ES2965640T3

ES2965640T3 - Reactivos de pretratamiento genéricos para determinaciones de analitos

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Publication number: ES2965640T3
Application number: ES18712248T
Authority: ES
Inventors: Eloisa Lopez-Calle; Ewelina Hegel; Thomas Fischer; Caroline Bylda; Hans-Peter Josel; Josef Roedl
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-03-28
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2038-03-27
Also published as: WO2018178068A1; JP2020512555A; JP7112423B2; CN110494753A; EP3602073B1; US11391655B2; EP3602073A1; CN110494753B; US20200003666A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método in vitro para liberar analitos de una muestra que comprende poner en contacto dicha muestra con (i) un agente caotrópico, (ii) un disolvente orgánico, (iii) un detergente y (iv) al menos un agente que proporciona bicarbonato. iones. La presente invención se refiere además a un agente de liberación para liberar analitos de una muestra que comprende los compuestos antes mencionados. Además, la presente invención se refiere a usos, kits, métodos y dispositivos relacionados con el método y el agente de liberación de la presente invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Reactivos de pretratamiento genéricos para determinaciones de analitos

La presente divulgación se refiere a un procedimientoin vitropara liberar analitos de una muestra que comprende poner en contacto dicha muestra con (i) un agente caotrópico, (ii) un disolvente orgánico, (iii) un detergente y (iv) al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato. La presente divulgación se refiere además a un agente de liberación para liberar analitos de una muestra que comprende los compuestos mencionados anteriormente. Además, la presente divulgación se refiere a usos, kits, procedimientos y dispositivos relacionados con el procedimiento y el agente de liberación de la presente invención.

Los procedimientos de diagnósticoin vitro(DIV) típicamente requieren una etapa de preparación de muestra antes de realizar el análisis propiamente dicho. La preparación de muestra puede implicar varias funciones, como liberación de analito de la matriz de muestra, hemólisis en casos en los que los analitos están atrapados dentro de los eritrocitos (por ejemplo, fármacos inmunodepresores) y posiblemente el enriquecimiento en analito con analitos de baja abundancia. Otra función importante de la etapa de preparación de muestra es la retirada de la matriz de muestra para evitar interferencias; en particular, la sangre y las muestras derivadas de sangre consisten en una mezcla altamente concentrada y compleja de proteínas (albúminas, inmunoglobulinas) y otras biomoléculas que pueden dar lugar a problemas en el análisis posterior, por ejemplo, obstrucción o taponamiento de las columnas de cromatografía, lo que reduce su vida útil (Fureyet al.(2013) Talanta 115: 104), "ahogamiento" o supresión de señales de EM de los analitos de baja abundancia, y similares.

La espectrometría de masas (EM), en particular, espectrometría de masas en tándem con cromatografía de líquidos (CL-EM/EM), se ha vuelto el procedimiento de elección para la cuantificación de analitos en el diagnósticoin vitro.Especialmente en el caso de la determinación de moléculas pequeñas que tienen metabolitos de estructura similar, la especificidad y exactitud de la EM se ha vuelto crucial para la generación de resultados fiables. Los ejemplos de dichas moléculas pequeñas son vitaminas como 25-hidroxi-vitamina D3, esteroides como testosterona, y fármacos inmunodepresores como ciclosporina A y everólimus. La 25-hidroxi-vitamina D3 y testosterona se determinan a partir de muestras de suero o plasma. En el caso de fármacos inmunodepresores, la matriz recomendada es sangre completa, puesto que estos analitos están altamente unidos a los eritrocitos (Al-Jenoobi, FI (2016), Austin Chromatography 3:1039; Sallustio, BC (2010), Bioanalysis 2:1141), lo que requiere, por tanto, una etapa de hemólisis antes de su cuantificación. Para la 25-hidroxi-vitamina D3, testosterona, ciclosporina A y everólimus, también se sabe que estos analitos se unen a proteínas de la matriz en la muestra y requieren la liberación de las proteínas de la matriz antes de la cuantificación: por ejemplo, de ciclosporina A ("Personalized Immunosuppression in transplantation: role of biomarker monitoring and therapeutic drug monitoring", Oellerich y DasGupta (2016): Elsevier, Ámsterdam) en la sangre, un 50 - 70 % se unen a los eritrocitos, y de la ciclosporina A encontrada en plasma, un 98 % se une a lipoproteínas, mientras que solo un 2 % se encuentra libre en plasma. De forma similar, de everólimus (Oellerich y DasGupta,loc. cit.)en la sangre, aprox. un 75 % se une a los eritrocitos y, del everólimus encontrado en plasma, un 75 % se une a las proteínas plasmáticas, mientras que un 25 % se encuentra libre en plasma. La 25-hidroxi-vitamina D3 y testosterona se unen prácticamente de forma exclusiva a la proteína de unión a vitamina D y a la globulina de unión a hormonas sexuales, respectivamente (instrucciones de uso para el ensayo de Elecsys, vitamina D total (11-2014, V 5.0); Rommerts f Fg (2004): "Testosterone: an overview of biosynthesis, transport, metabolism and non-genomic actions"; en: Nieschlag, E, Behre, HM (eds.): Testosterone action, deficiency, substitution, 3.a edición, Cambridge, Cambridge University Press, 1-38.).

