，铵盐水溶液中盐酸调节pH值至3.0，铵盐水溶液与甲醇的体积比为60:40，B相为甲醇；分析时间：30min；梯度洗脱。
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为(见表2)：
0-5min，A相：B相体积比为55：45-55：45；
5-12min，A相：B相体积比为55：45-50：50；
12-24min，A相：B相体积比为50：50-15：85；
24-25min，A相：B相体积比为15：85-55：45；
25-30min，A相：B相体积比为55：45-55：45。
表2.高效液相梯度表
时间(min) A(％) B(％)
0 55 45
5 55 45
12 50 50
24 15 85
25 55 45
30 55 45
更优选地，所述高效液相色谱法还包括有以下色谱条件：柱温：30～40℃，优选为35℃；进样量：5～40μl，优选为10μl。
更优选地，所述铵盐甲醇水溶液中的铵盐选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三乙胺、碳酸铵或碳酸氢铵中的一种或几种。进一步地，所述铵盐甲醇水溶液中的铵盐为三乙胺。
优选地，步骤3)中，所述确定供试品溶液中盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ的成分含量的方法为外标法。
所述外标法是指：按各品种项下的规定，精密称取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积，按下式计算：
含量(Cx)＝Ax*CR/AR
式中：Ax为供试品的峰面积；
AR为对照品的峰面积；
Cx为供试品的浓度；
CR为对照品的浓度；
可得到相应盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ成分的含量。
如上所述，本发明提供的一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，采用优化反应条件的高效液相方法，进行盐酸阿莫罗芬及其干扰物的检测，实现一次样品分析，同时完成定性和定量分析。包括如下有益效果：
(1)本发明提供的方法简化了流动相组成，配制简便，改变梯度，优化了梯度洗脱条件，使干扰物和目标组分保持较好的分离度和峰型，检测方法简捷，分析灵敏度高，结果准确。
(2)本发明提供的方法，减少了传统HPLC流动相的多种组分和繁琐的工艺，适用性好；保证了合宜的出峰时间，优化了峰型；提高了检测的理论塔板数，理论塔板数更高；拖尾因子相比于传统方法更接近于1，对称因子更接近1，消除了过于漂移的基线掩盖样品干扰物检测的影响，能准确地分析测定盐酸阿莫罗芬及其干扰物的含量，并能最大限度的解决基质残留问题，延长色谱柱寿命，降本增效。
(3)本发明提供的方法，使干扰物和目标组分分离，有效地对盐酸阿莫罗芬及其干扰物进行测定，实现了对盐酸阿莫罗芬乳膏产品中含量和有关物质的控制，保证了盐酸阿莫罗芬产品的质量，并有利于产品质量监控，而且减少了传统流动相配制的复杂组分和配制工艺，降低成本，提高效率。
附图说明
图1为引用文献中盐酸阿莫罗芬检测的HPLC色谱图。
图2为流速为1.0ml/min时，盐酸阿莫罗芬检测的HPLC色谱图。
图3为流速为1.2ml/min时，本发明的盐酸阿莫罗芬的HPLC色谱图。
图4为流速为0.8ml/min时，本发明的盐酸阿莫罗芬的HPLC色谱图。
上述图1-4中，1为盐酸阿莫罗芬，2为干扰物Ⅰ，3为干扰物Ⅱ。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
盐酸阿莫罗芬乳膏(上海通用药业自制)；磷酸、甲醇(色谱级，TEDIA公司)；盐酸阿莫罗芬对照品(纯度99.77％，市售)；干扰物Ⅰ对照品(纯度99.2％，市售)；干扰物Ⅱ对照品(纯度96.3％，市售)；磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三乙胺、碳酸铵、碳酸氢铵、盐酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；纯水(纯水机自制)
2、仪器
Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；涡旋仪(Talboys 230VOLT，Henry Troemner.LLC公司)；SCQ-130301-2型双频超声清洗仪(上海声彦超声波仪器有限公司)；VELOCITY 18R型离心机(Dynamica公司)；辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱(Waters公司)
实施例1
1、实验部分
1.1样品前处理
供试品溶液的制备：称取盐酸阿莫罗芬乳膏样品，加入含0.4～0.6％磷酸的甲醇溶液，涡旋仪振荡摇晃15～25min，盐酸阿莫罗芬乳膏样品加入的质量(g)，与含磷酸的甲醇溶液加入的体积(ml)之比为3:14～3:16。然后，在45～55℃超声10～20分钟，冷却至室温，用纯水稀释至刻度定容，再摇匀、冷冻离心、过滤，取续滤液作为供试品溶液。其中，冷冻离心的条件为：离心温度为-5～0℃；离心时间为15～30min；离心转速为8000～14000rpm。过滤为0.45μm滤膜过滤。
