CN101372503B

CN101372503B - 从羽毛中提取角蛋白的方法

Info

Publication number: CN101372503B
Application number: CN2008101506532A
Authority: CN
Inventors: 王荣民; 李芳莹; 何玉凤; 贾如琰
Original assignee: Northwest Normal University
Current assignee: Northwest Normal University
Priority date: 2008-08-06
Filing date: 2008-08-06
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2028-08-06
Also published as: CN101372503A

Abstract

本发明提供了一种从羽毛中提取角蛋白的方法，该方法是将干净的羽毛粉碎后经过乙醇、盐酸预处理之后，采用巯基乙醇还原法还原得到羽毛角蛋白溶液，然后经酸沉、洗涤、干燥，得到干净的土白色角蛋白固体粉末。通过紫外-可见光谱、红外光谱、SDS-凝胶电泳以及元素分析等方法对提取的角蛋白进行了分析与表征。结果发现：本发明提取的角蛋白中主要元素为C、H、N、O、S，其总量在99％以上，纯度较高；角蛋白分子量主要分布在5～20kD以及40～80kD。

Description

从羽毛中提取角蛋白的方法

技术领域

本发明属于高分子技术领域，涉及一种角蛋白的提取方法，尤其涉及一种从废弃羽毛中提取角蛋白的方法。

背景技术

角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于生物体的组织结构中。包括皮肤以及皮肤的衍生物：发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、喙、丝等。作为一种天然高分子材料，角蛋白不仅来源丰富，价格低廉，且具有一些良好的特殊性能，可被广泛应用，具有很好的经济效益与发展前景。例如，角蛋白水解产物可作为动物饲料的添加剂；其改性产物对皮革，橡胶等进行填充，可制备性能优良的皮革及橡胶产品；在角蛋白溶液中添加具有特殊功能的粉体，可以生产具有特殊功能的再生纤维。角蛋白作为一种天然的蛋白质，具有非常好的生物相容性和细胞亲和性，具有一定的力学性能、可加工，最主要的是具有生物可降解性，作为生物医用高分子材料将具有良好的发展前景。

但是在通常情况下，角蛋白分子内的二硫键、氢键和离子键等空间横向联键使肽链内部和相邻肽链之间发生交联，形成立体网状结构，使天然角蛋白质在水或其它许多溶剂中都不能溶解，且表现出很强的韧性和机械强度，给角蛋白的提取与利用带来困难。

常用的角蛋白的提取方法有机械法、化学法和微生物降解法。机械法主要是通过加热加压的方法，使角蛋白分子间甚至分子内的双硫键断裂水解，从而得到可溶性的角蛋白。如：郭素华等用加热高压膨化方法使角蛋白分子中的S-S键断裂来提取角蛋白，该法效率较高，但需要加压，且获得的角蛋白分子量不高，一般为多肽化混合物。微生物降解法是利用微生物的角蛋白酶，在相对温和的条件下将角蛋白水解为氨基酸和多肽，产品纯度高且可节约能源，但过程较为烦琐，鲜有实际应用。化学法又可分为酸碱水解法、氧化法、还原法等。化学法也可与其它方法结合使用。由于各种化学方法的作用原理不同，得到的角蛋白的产率和分子量也不同。酸碱水解法就是在酸或碱存在的条件下，破坏角蛋白分子中的二硫键增大角蛋白的溶解度，从而获得可溶性角蛋白的方法。例如：尹国强利用亚硫酸氢钠溶液对羽毛进行预处理，采用氢氧化钠溶液水解羽毛制得可溶性羽毛蛋白，最佳条件下收率为65.7％。该方法一般在短时间内可获得分子量较大的角蛋白，可是角蛋白的收率偏低；而在较长时间下又容易使得角蛋白分子中的肽键发生断裂，获得的产品分子量较低，制得的可溶性角蛋白产品收率越高则其分子量会越小。氧化法的基本原理是使用氧化剂把角蛋白中的二硫键氧化成磺酸基，从而获得可溶性角蛋白。例如，R.J凯利等用Na₂SO₃磺化和氢氧化铜铵氧化，使胱氨酸基转化为S-硫代半胱氨酸，同时采用温和的重力进料过滤系统离心分离凝胶状角蛋白。该法在氧化过程中，不可避免的会出现肽链氧化断裂的现象，因此氧化法所获得的角蛋白平均分子量不高。还原法是利用还原剂将角蛋白分子中的二硫键还原成巯基，从而获得可溶性角蛋白的基本方法。选用适当的还原剂，使其只作用于二硫键而不破坏肽键，可以使角蛋白保持较高的分子量。例如，王开利等人采用组合还原剂处理、碱提取的方法得到的羊毛角蛋白原液，主要分子量分布在40-80KD。张志等人采用尿素溶解法溶解废弃羊毛，得到的原液虽然有较高的分子量，但经氧化交联后的固体产率不高，且产物颜色同原料，也就是产物纯度不高。以上还原法均是对羊毛进行处理，得到羊毛角蛋白溶液。