La etapa de preparación de muestra, incluyendo el reactivo de pretratamiento de muestra, es la primera y la más crítica parte del desarrollo del procedimiento en el análisis por CL-EM/EM y otros procedimientos/ensayos de cuantificación de DIV, ya que tiene un impacto directamente sobre la exactitud del procedimiento analítico (10). El procedimiento de pretratamiento más popular del estado de la técnica es el tratamiento de las muestras (suero, plasma o sangre completa) con disolventes orgánicos como metanol o acetonitrilo, a veces también con sales de sulfato como ZnSO4 como aditivo auxiliar para la precipitación, induciendo una liberación de analito de la matriz de muestra y, al mismo tiempo, la retirada de componentes de la matriz por precipitación (Sallustio, BC,loc. cit.;Gomeset al.(2013), Bioanalysis 5: 3063; instrucciones de uso para el ensayo de Elecsys: ciclosporina (06-2013, V 1.0), everólimus (11-2015, V 1.0), sirólimus (12-2015, V 1.0), tacrólimus (11-2014, V 3.0) y su reactivo de pretratamiento Is D (10-2014, V 3.0); Sadjadi S (2013), Chromatography Today, noviembre/diciembre:20). Sin embargo, estos procedimientos requieren la retirada de un precipitado y, por lo tanto, no son compatibles con algunas aplicaciones posteriores, por ejemplo, enriquecimiento con microesferas para CL-EM/EM; además, el disolvente orgánico puede inhibir la captura del analito por las microesferas. Por tanto, los procedimientos de CL-EM/EM con enriquecimiento con microesferas típicamente requieren soluciones de base acuosa para los análisis previos. Se proporcionan idealmente reactivos de pretratamiento usados para la preparación de muestra en un flujo de trabajo de enriquecimiento con microesferas como soluciones estables y listas para usar. Estas soluciones se pueden colocar a bordo del instrumento durante un largo periodo de tiempo, ofreciendo un flujo de trabajo que no necesita interacciones del usuario. Sin embargo, el uso de reactivos como liofilizado es necesario cuando están implicados reactivos químicamente inestables, lo que entorpece el flujo de trabajo al requerir etapas de manipulación manual para su reconstitución, puesto que las etapas de manipulación manual generan costes adicionales y también proporcionan fuentes de errores. Además, el reactivo reconstituido típicamente muestra un breve periodo de validez y se tiene que reemplazar por soluciones recién preparadas.

Algunos procedimientos de pretratamiento usan saponificación para la liberación de analito de la matriz (instrucciones de uso para el ensayo de Elecsys, vitamina D total (11-2014, V 5.0); Gomeset al., loc. cit.),y consisten en mezclar la muestra con una solución de hidróxido de potasio o sodio. Este procedimiento de pretratamiento, a menudo, implica la adición de un reactivo reductor como el ditiotreitol (DTT) para abrir puentes disulfuro en las proteínas de la matriz que se van a desplegar. Una ventaja aquí es que la desnaturalización de las proteínas de la matriz tiene lugar sin la formación de ningún precipitado. Sin embargo, puesto que el reactivo reductor normalmente no es químicamente estable en soluciones alcalinas, se tienen que proporcionar dos componentes separados, por ejemplo, DTT y NaOH. La consecuencia es que se requiere más espacio en el analizador y se requiere un pretratamiento de 2 etapas de pipeteo.

Otros ensayos usan reactivos de pretratamiento que provocan un desplazamiento competitivo del analito que se va a determinar añadiendo un exceso de un compuesto estructuralmente similar. Por ejemplo, la prueba de testosterona de Elecsys contiene 2-bromoestradiol en el inmunorreactivo para liberar testosterona de sus proteínas de unión (instrucciones de uso para el ensayo de Elecsys, testosterona (12-2014, V 8.0). Sin embargo, este procedimiento puede comprometer un flujo de trabajo de enriquecimiento con microesferas al ocupar posiciones en las microesferas de captura, lo que reduce o limita, por tanto, su capacidad de capturar el propio analito, lo que posiblemente da lugar a una pérdida de analito. El compuesto competidor también puede provocar interferencias en CL-EM/EM debido a la estructura similar, lo que hace muy probable, por tanto, una coelución y supresión iónica.

Además, se puede usar el tratamiento proteolítico de la muestra para la retirada de la matriz de muestra y la liberación de analito (documentos US 7964363 B2; US 8221986 B2). Sin embargo, los reactivos de proteólisis producen una multitud de fragmentos peptídicos a partir de proteínas de la matriz, lo que puede dificultar un flujo de trabajo de enriquecimiento con microesferas al ocupar valiosas posiciones de microesfera. Como consecuencia, la captura del analito por las microesferas no es posible de una manera completa, lo que da lugar a la pérdida de analito y de sensibilidad. Además, los procedimientos de pretratamiento proteolítico normalmente requieren más de una etapa de pipeteo con diferentes reactivos, lo que da lugar a flujos de trabajo en el analizador más complejos y que requieren más tiempo.

Los reactivos caotrópicos también son conocidos en la literatura como reactivos para la desnaturalización de proteínas y la solubilización de células (Peterson PA (1971), J Biol Chem 246, 7748; Marston FAO (1990), Methods Enzymol, 182:264) y se aplican como reactivos de liberación en ensayos (17). Sin embargo, las formulaciones típicas usan reactivos altamente dosificados, con concentraciones de 6-8 M de urea o guanidina HCl, que, a menudo, provocan interferencias en las mediciones de CL-EM/EM (Samskog J (2003), J Chromatography A, 998:83; Antignac JP (2005, Anal Chim Acta, 529:129; Chiu ML (2010), JALA 15:233; Procet al.(2010), J Proteome Res 9: 5422).

Tszyrsznic W (2013), J Chromatography B, 928:9-15; Singh R J (2008), Thermo Scientific Applicatior Note 429; y Doyle R (2011), "Sample Preparation and lonization Mode Comparison Study for the Quantification of 25-Hydroxy Vitamin D2/D3 by LC/MS/MS", respectivamente, divulgan procedimientosin vitropara liberar inmunodepresores, testosterona y vitamina D, respectivamente, de muestras de sangre, plasma o suero que comprenden poner en contacto dichas muestras con agentes de liberación específicos que comprenden acetonitrilo.

Por tanto, existe una necesidad en la técnica de medios y procedimientos mejorados para liberar analitos de muestras, en particular, de reactivos de pretratamiento que proporcionen buena eficacia de extracción y que no interfieran en aplicaciones posteriores, tales como el enriquecimiento con microesferas. Este problema se resuelve por los medios y procedimientos divulgados en el presente documento.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un procedimientoin vitropara liberar analitos de acuerdo con la reivindicación 1; otra divulgación se refiere a un procedimientoin vitropara liberar analitos de una muestra que comprende poner en contacto dicha muestra con (i) un agente caotrópico, (ii) un disolvente orgánico, (iii) un detergente y (iv) al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato.