对照品溶液的制备：称取盐酸阿莫罗芬对照品，加入铵盐甲醇水溶液与甲醇的混合溶液，配成盐酸阿莫罗芬储备溶液，盐酸阿莫罗芬储备溶液中，盐酸阿莫罗芬的浓度为0.167mg/ml。分别称取干扰物Ⅰ对照品和干扰物Ⅱ对照品，加入铵盐甲醇水溶液与甲醇的混合溶液，配成干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ的混合储备溶液，干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ的混合储备溶液中，干扰物Ⅰ的浓度为0.63mg/ml，干扰物Ⅱ的浓度为0.49mg/ml。上述使用的铵盐甲醇水溶液与甲醇的混合溶液，铵盐甲醇水溶液与甲醇加入的体积之比为1:3～1:5，铵盐甲醇水溶液中的铵盐选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三乙胺、碳酸铵或碳酸氢铵中的一种或几种。其中，铵盐甲醇水溶液中铵盐水溶液的浓度为0.55～3g/L，采用盐酸调节pH值为2.5～3.5。所述铵盐甲醇水溶液中，铵盐水溶液与甲醇加入的体积之比为55:45～65:35。最后，分别取盐酸阿莫罗芬储备溶液、干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ的混合储备溶液，加入含45～55％甲醇的水溶液溶解并定容，配成单一浓度或一系列不同浓度的对照品溶液。
1.2色谱条件
高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；检测波长：210～220nm；流速：0.8～1.2ml/min；流动相：铵盐甲醇水溶液-甲醇，其中，A相为0.55～3g/L铵盐水溶液(盐酸调节pH值至2.5～3.5)-甲醇(铵盐水溶液与甲醇的体积比为55:45～65:35)，B相为甲醇；分析时间：30min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为(见表2)：
0-5min，A相：B相体积比为55：45-55：45；
5-12min，A相：B相体积比为55：45-50：50；
12-24min，A相：B相体积比为50：50-15：85；
24-25min，A相：B相体积比为15：85-55：45；
25-30min，A相：B相体积比为55：45-55：45。
高效液相色谱法还包括有以下色谱条件：柱温：30～40℃；进样量：5～40μl。铵盐甲醇水溶液中的铵盐选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三乙胺、碳酸铵或碳酸氢铵中的一种或几种。高效液相色谱法分析结果见图2-4。
1.3测定
采用外标法，先配制一定浓度的混合对照品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，再将获得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间定性，色谱峰面积定量，即得供试品溶液中盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分的含量。
2、结果与讨论
将上述1.1制备一定浓度的对照品溶液，根据1.2的高效液相色谱条件进行测定，采用高效液相色谱仪进样分析，绘制标准工作曲线，该标准工作曲线的线性良好。同时，进行对照品溶液的加样回收率试验，其测定结果的回收率良好，符合要求。
按上述1.1制备的供试品溶液，在上述1.2确认的HPLC条件进行测定其方法精密度、中间精密度、稳定性试验，测定结果的精密度良好，并能在72h内保持稳定。
取盐酸阿莫罗芬实际样品按上述1.1和1.2的条件处理并测定，能够准确测定出盐酸阿莫罗芬样品中盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分的含量。
实施例2
1、实验部分
1.1样品前处理
供试品溶液的制备：精密称取盐酸阿莫罗芬乳膏样品3g，置25ml量瓶中，加入含0.5％磷酸的甲醇溶液15ml进行振荡摇晃20min，盐酸阿莫罗芬乳膏样品加入的质量(g)，与含磷酸的甲醇溶液加入的体积(ml)之比为3:15。然后，在50℃水浴超声15分钟，冷却至20～25℃，用纯水稀释至刻度定容，再摇匀、冷冻离心、过滤，取续滤液作为供试品溶液。其中，冷冻离心的条件为：离心温度为0℃；离心时间为15～30min；离心转速为8000～14000rpm。过滤为0.45μm滤膜过滤。
对照品溶液的制备：称取盐酸阿莫罗芬对照品，置入量瓶中，加入铵盐甲醇水溶液与甲醇的混合溶液，配成盐酸阿莫罗芬储备溶液，盐酸阿莫罗芬储备溶液中，盐酸阿莫罗芬的浓度为0.167mg/ml。分别称取干扰物Ⅰ对照品和干扰物Ⅱ对照品，置入量瓶中，加入铵盐甲醇水溶液与甲醇的混合溶液，配成干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ的混合储备溶液，干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ的混合储备溶液中，干扰物Ⅰ的浓度为0.63mg/ml，干扰物Ⅱ的浓度为0.49mg/ml。上述使用的铵盐甲醇水溶液与甲醇的混合溶液，铵盐甲醇水溶液与甲醇加入的体积之比为1:4，铵盐甲醇水溶液中的铵盐为三乙胺。其中，铵盐甲醇水溶液中铵盐水溶液的浓度为2.3g/L，采用盐酸调节pH值为3.0。所述铵盐甲醇水溶液中，铵盐水溶液与甲醇加入的体积之比为60:40。最后，分别取盐酸阿莫罗芬储备溶液、干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ的混合储备溶液，置同一100ml量瓶中，加入含50％甲醇的水溶液溶解并定容、摇匀，配成单一浓度的对照品溶液。
1.2色谱条件