羽毛是一种性能优良的蛋白质材料，然而众多的家禽养殖企业却将其作为副产物随意丢弃，造成了严重的资源浪费，同时也给环境带来了很大压力。因此，对丰富、廉价的羽毛的利用具有很好的经济效益和环境效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种从废弃羽毛中提取角蛋白的方法。

本发明从羽毛中提取角蛋白的方法，包括以下工艺步骤：

①乙醇预处理

将干净的羽毛粉碎后置于反应器中，加入羽毛粉末质量30～50倍量、浓度为75％～95％的乙醇，在20～80℃搅拌1～6h，过滤，然后依次用75％～95％的乙醇、蒸馏水分别洗涤，得脱脂羽毛；

②盐酸预处理

将脱脂羽毛置于反应器中，先加入脱脂羽毛质量0.8～1.4倍量、浓度36～38％的盐酸，再加入脱脂羽毛质量10～30倍量、浓度为75％～95％的工业乙醇及脱脂羽毛质量30～50倍量的蒸馏水，在20～100℃搅拌1～6h；过滤，并用蒸馏水洗涤数次，冷冻干燥后得盐酸预处理羽毛；

③巯基乙醇还原

将盐酸预处理羽毛置于反应器中，分别加入脱脂羽毛质量30～50倍量的蒸馏水、0.03～0.08倍量的Tris(三羟甲基氨基甲烷)、0.8～1.2倍量的SDS(十二烷基硫酸钠)、1～3倍量的尿素、0.2～1.2倍量的巯基乙醇，通氮气保护，于20～100℃搅拌1～6h；过滤，收集滤渣和滤液；滤液即为角蛋白溶液；

④角蛋白沉淀

将滤液用浓盐酸调节pH至2.0～5.0，滤液中出现大量沉淀；过滤，用蒸馏水洗涤，以除去其中未反应的原料；干燥，得到纯净的土白色羽毛角蛋白粉末。

下面通过紫外-可见光谱，红外光谱，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、热重分析以及元素分析对本发明提取的角蛋白的结构、分子量及元素含量进行表征。

1、紫外-可见光谱分析

将角蛋白溶解在碱性溶液(稀NaOH)中，采用双光束紫外可见分光光度计(TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司)，测定其紫外-可见吸收光谱图。测定结果发现：角蛋白在289nm、239nm处有吸收峰。其中，289nm处的吸收是由于色氨酸残基和酪氨酸残基特征吸收发生迁移所致；239nm处的吸收是苯丙氨酸的特征吸收峰。由此可知，角蛋白中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。