Como se usa en lo que sigue, los términos "tener", "comprender" o "incluir" o cualquier variación gramatical arbitraria de los mismos se usan de modo no excluyente. Por tanto, estos términos se pueden referir tanto a una situación en la que, además del rasgo característico introducido por estos términos, no estén presentes otros rasgos característicos en la entidad descrita en este contexto como a una situación en la que estén presentes uno o más de otros rasgos característicos. Como ejemplo, las expresiones "A tiene B", "A comprende B" y "A incluye B" se pueden referir tanto a una situación en la que, además de B, no esté presente ningún otro elemento en A (es decir, una situación en la que A consista única y exclusivamente en B) como a una situación en la que, además de B, uno o más de otros elementos estén presentes en la entidad A, tales como un elemento C, elementos C y D o incluso otros elementos.

Además, como se usa en lo que sigue, los términos "preferentemente", "más preferentemente", "lo más preferentemente", "en particular", "más en particular", "específicamente", "más específicamente" o términos similares se usan junto con rasgos característicos opcionales, sin restringir otras posibilidades. Por tanto, los rasgos característicos introducidos por estos términos son rasgos característicos opcionales y no se pretende que restrinjan el alcance de las reivindicaciones en modo alguno. La invención, como reconocerá el experto en la técnica, se puede realizar usando rasgos característicos alternativos. De forma similar, se pretende que los rasgos característicos introducidos por "en un modo de realización de la invención" o expresiones similares sean rasgos característicos opcionales, sin ninguna restricción con respecto a otros modos de realización de la invención, sin ninguna restricción con respecto al alcance de la invención y sin ninguna restricción con respecto a la posibilidad de combinar los rasgos característicos introducidos de tal modo con otros rasgos característicos opcionales o no opcionales de la invención. Además, si no se indica de otro modo, el término "aproximadamente" se refiere al valor indicado con la precisión técnica comúnmente aceptada en el campo pertinente, preferentemente se refiere al valor indicado ±20 %, más preferentemente ±10 %, lo más preferentemente ±5 %.

Los procedimientos de la presente invención son procedimientosin vitro.Por tanto, los procedimientos no se realizan en el cuerpo humano. Además, los procedimientos de la presente invención, en un modo de realización, no son procedimientos de diagnóstico que proporcionan un diagnóstico del estado de salud de un sujeto; sin embargo, se contempla que los procedimientos de la presente invención, en un modo de realización, proporcionen información que el médico de familia puede encontrar útil para establecer un diagnóstico o que se pueda considerar al decidir el tratamiento adicional de un sujeto. Además, los procedimientos pueden comprender etapas además de las mencionadas anteriormente de forma explícita. Por ejemplo, otras etapas se pueden relacionar, por ejemplo, con proporcionar una muestra, por ejemplo, una muestra de un sujeto, en un modo de realización, obtenida como se describe a continuación en el presente documento; poner en contacto dicha muestra con uno o más de otros compuestos como se especifica a continuación en el presente documento; y/o retirar compuestos insolubles después de poner en contacto la muestra con dichos compuestos. Además, una o más de las etapas de los procedimientos se pueden realizar por equipos automatizados.

El término "muestra", como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra que comprende o se sospecha que comprende al menos un analito. En un modo de realización, la muestra es una muestra biológica, en un modo de realización, una muestra de un líquido corporal, una muestra de células separadas, una muestra de un tejido o un órgano o una muestra de líquido de lavado/aclarado obtenido de una superficie corporal exterior o interior. Las muestras se pueden obtener por técnicas bien conocidas e incluyen raspados, hisopados y biopsias. Las muestras se pueden obtener por el uso de cepillos, hisopos (de algodón), espátulas, líquidos de aclarado/lavado, dispositivos de biopsia en sacabocados, punción de cavidades con agujas o instrumentación quirúrgica. Se pueden obtener muestras de tejidos u órganos de cualquier tejido u órgano, por ejemplo, por biopsia u otros procedimientos quirúrgicos. En un modo de realización, la muestra es una muestra líquida, en otro modo de realización, es una muestra de un líquido corporal, por ejemplo, en un modo de realización, sangre, plasma, suero, orina, saliva, líquido lagrimal y líquidos obtenibles de las glándulas mamarias, por ejemplo, leche. En otro modo de realización, la muestra es una muestra de sangre, plasma o suero. Las muestras de sangre se pueden obtener por extracción de sangre, por ejemplo, por punción de un vaso sanguíneo arterial y/o venoso. Se pueden obtener muestras de plasma y suero de muestras de sangre de acuerdo con procedimientos bien conocidos. En un modo de realización, la muestra es una muestra de plasma en EDTA, en otro modo de realización, la muestra es una muestra de sangre en EDTA. La muestra, en un modo de realización, comprende o se sospecha que comprende al menos un analito como se especifica en otra parte en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "muestra" se refiere a la muestra antes de que se ponga en contacto con los compuestos como se especifica en el presente documento. Durante el contacto se usa el término "mezcla de liberación", siempre que estén presentes los constituyentes tanto de la muestra como de los compuestos mencionados anteriormente, mientras que, después del contacto, es decir, después de que se haya retirado al menos uno de los constituyentes de la muestra y/o de los compuestos mencionados anteriormente, se usa el término "extracto". En un modo de realización, la muestra es una muestra biológica obtenida de un individuo con el propósito de evaluaciónin vitro.En otro modo de realización, la muestra líquida se seca en un papel o membrana de filtro. En un modo de realización, la muestra usada en el presente documento se refiere a una alícuota de una muestra obtenida de un individuo.