高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；检测波长：214nm；流速：1.0ml/min；流动相：铵盐甲醇水溶液-甲醇，其中，A相为2.3g/L铵盐水溶液(盐酸调节pH值至3.0)-甲醇(铵盐水溶液与甲醇的体积比为60:40)，B相为甲醇；分析时间：30min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为(见表2)：
0-5min，A相：B相体积比为55：45-55：45；
5-12min，A相：B相体积比为55：45-50：50；
12-24min，A相：B相体积比为50：50-15：85；
24-25min，A相：B相体积比为15：85-55：45；
25-30min，A相：B相体积比为55：45-55：45。
高效液相色谱法还包括有以下色谱条件：柱温：35℃；进样量：10μl。铵盐甲醇水溶液中的铵盐为三乙胺。高效液相色谱法分析结果见图2。
1.3测定
采用外标法，先配制一定浓度的混合对照品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，再将获得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间定性，色谱峰面积定量，即得供试品溶液中盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分的含量。
2、结果与讨论
2.1盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分含量测定方法的线性关系
精密称取上述1.1的对照品溶液适量，分别用50％甲醇稀释1倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍，制成一系列浓度的混合对照品溶液，采用1.2的HPLC检测条件，进行高效液相色谱仪分析，测定并计算获得对照品溶液中盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分的标准回归方程、相关系数和线性范围。具体结果见表3。
表3线性回归方程
项目 回归方程 R2 范围/(μg)
盐酸阿莫罗芬 A＝2E+06X-28447 0.9999 0.016～2.76
干扰物Ⅰ A＝1E+06X+1063.6 0.9993 0.019～0.19
干扰物Ⅱ A＝2E+06X+8824.1 0.9999 0.018～0.19
注：A为峰面积，X为浓度
根据表3可知，标准回归方程以色谱峰面积为纵坐标(A)，成分浓度为横坐标(X)，同时，对照品溶液中盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分在一定浓度的线性范围内均呈良好的线性关系，其标准回归方程的R2均大于0.9990。
2.2回收率
精密称取空白乳膏基质30g于25ml容量瓶中，分别准确加入一定含量的盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分，具体按照样品含量的80％、100％、120％倍加入，每个浓度3份。并按1.1进行前处理，依1.2的色谱条件进样测定，结果见表4。
由表4可知，高、中、低三个浓度盐酸阿莫罗芬加样平均回收率在97～99％之间，RSD＜2％；干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ加样平均回收率在89～96％之间，RSD＜2％，符合要求，其测定结果的回收率良好。
表4加样回收率结果
2.3方法精密度
取同一批盐酸阿莫罗芬乳膏样品6份，按上述1.1进行供试品溶液前处理并进样测试，测定并计算盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分峰面积及含量，精密度具体结果见表5。结果表明，盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分的相对峰面积RSD小于2％，含量平均值为100.70％，说明该方法的精密度良好。
表5精密度考察结果
2.4中间精密度
不同操作人员不同天取以上同一批盐酸阿莫罗芬乳膏样品6份，按上述1.1进行供试品溶液前处理，并在上述1.2的色谱条件下在不同仪器和不同色谱柱上进样分析，测定并计算盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分峰面积及含量，具体结果见表6。结果表明，盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分的相对峰面积RSD小于2％，说明该方法重复性良好。不同操作人员和不同仪器上，含量平均值为100.01％。不同时间和不同操作人员不同仪器含量平均值差值为0.31％，说明方法精密度良好。
表6中间精密度考察结果
2.5稳定性
精密称取上述1.1的对照品溶液，其中盐酸阿莫罗芬的浓度为0.3mg/ml，干扰物Ⅰ的浓度为6.3μg/ml，干扰物Ⅱ的浓度为4.9μg/ml。按上述1.2的色谱条件，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h、72h进样测定，测定并计算盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分的峰面积，具体结果见表7。如表7可知，盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分的峰面积RSD小于3％，说明该方法在72h内稳定性良好。
表7稳定性考察结果