2红外光谱分析

采用红外光谱扫描仪(FTS3000，美国DigiLAB Merlin)；测定本发明提取的角蛋白的红外光谱，并进行数据分析，发现3293cm^-1出现O-H伸缩振动强吸收峰；3082cm^-1出现不饱和烃中＝C-H伸缩振动吸收峰；2970cm^-1出现-CH₃反对称C-H伸缩振动；2866cm^-1出现-CH₃对称C-H伸缩振动；2935cm^-1出现-CH₂-伸缩振动。582cm^-1出现二硫键S-S伸缩振动吸收；711cm^-1出现酰胺键中-N-H面外弯曲振动；879cm^-1出现不饱和烃上C-H伸缩变形振动；1055cm-¹出现酰胺键的C-N伸缩振动；1240cm^-1出现羧基中的C-O伸缩振动；1460cm-¹出现-CH₂-的变形振动；1548cm^-1出现酰胺键(仲酰胺)的(C＝O)伸缩振动；1662cm^-1出现酰胺键(伯酰胺)的(C＝O)伸缩振动。可以看出，角蛋白中存在蛋白的特征官能团肽键的吸收，且由582cm^-1处的吸收可知角蛋白中存在较多的二硫键。

3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用电泳仪(DYY-12C型，北京六一仪器厂)，并应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对角蛋白的分子量及分子量分布进行了考察，发现角蛋白分子量主要分布在5kD～20kD，同时在40kD～80kD也有少量分布，而且基本呈线性分布。

4、热重分析

对本发明提取的角蛋白进行热重分析，发现其具有良好的热稳定性，240℃以下不发生变化。

5、元素分析及X射线荧光光谱分析

用元素分析仪(GmbH VarioEL型，德国产)及X射线荧光光谱仪对提取的角蛋白进行元素含量分析。分析结果可知：本发明提取的角蛋白中主要元素为C、H、N、O、S，其总量在99％以上，纯度较高。其中C：53.01％～53.04％、H：7.72％～7.76％、O：21.19％～21.21％、N：12.91％～12.93％、S：4.27％～4.29％。角蛋白中主要元素的摩尔比大约为C∶H∶O∶N∶S＝33∶58∶10∶7∶1。

本发明方法提取的角蛋白的收率高，可达到90％。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明采用废弃羽毛为原料，选择乙醇盐酸预处理/巯基乙醇还原复合溶解法提取角蛋白，提取时间短，成本低；且提取的角蛋白更纯净，含杂质少；同时，由于预处理的鸡毛在碱性缓冲液中溶解时间较短，减少了先溶解的角蛋白分子的水解，更能保证角蛋白有较高的分子量。

2、在还原阶段加入表面活性剂十二烷基硫酸钠，可以对溶解的角蛋白进行封底，阻止二硫键的再次生成，防止其二次氧化；也可减少分子间作用力，防止溶解的角蛋白交联、团聚。

3、本方法在缩短盐酸预处理时间的同时能更好地洗脱有机杂质，增大角蛋白分子的溶解性，使角蛋白溶液容易过滤，提高收率与纯度，且有较高的分子量。

4、角蛋白固体的收率高，基本稳定在90％左右。

具体实施方式

图1为本发明提取角蛋白的工艺流程图

实施例1

乙醇预处理：将3g干净的羽毛粉末置于圆底烧瓶中，加入100mL 95％的乙醇，在60℃搅拌2h；过滤后用95％的乙醇、蒸馏水分别洗涤数次，得脱脂羽毛。

盐酸预处理：将脱脂羽毛置于烧瓶中，加入4mL，38％的浓盐酸，再加入100mL，95％的工业乙醇和150mL蒸馏水，在70℃搅拌1h；过滤，并用蒸馏水洗涤数次，干燥后得盐酸处理羽毛。

巯基乙醇还原：将盐酸预处理的羽毛置于三颈烧瓶中，加入150mL蒸馏水、Tris 0.1g、SDS 3g、尿素 7g、巯基乙醇 1mL，通氮气保护，在50℃搅拌3h。然后将未溶解的羽毛渣过滤，分别收集滤渣和滤液。

角蛋白沉淀：将滤液(角蛋白溶液)用38％浓盐酸调节pH至3.0，出现大量沉淀；将此沉淀过滤后用蒸馏水洗涤数次以除去其中未反应的原料；最后将洗干净的角蛋白沉淀收集并冷冻干燥，得到纯净的土白色羽毛角蛋白粉末。角蛋白的收率90％。