El término "poner en contacto" como se usa en el contexto de los procedimientos de la presente invención se entiende por el experto en la técnica. En un modo de realización, el término se refiere a poner una muestra de la presente invención en contacto físico con al menos los compuestos como se indica y, de este modo, permitir que la muestra y los compuestos interactúen. El contacto de una muestra con una multitud de compuestos, por ejemplo, un agente caotrópico, un disolvente orgánico, un detergente y al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato, se puede lograr por adición sucesiva de los compuestos únicos, por adición sucesiva de reactivos que comprenden dos o más de dichos compuestos, por ejemplo, añadiendo un reactivo que comprende el agente caotrópico y al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato, seguido de adición de un segundo reactivo que comprende el disolvente orgánico y el detergente, o poniendo en contacto la muestra con un agente de liberación que comprende todos los compuestos mencionados anteriormente, en un modo de realización, con el agente de liberación de la presente invención. En cualquiera de los casos mencionados anteriormente, la muestra se pone en contacto con los cuatro compuestos mencionados anteriormente simultáneamente, es decir, se permite que la muestra interactúe con todos los compuestos mencionados anteriormente poniendo en contacto la muestra durante al menos las franjas de tiempo como se especifica en otra parte en el presente documento. En caso de que no se añadan todos los compuestos simultáneamente, el tiempo de incubación indicado comienza cuando se añade el último compuesto.

Como se usa en el presente documento, el término "analito" se refiere a un compuesto químico presente en una muestra de un sujeto, en un modo de realización, en un líquido corporal. En un modo de realización, el analito es una molécula pequeña, es decir, en un modo de realización, el analito no es una macromolécula biológica. En otro modo de realización, el analito es una molécula orgánica, en un modo de realización, una molécula que comprende al menos dos átomos de carbono contiguos. En un modo de realización, el analito es una molécula del metabolismo del sujeto. En otro modo de realización, el analito es un compuesto administrado a dicho sujeto, por ejemplo, en tratamiento médico, incluyendo tratamiento profiláctico. También en un modo de realización, el analito es un compuesto químico de bajo peso molecular, en un modo de realización, con una masa molecular de menos de 5000 Da, en un modo de realización, de menos de 2000 Da. En otro modo de realización, el analito se selecciona de la lista que consiste en una hormona esteroidea, un oligopéptido, un policétido y una vitamina.

En un modo de realización, al menos un analito liberado es una hormona esteroidea. El término "hormona esteroidea" es conocido para el experto en la técnica para referirse a un compuesto que tiene una estructura que comprende un sistema de anillo esteroideo y que tiene función hormonal en un sujeto. En un modo de realización, la hormona esteroidea es un corticoesteroide o un esteroide sexual, en un modo de realización es un esteroide sexual. En un modo de realización, el analito es al menos uno de un andrógeno, un estrógeno y un progestágeno, en otro modo de realización, es al menos uno de testosterona, dihidrotestosterona y androstenodiona, en otro modo de realización es testosterona.

En un modo de realización, al menos un analito liberado es un oligopéptido. El término "oligopéptido", como se usa en el presente documento, incluye todos los compuestos que comprenden al menos dos aminoácidos conectados por medio de un enlace peptídico. En un modo de realización, el oligopéptido comprende de desde 2 a 50 aminoácidos, en un modo de realización comprende de desde 3 a 25 aminoácidos, en otro modo de realización comprende de desde 4 a 15 aminoácidos. En un modo de realización, al menos uno de dichos aminoácidos es un alfa-aminoácido, en un modo de realización es un L-alfa-aminoácido, en otro modo de realización es un aminoácido proteinógeno. Como se entenderá, el oligopéptido puede comprender otras cadenas laterales químicas, incluyendo, sin limitación, grupos metilo, grupos etilo, grupos etileno, grupos ceto, grupos hidroxilo, grupos alquilo cíclicos, residuos de glúcido y similares. En un modo de realización, el oligopéptido es un oligopéptido endógeno o uno terapéutico. En otro modo de realización, el oligopéptido es un oligopéptido cíclico, en un modo de realización es un antibiótico oligopeptídico cíclico, en un modo de realización es ciclosporina.

En un modo de realización, al menos un analito liberado es un "policétido", término que es conocido para el experto en la técnica e incluye, en particular, macrólidos, ansamicinas, polienos, tetraciclinas y compuestos relacionados. En un modo de realización, el policétido es un macrólido. El término "macrólido", como se usa en el presente documento, se refiere a una clase de compuestos que comprenden una estructura de lactona macrocíclica. En un modo de realización, el anillo de lactona macrocíclica comprende de desde 8 a 50 átomos de anillo, en un modo de realización, de desde 12 a 40 átomos de anillo, en otro modo de realización, de desde 15 a 35 átomos de anillo. En un modo de realización, el macrólido comprende 23 átomos de anillo, tal como en tacrólimus y en pimecrólimus, o el macrólido comprende 31 átomos de anillo, tal como en sirólimus, everólimus y temsirólimus. Como se entiende por el experto en la técnica, el macrólido puede comprender otras estructuras de anillo fijadas directa o indirectamente al anillo de lactona macrocíclica, y/o el anillo de lactona y otros anillos potenciales, además del al menos un heteroátomo de oxígeno, pueden comprender otros heteroátomos, en particular, átomos de nitrógeno. Además, el macrólido puede comprender además cadenas laterales orgánicas y/o inorgánicas, incluyendo, en particular, grupos metilo, grupos etilo, grupos etileno, grupos ceto, grupos hidroxilo, grupos alquilo cíclicos, residuos de glúcido y similares. En un modo de realización, al menos un analito es everólimus ((1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-12-[(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-(2-hidroxietoxi)-3-metoxiciclohexil]propan-2-il]-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-11,36-dioxa-4-azatriciclo[ 30.3.1.049]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraeno-2,3,10,14,20-pentona, número CAS 159351-69-6), sirólimus ((1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-12-{(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-hid roxi-3-metoxiciclohexil]-2-propanil}-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.0 49]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraeno-2,3,10,14,20-pentona, número CAS 53123-88-9), tacrólimus ((1R,9S,12S,13R,14S,17R,18E,21S,23S,24R,25S,27R)-1,14-dihidroxi-12-[(1E)-1-[(1R,3R,4R)-4-hidroxi-3-metoxic iclohexil]prop-1-en-2-il]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-17-(prop-2-en-1-il)-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.