所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：称取盐酸阿莫罗芬乳膏样品，加入含磷酸的甲醇溶液混合后，超声提取、冷却、定容，再摇匀、冷冻离心、过滤，取续滤液作为供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：取盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ的对照品，加入溶剂溶解并定容，摇匀，得到对照品溶液，其中，
所述干扰物Ⅰ为4-[3-[4-(1,1-dimethylpropyl)-phenyl]-2-methylpropyl]-2,6-dimethylmorpholine 4-oxide，
所述干扰物Ⅱ为N-[2-(acetyloxy)propyl]-N-[3-[4-(1,1-dimethylpropyl)phenyl]-2-methylpropyl]-formamide；
3)检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中盐酸阿莫罗芬、干扰物Ⅰ、干扰物Ⅱ成分的含量。
2.根据权利要求1所述的一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，其特征在于，步骤1)中，所述盐酸阿莫罗芬乳膏样品加入的质量g，与含磷酸的甲醇溶液加入的体积ml之比为3:14～3:16；所述含磷酸的甲醇溶液为含体积百分比0.4～0.6％磷酸的甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述的一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，其特征在于，步骤1)中，还包括以下条件中任一项或多项：
A1)所述混合是采用涡旋仪进行振荡摇晃15～25min；
A2)所述超声提取的条件为：超声温度为45～55℃，超声时间为10～20min；
A3)所述冷冻离心的条件为：离心温度：-5～0℃；离心时间为15～30min；离心转速为8000～14000rpm。
4.根据权利要求1所述的一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，其特征在于，步骤2)中，所述对照品溶液的制备，包括以下步骤：
A)取盐酸阿莫罗芬对照品，加入溶剂溶解并定容，配制盐酸阿莫罗芬储备溶液；
B)分别取干扰物Ⅰ对照品和干扰物Ⅱ对照品，加入溶剂溶解并定容，配制干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ的混合储备溶液；
C)再取步骤A)中的盐酸阿莫罗芬储备溶液、步骤B)中的干扰物Ⅰ和干扰物Ⅱ的混合储备溶液，加入甲醇水溶液溶解并定容，配制为对照品溶液。
5.根据权利要求4所述的一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，其特征在于，步骤A)或B)中，所述溶剂为铵盐甲醇水溶液与甲醇的混合溶液；所述铵盐甲醇水溶液与甲醇加入的体积之比为1:3～1:5。
6.根据权利要求5所述的一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，其特征在于，所述铵盐甲醇水溶液，还包括以下条件中任一项或多项：
B1)所述铵盐甲醇水溶液中的铵盐选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三乙胺、碳酸铵或碳酸氢铵中的一种或几种；
B2)所述铵盐甲醇水溶液中铵盐水溶液的浓度为0.55～3g/L；
B3)所述铵盐甲醇水溶液中铵盐水溶液的pH值为2.5～3.5；
B4)所述铵盐甲醇水溶液中，铵盐水溶液与甲醇加入的体积之比为55:45～65:35。
7.根据权利要求4所述的一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，其特征在于，步骤C)中，所述甲醇水溶液为含体积百分比45～55％甲醇的水溶液。
8.根据权利要求1所述的一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，其特征在于，步骤3)中，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；检测波长：210nm～220nm；流速：0.8～1.2ml/min；流动相：铵盐甲醇水溶液-甲醇，其中，A相为0.55～3g/L铵盐水溶液-甲醇，铵盐水溶液中盐酸调节pH值至2.5～3.5，铵盐水溶液与甲醇的体积比为55:45～65:35，B相为甲醇；分析时间：30min；梯度洗脱。
9.根据权利要求8所述的一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-5min，A相：B相体积比为55：45-55：45；
5-12min，A相：B相体积比为55：45-50：50；
12-24min，A相：B相体积比为50：50-15：85；
24-25min，A相：B相体积比为15：85-55：45；
25-30min，A相：B相体积比为55：45-55：45。
10.根据权利要求8所述的一种盐酸阿莫罗芬及其干扰物的测定方法，其特征在于，所述铵盐甲醇水溶液中的铵盐选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、三乙胺、碳酸铵或碳酸氢铵中的一种或几种。
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