经测定，本实施例提取的角蛋白中主要元素为C、H、N、O、S，其总量在99％以上，纯度较高。其中C：53.04％、H：7.76％、O：21.19％、N：12.91％、S：4.27％，分子量主要分布在5kD～20kD和40～80kD。

实施例2

乙醇预处理：将3g干净的羽毛粉末置于圆底烧瓶中，加入100mL95％的乙醇，在70℃搅拌1h；过滤后用95％的乙醇、蒸馏水分别洗涤数次，得脱脂羽毛。

盐酸预处理：将脱脂羽毛置于烧瓶中，加入6mL，36％的浓盐酸，再加入100mL，95％的工业乙醇和150mL蒸馏水，在70℃搅拌1h；过滤，并用蒸馏水洗涤数次，干燥后得盐酸处理羽毛。

巯基乙醇还原：将盐酸预处理的羽毛置于三颈烧瓶中，加入蒸馏水150mL、Tris0.1g、SDS3g、尿素7g、巯基乙醇1mL，通氮气保护，在50℃搅拌3h；过滤，分别收集滤渣和滤液。

角蛋白沉淀：将滤液(角蛋白溶液)用36％的浓盐酸调节pH至3.0，出现大量沉淀，将此沉淀过滤后用蒸馏水洗涤数次以除去其中未反应的原料；最后将洗干净的角蛋白沉淀收集并冷冻干燥，得到纯净的土白色羽毛角蛋白粉末。角蛋白的收率87％。

经测定，本实施例提取的角蛋白中主要元素为C、H、N、O、S，其总量在99％以上，纯度较高。其中C：53.02％、H：7.74％、O：21.21％、N：12.91％、S：4.29％，分子量主要分布在5kD～20kD和40～80kD。

实施例3

乙醇预处理：将5g干净的羽毛粉末置于圆底烧瓶中，加200mL95％的乙醇，在70℃搅拌1h；过滤，然后用95％的乙醇、蒸馏水分别洗涤数次，得脱脂羽毛。

盐酸预处理：将上述脱脂羽毛置于烧瓶中，加入10mL，38％的浓盐酸，再加入130mL，95％的工业乙醇和250mL蒸馏水，在70℃搅拌1h；然后将羽毛重新过滤，并用蒸馏水洗涤数次，干燥后得盐酸处理羽毛。

巯基乙醇还原：将盐酸预处理的羽毛装入三颈烧瓶中，加入蒸馏水 250mL、Tris 0.2g、SDS 5g、尿素 12g、巯基乙醇 5mL，通氮气保护，在50℃搅拌1h；然后将未溶解的羽毛渣过滤，分别收集滤渣和滤液。

角蛋白沉淀：将滤液(角蛋白溶液)用38％的浓盐酸调节pH至3.0，出现大量沉淀；将此沉淀过滤后用蒸馏水洗涤数次以除去其中未反应的原料；最后将洗干净的角蛋白沉淀收集并冷冻干燥，得到纯净的土白色羽毛角蛋白粉末。角蛋白的收率88％。

经测定，本实施例提取的角蛋白中主要元素为C、H、N、O、S，其总量在99％以上，纯度较高。其中C：53.04％、H：7.73％、O：21.20％、N：12.93％、S：4.28％，分子量主要分布在5kD～20kD和40～80kD。

实施例4

乙醇预处理：将5g干净的羽毛粉末置于圆底烧瓶中，加入200mL95％的乙醇，在70℃搅拌1h。将乙醇预处理过的羽毛过滤，然后用95％的乙醇、蒸馏水分别洗涤数次，得脱脂羽毛。

盐酸预处理：将此脱脂羽毛置于烧瓶中，加入10mL，36％的浓盐酸，再加入130mL，95％的工业乙醇和250mL蒸馏水，在70℃搅拌1h；然后将羽毛重新过滤，并用蒸馏水洗涤数次，干燥后得盐酸处理羽毛。