049]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetrona, número c As 104987-11-3), pimecrólimus ((1R,9S,12S,13R,14S,17R,18E,21S,23S,24R,25S,27R)-12-[(1E)-1-[(1R,3R,4S)-4-cloro-3-metoxiciclohexil]prop-1-en-2-il]-17-etil-1,14-dihidroxi-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.049]octacos-1 8-eno-2,3,10,16-tetrona, número CAS 137071-32-0) o temsirólimus (3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato de

(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2-[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.049]hexatriaconta-1 6,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexilo , número CAS 162635-04-3). En un modo de realización, el analito se selecciona de everólimus, sirólimus, tacrólimus, pimecrólimus y temsirólimus, en un modo de realización se selecciona de everólimus, sirólimus y tacrólimus, en otro modo de realización es everólimus, en un modo de realización es sirólimus, en un modo de realización es tacrólimus.

En un modo de realización, al menos un analito liberado es una "vitamina", un término que es conocido para el

experto en la técnica para referirse a un compuesto orgánico requerido por un sujeto en pequeñas cantidades y que

el cuerpo del sujeto no puede sintetizar. Como también es conocido para el experto en la técnica, el término "vitamina" es una clasificación específica de especie, puesto que, dependiendo de la especie, un compuesto

químico puede ser una vitamina o no. En un modo de realización, la vitamina es una vitamina para un sujeto humano, es decir, es una vitamina humana. En un modo de realización, el analito es uno de vitamina A (retinol), B<1>(tiamina), B<2>(riboflavina), B<3>(niacina), B<5>(ácido pantoténico), B<6>(piridoxina), B<7>(biotina), (cianocobalamina), C (ácido ascórbico), vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol), E (tocoferol) y K (filoquinona).

En un modo de realización, el analito es una vitamina hidrófoba, en un modo de realización, una vitamina humana hidrófoba, en otro modo de realización es una vitamina A, B o D humana, en otro modo de realización es una

vitamina D. En un modo de realización, el término "vitamina D" se debe entender que incluye todos los compuestos naturales que contienen la cadena principal de la vitamina D2 o la cadena principal de la vitamina D3. En otro modo

de realización, la vitamina es una vitamina D3, en otro modo de realización es 25-hidroxi-vitamina D3.

En un modo de realización, se libera una multitud de analitos de una muestra de acuerdo con la presente invención.

En un modo de realización se liberan de la muestra al menos 4, en un modo de realización, al menos 10, en otro

modo de realización, al menos 100 analitos. En un modo de realización, dichos analitos liberados comprenden al

menos uno, en un modo de realización, al menos dos, en otro modo de realización, al menos tres, en otro modo de realización, todos de testosterona, ciclosporina, everólimus y 25-hidroxi-vitamina D3.

El término "liberar analitos", como se usa en el presente documento, se refiere a llevar o mantener analitos comprendidos en una muestra en solución. Como se entiende por el experto en la técnica, un analito de la presente

invención puede estar presente libremente disuelto en una muestra, o puede estar unido a un constituyente de la muestra, por ejemplo, a una proteína, a una membrana, estar atrapado en una vesícula, o similares. De acuerdo

con la invención, la fracción de un analito particular encontrado soluble en la solución de extracción después de la extracción es de al menos un 50 % del analito total presente en dicha muestra, en un modo de realización es de al

menos un 60 %, en otro modo de realización es de al menos un 70 %, en otro modo de realización es de al menos

un 80 %, en otro modo de realización es de al menos un 90 %. Por tanto, en un modo de realización, la eficacia de extracción del procedimiento de la presente invención es de al menos un 50 %, en un modo de realización es de al

un 80, en otro modo de realización es de al menos un 90 %. En un modo de realización, liberar analitos comprende

destruir y/o disolver membranas biológicas y/o comprende desnaturalizar y/o precipitar proteínas. Como se

entiende por el experto en la técnica, el término "desnaturalizar una proteína" se refiere a inducir un estado conformacional en dicha proteína que sea diferente de su conformación natural. En un modo de realización, desnaturalizar es desplegar una proteína para liberar cofactores y/u otros analitos unidos por la proteína. Por tanto,

en un modo de realización, desnaturalizar una proteína puede incluir la precipitación de dicha proteína; sin embargo, desnaturalizar una proteína también puede ser desplegar y solubilizar un polipéptido.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un vertebrado. En un modo de realización,

el sujeto es un mamífero, en otro modo de realización, un ratón, rata, gato, perro, hámster, cobaya, oveja, cabra,

cerdo, ganado o caballo. Todavía en otro modo de realización, el sujeto es un primate. En otro modo de realización,

el sujeto es un ser humano. En un modo de realización, el sujeto padece o se sospecha que padece una enfermedad o afección asociada con una desviación mensurable de la normalidad de al menos un analito. En otro

modo de realización, el sujeto recibe tratamiento médico que comprende la administración de al menos un analito,

en un modo de realización, de al menos uno de una hormona esteroidea, un oligopéptido, un policétido y una vitamina. En otro modo de realización, el sujeto recibe tratamiento médico que comprende la administración de al

menos uno de testosterona, ciclosporina, everólimus y vitamina D3. En otro modo de realización, el sujeto recibe tratamiento médico que comprende la administración de al menos uno de ciclosporina y everólimus.

Como se usa en el presente documento, el término "agente caotrópico" se refiere a un compuesto que altera los

enlaces de hidrógeno entre moléculas de agua y altera la estructura terciaria de macromoléculas biológicas. En

una divulgación, el agente caotrópico comprende iones de guanidinio, es decir, es cloruro de guanidinio o tiocianato

de guanidinio, es tiourea o es urea. En un modo de realización, el agente caotrópico es un agente que no comprende átomos de azufre. Por tanto, en un modo de realización, el agente caotrópico comprende o es cloruro

de guanidinio o urea, en otro modo de realización comprende o es cloruro de guanidinio, en otro modo de realización comprende o es urea. Como se reivindica, el agente caotrópico es cloruro de guanidinio y/o urea, en

otro modo de realización es cloruro de guanidinio, en otro modo de realización es urea. Como se reivindica, la concentración del agente caotrópico, en un modo de realización, del cloruro de guanidinio, en otro modo de realización de la urea, es de desde 1 M a 4 M, en un modo de realización, de desde 2 M a 3,5 M, en las que dichas concentraciones son concentraciones en la muestra tratada durante dicho contacto.

El término "disolvente orgánico", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto en el que sus moléculas comprenden al menos un átomo de carbono y que es líquido en condiciones de presión y temperatura

ambiente estándar según la IUPAC (temperatura: 25 °C, presión: 105 kPa). En un modo de realización, el disolvente orgánico tiene un punto de ebullición de al menos 50 °C, en un modo de realización, de al menos 60 °C, en otro modo de realización, de al menos 70 °C, en otro modo de realización, de al menos 80 °C. En un modo de realización, el disolvente orgánico es un disolvente orgánico neutro, en otro modo de realización es un disolvente aprótico. En un modo de realización, el disolvente orgánico es un disolvente polar, en un modo de realización, un disolvente polar aprótico. En un modo de realización, el disolvente orgánico tiene un momento dipolar de al menos 1,5D, en un modo de realización, de al menos 2D, en otro modo de realización, de al menos 2,5D, en otro modo de realización, de al menos 3D. En una divulgación, el disolvente orgánico se selecciona de acetato de etilo, acetona, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, carbonato de propileno y acetonitrilo. Como se reivindica, el disolvente orgánico es acetonitrilo. Como se reivindica, la concentración de dicho disolvente orgánico, en un modo de realización de acetonitrilo, es de desde un 2 % (v/v) a un 20 % (v/v), en un modo de realización, de desde un 3 % (v/v) a un 15 % (v/v), en un modo de realización, de desde un 5 % (v/v) a un 10 % (v/v), en las que dichas concentraciones son concentraciones en la muestra tratada durante dicho contacto.

Como se usa en el presente documento, el término "detergente" se refiere a un compuesto anfifílico que disminuye la tensión de superficie del agua, en principio, bien conocido para el experto en la técnica. En un modo de realización, el detergente es una mezcla de compuestos anfifílicos; en otro modo de realización, el detergente es un compuesto anfifílico único, es decir, es un tensioactivo. En un modo de realización, el detergente comprende, en un modo de realización, consiste en, tensioactivos no iónicos. Como se reivindica, el detergente es un tensioactivo no iónico. En un modo de realización, el detergente comprende o es un éter alquílico de polietilenglicol, un éter alquílico de polipropilenglicol, un éster alquílico de sorbitán de polioxietilenglicol, éteres octilfenílicos de polietilenglicol, un éter alquilfenílico de polietilenglicol, un éster alquílico de glicerol o un éter alquílico de glucósido. En un modo de realización, el éter alquílico de glucósido es un alquil-glucósido con una cadena de alquilo que tiene de dese 5 a 12 átomos de carbono, en otro modo de realización es un alquil-glucósido con una cadena de alquilo que tiene de desde 5 a 12 átomos de carbono, en otro modo de realización es un octil-glucósido. En otro modo de realización, el detergente comprende o es un alquil-glucósido, en un modo de realización es lauril-glucósido, decil-glucósido u octil-glucósido, en otro modo de realización es un octil-glucósido, en otro modo de realización es 13-D-octil-glucósido ((2R,3S,4S,5R,6R)-2-(hidroximetil)-6-octoxioxano-3,4,5-triol, n.° CAS: 29836-26-8).

Como se reivindica, la concentración del detergente es de desde un 0,2 % (p/v) a un 20 % (p/v), en un modo de realización, de desde un 0,3 % (p/v) a un 2 % (p/v), en las que dichas concentraciones son concentraciones en la muestra tratada durante dicho contacto.

Como se usa en el presente documento, el término "agente que proporciona iones de bicarbonato" incluye cualquier compuesto químico que esté en equilibrio químico con iones de bicarbonato en una solución acuosa a pH 7. Un "ion de bicarbonato" (ion de hidrogenocarbonato) de acuerdo con la presente invención es un anión con la fórmula empírica HCO<3>', que tiene formalmente una masa molecular de 61,01 dáltones. Los iones de bicarbonato se pueden proporcionar por un compuesto químico que contenga al menos una sal de hidrogenocarbonato o de carbonato y/o por un compuesto químico que pueda liberar iones de bicarbonato tras la hidrólisis. Una "sal de carbonato", de acuerdo con la presente divulgación, es un compuesto químico que comprende iones de carbonato; en una divulgación, la sal de carbonato es una sal de carbonato soluble, en particular, es carbonato de sodio (Na2CO3), carbonato de potasio (K<2>CO<3>) o carbonato de amonio ((NH4)2CO3). Una "sal de hidrogenocarbonato", de acuerdo con la presente divulgación, es un compuesto que comprende iones de HCO<3>', en una divulgación, seleccionada del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3), hidrogenocarbonato de potasio (KHCO<3>), hidrogenocarbonato de amonio (NH<4>HCO<3>), hidrogenocarbonato de calcio (Ca(HCO3)2) e hidrogenocarbonato de magnesio (Mg(HCO3)2. Un "compuesto químico que pueda liberar iones de bicarbonato tras la hidrólisis", de acuerdo con una divulgación, es un éster de carbonato. Un "éster de carbonato" de acuerdo con la presente divulgación es un grupo carbonilo flanqueado por dos grupos alcoxi. La estructura general de estos carbonatos es R1O(C=O)OR2, siendo R1 y R2 alquilo o alquilo cíclico, en una divulgación seleccionado independientemente de metilo, etilo, propionilo y butilo, o R1 y R2 forman conjuntamente un puente alquilo, en particular, un grupo etileno. Por tanto, existen ésteres de carbonato cíclicos (por ejemplo, carbonato de etileno) o ésteres de carbonato no cíclicos (por ejemplo, carbonato de dimetilo), así como derivados hidroxilados o halogenados de los mismos disponibles.