巯基乙醇还原：将盐酸预处理的羽毛置于三颈烧瓶中，加入蒸馏水 250mL、Tris 0.2g、SDS 5g、尿素 12g、巯基乙醇 5mL，通氮气保护，在70℃搅拌1h。然后将未溶解的羽毛渣过滤，分别收集滤渣和滤液。

角蛋白沉淀：将滤液(角蛋白溶液)用浓盐酸调节pH至3.0，出现大量沉淀；将此沉淀过滤后用蒸馏水洗涤数次以除去其中未反应的原料；最后将洗干净的角蛋白沉淀收集并冷冻干燥，得到纯净的土白色羽毛角蛋白粉末。角蛋白的收率：90％。

经测定，本实施例提取的角蛋白中主要元素为C、H、N、O、S，其总量在99％以上，纯度较高。其中C：53.02％、H：7.74％、O：21.20％、N：12.92％、S：4.27％，分子量主要分布在5kD～20kD和40～80kD。

实施例5

乙醇预处理：将5g干净的羽毛粉末置于圆底烧瓶中，加入200mL 95％的乙醇，在40℃搅拌1h。将乙醇预处理过的羽毛过滤，然后用95％的乙醇、蒸馏水分别洗涤数次，得脱脂羽毛。

盐酸预处理：将此脱脂羽毛装入烧瓶中，加入10m，36％的浓盐酸，再加入130mL，95％的工业乙醇和250mL蒸馏水，在70℃搅拌1h；然后将羽毛重新过滤，并用蒸馏水洗涤数次，干燥后得盐酸处理羽毛。

巯基乙醇还原：将盐酸预处理的羽毛装入三颈烧瓶中，加入蒸馏水 250mL、Tris 0.2g、SDS 5g、尿素 12g、巯基乙醇 5mL，通氮气保护，在70℃搅拌1h；然后将未溶解的羽毛渣过滤，分别收集滤渣和滤液。

角蛋白沉淀：将滤液(角蛋白溶液)用浓盐酸调节pH至3.0，出现大量沉淀，将此沉淀过滤后用蒸馏水洗涤数次以除去其中的原料，最后将洗干净的角蛋白沉淀收集并冷冻干燥，得到纯净的土白色羽毛角蛋白粉末。角蛋白的收率：90％。

经测定，本实施例提取的角蛋白中主要元素为C、H、N、O、S，其总量在99％以上，纯度较高。其中C：53.02％、H：7.76％、O：21.21％、N：12.91％、S：4.29％，分子量主要分布在5kD～20kD和40～80kD。

Claims

1.一种从羽毛中提取角蛋白的方法，包括以下工艺步骤：

①乙醇预处理

将干净的羽毛粉碎后置于反应器中，加入羽毛粉末质量30～50倍量、浓度为75％～95％的乙醇，在40～70℃搅拌1h，过滤，然后依次用75％～95％的乙醇、蒸馏水分别洗涤，得脱脂羽毛；

②盐酸预处理

将脱脂羽毛置于反应器中，先加入脱脂羽毛质量0.8～1.4倍量、浓度为36％～38％的盐酸，再加入脱脂羽毛质量10～30倍量、浓度为75％～95％的工业乙醇及脱脂羽毛质量30～50倍量的蒸馏水，在70℃搅拌1h；过滤，并用蒸馏水洗涤，干燥后得盐酸预处理羽毛；

③巯基乙醇还原

将盐酸预处理羽毛置于反应器中，分别加入脱脂羽毛质量30～50倍量的蒸馏水、0.03～0.08倍量的三羟甲基氨基甲烷、0.8～1.2倍量的十二烷基硫酸钠、1～3倍量的尿素、0.2～1.2倍量的巯基乙醇，通氮气保护，于50～70℃搅拌1～3h；过滤，收集滤渣和滤液；滤液即为角蛋白溶液；

④角蛋白沉淀

将滤液用浓盐酸调节pH至3.0，滤液中出现大量沉淀；过滤，用蒸馏水洗涤，干燥，得到纯净的土白色羽毛角蛋白粉末。

2.如权利要求1所述从羽毛中提取角蛋白的方法，其特征在于：步骤④所述干燥为冷冻干燥。