Como se entiende por el experto en la técnica, los carbonatos provocan la alcalinización de soluciones acuosas. Por tanto, en una divulgación se usan sales de carbonato, en particular, para la liberación de analitos insensibles a condiciones alcalinas. En otra divulgación, en particular, en caso de que se libere un analito sensible a pH alcalino, por ejemplo, un macrólido, se ajusta el pH durante la etapa de contacto o, en un modo de realización, se puede usar una sal de hidrogenocarbonato o un éster de carbonato. Por tanto, en una divulgación, el agente que proporciona iones de bicarbonato se selecciona del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio, hidrogenocarbonato de potasio, hidrogenocarbonato de amonio, hidrogenocarbonato de calcio e hidrogenocarbonato de magnesio. En otra divulgación, la sal de hidrogenocarbonato se selecciona del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio, hidrogenocarbonato de potasio e hidrogenocarbonato de amonio. Otra divulgación se refiere a la sal de hidrogenocarbonato que se selecciona del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio e hidrogenocarbonato de potasio.

En una divulgación, el agente que proporciona iones de bicarbonato es un éster de carbonato cíclico o no cíclico o un derivado hidroxilado o halogenado del mismo, respectivamente. En otra divulgación, el agente que proporciona iones de bicarbonato es un éster de carbonato cíclico o no cíclico o un derivado halogenado del mismo, respectivamente. En una divulgación, el éster de carbonato cíclico o no cíclico o el derivado halogenado del mismo se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de dimetilo, carbonato de propileno, carbonato de vinileno, carbonato de trimetileno, bis-carbonato de eritritol, 1,2-carbonato de glicerol, 4-cloro-1,3-dioxolan-2-ona, 4,5-dicloro-1,3-dioxolan-2-ona, éster dimetílico del ácido 2,5-dioxahexanodioico, carbonato de 1,2-butileno, carbonato de cis-2,3-butileno y carbonato de trans-2,3-butileno. En otro modo de realización, el éster de carbonato cíclico se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de propileno, carbonato de vinileno, carbonato de trimetileno, bis-carbonato de eritritol, 1,2-carbonato de glicerol, 4-cloro-1,3-dioxolan-2-ona y 4,5-dicloro-1,3-dioxolan-2-ona. En otro modo de realización, el éster de carbonato cíclico o no cíclico se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, 1,2-carbonato de glicerol, carbonato de propileno y carbonato de vinileno. En otro modo de realización, el éster de carbonato cíclico se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, 1,2-carbonato de glicerol y carbonato de propileno. En otro modo de realización, el éster de carbonato cíclico se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno y 1,2-carbonato de glicerol. En otro modo de realización, el agente que proporciona iones de bicarbonato comprende o es un éster de carbonato cíclico, en un modo de realización comprende o es carbonato de etileno (1,3-dioxolan-2-ona, n.° CAS: 96-49-1).

La concentración de iones de bicarbonato proporcionados formalmente por el al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato es de desde 0,1 M a 2 M, en un modo de realización, de desde 0,2 M a 0,5 M, en las que dichas concentraciones son concentraciones en la muestra tratada durante dicho contacto. Como se usa en el presente documento, las indicaciones de concentración para iones de bicarbonato se proporcionan sobre una base formal, suponiendo que todas las unidades de CO<3>del agente respectivo que proporciona iones de bicarbonato están presentes como iones de bicarbonato, en un modo de realización, independientemente del pH; por tanto, por ejemplo, se supone que una solución 0,1 M de una sal de carbonato proporciona iones de bicarbonato a una concentración de 0,1 M; además, se supone que una solución 0,1 M de un éster de carbonato proporciona iones de bicarbonato a una concentración de 0,1 M, independientemente del grado de hidrólisis real.

Como se entenderá por el experto en la técnica, se pueden mezclar arbitrariamente más de un agente que proporciona iones de bicarbonato para lograr el efecto divulgado en la presente invención. Además, como el experto en la técnica sabe, en solución acuosa, los iones de bicarbonato están en equilibrio con dióxido de carbono de acuerdo con las siguientes ecuaciones:

2 H<2>O CO<2>^ H<2>O H<2>CO<3>^ HaO+ HCO<3>-.

Por tanto, las sales de ácido carbónico, es decir carbonatos e hidrogenocarbonatos, están en equilibrio con dióxido de carbono volátil y son adecuadas, en particular, como agentes que proporcionan iones de bicarbonato en reactivos de almacenamiento a corto o medio plazo. Por otra parte, se pueden considerar, en particular, los ésteres de carbonato para reactivos de almacenamiento a largo plazo, en particular, un almacenamiento durante al menos 4 semanas, en un modo de realización, al menos 2 meses, en otro modo de realización, durante al menos 3 meses, en otro modo de realización, durante al menos 6 meses.

De forma sorprendente, se descubrió en el trabajo subyacente a la presente invención que, al incluir un agente que proporciona iones de bicarbonato en la mezcla de liberación (mezcla de pretratamiento), se puede reducir la concentración del agente caotrópico, sin afectar negativamente a la eficacia de extracción. Por tanto, en un modo de realización, la suma de concentraciones de (i) dicho agente caotrópico e (ii) iones de bicarbonato proporcionados formalmente por dicho al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato es de al menos 1,5 M, en un modo de realización es de desde 1,5 M a 4 M.

Como se indica anteriormente, los analitos y la eficacia de su extracción pueden ser sensibles a pH extremos, en particular, si se ponen en contacto durante periodos de tiempo prolongados. Por tanto, el pH durante la etapa de contacto es de desde 3 a 9, en un modo de realización, de desde 4 a 8, en otro modo de realización, de desde 5 a 7,5. En un modo de realización, el pH durante la etapa de contacto es de 6,5±1,5, en otro modo de realización es de 6,5±1, en otro modo de realización es de 6,5±0,5, en otro modo de realización, es de 6,5±0,3. Además, los analitos y la eficacia de su extracción pueden ser sensibles a las desviaciones de temperatura, en particular, si se ponen en contacto durante periodos de tiempo prolongados. Por tanto, en un modo de realización, la etapa de contacto se realiza, en un modo de realización, a una temperatura de, como máximo, 50 °C, en un modo de realización, de, como máximo, 45 °C, en otro modo de realización, de como máximo 40 °C. En un modo de realización, la etapa de contacto se realiza a una temperatura de al menos 0 °C, en un modo de realización, de al menos 10 °C, en otro modo de realización, de al menos 20 °C, en otro modo de realización, de al menos 25 °C, en otro modo de realización, de al menos 30 °C. Por tanto, en un modo de realización, la etapa de contacto se realiza a una temperatura de desde 10 °C a 50 °C, en un modo de realización, de desde 20 °C a 45 °C, en otro modo de realización, de desde 25 °C a 40 °C, en otro modo de realización, de 37 °C±2 °C, en otro modo de realización, de aproximadamente 37 °C, en otro modo de realización, de 37 °C. En un modo de realización, la etapa de contacto se realiza durante, como máximo, 1 h, en un modo de realización, de, como máximo, 30 min, en otro modo de realización, de, como máximo, 20 min. En un modo de realización, la etapa de contacto se realiza durante al menos 2 min, en un modo de realización, al menos 3 min, en otro modo de realización, al menos 5 min, en otro modo de realización, al menos 8 min, en otro modo de realización, al menos 12 min. Por tanto, en un modo de realización, la etapa de contacto se realiza durante de desde 2 a 30 min, en un modo de realización, de desde 3 a 20 min, en otro modo de realización, de desde 5 a 15 min. El experto en la técnica puede validar la idoneidad de las condiciones como se indica anteriormente para liberar un analito de interés, por ejemplo, incubando el analito de interés en las condiciones pretendidas y determinando la cantidad de analito de interés que permanece después de la incubación. En un modo de realización, las condiciones de pH y temperatura mencionadas anteriormente se mantienen durante todo el procedimiento, es decir, en un modo de realización, mientras se realiza el procedimiento para liberar analito, en otro modo de realización, mientras se realiza el procedimiento para determinar al menos un analito.

El procedimiento para liberar analitos también puede comprender poner en contacto la muestra con otros agentes. Por ejemplo, en un modo de realización, la mezcla de liberación puede comprender además un agente reductor, por ejemplo, un tiol u otro agente que reduzca los enlaces disulfuro en proteínas, en particular, 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina HCl, TCEP, cisteína HCl, homocisteína HCl, ditiotreitol (DTT), ditioeritrol (DTE), N-metilmaleimida, reactivo de Ellman y ácido 1,2-ditiolano-3-carboxílico. Además, en un modo de realización, se puede incluir un agente estabilizador del pH, por ejemplo, un tampón.

De forma ventajosa, se descubrió en el trabajo subyacente a la presente invención que al poner en contacto una muestra, en particular, una muestra de sangre o derivada de sangre, con los compuestos de la presente invención, se puede extraer con alta eficacia una gama, en particular, amplia de compuestos químicos, incluyendo compuestos conocidos en la técnica por ser difíciles de extraer, tales como vitamina D. Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento de extracción genérico altamente eficaz y los reactivos correspondientes, que son, en particular, bien adecuados para extraer hormonas esteroideas, oligopéptidos, policétidos y vitaminas, en particular, en el caso de que se deban extraer simultáneamente miembros de dos o más de las clases de compuestos mencionados anteriormente. Además, se descubrió que al incluir un agente que proporciona iones de bicarbonato en la mezcla de liberación, la cantidad de agente caotrópico requerida para la liberación completa se podía reducir significativamente, evitando, por tanto, en particular, problemas en la espectrometría de masas, tales como la supresión iónica.

Las definiciones realizadas anteriormente se aplicanmutatis mutandisa lo que sigue. Las definiciones y explicaciones adicionales realizadas más adelante también se aplicanmutatis mutandisa todos los modos de realización descritos en esta memoria descriptiva.

La presente invención se refiere además a un agente de liberación de acuerdo con la reivindicación 5; otra divulgación se refiere a un agente de liberación para liberar analitos de una muestra que comprende (i) un agente caotrópico, (ii) un disolvente orgánico, (iii) un detergente y (iv) al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato.

El término "agente de liberación", como se usa en el presente documento, se refiere a una mezcla que comprende al menos los compuestos químicos como se especifica. En principio, el agente de liberación se puede proporcionar en forma sólida, en un modo de realización, para disolverse en una concentración apropiada o para añadirse directamente a una muestra por el usuario. En un modo de realización, el agente de liberación es una solución acuosa que comprende al menos los compuestos como se especifica. En otro modo de realización, el reactivo de liberación es una solución triplemente concentrada, en un modo de realización, lista para usar, es decir, proporcionada para una dilución triple directa en una muestra como se especifica en el presente documento, es decir, combinando una parte de agente de liberación con dos partes de muestra. Como se entiende por el experto en la técnica, el agente de liberación también se puede proporcionar en una proporción de concentración diferente, por ejemplo, en un modo de realización, como un concentrado doble, cuádruple o quíntuple. El experto en la técnica puede establecer un factor de concentración para el agente de liberación según sea apropiado para una aplicación específica, teniendo en cuenta, en particular, la solubilidad de los constituyentes del agente de liberación, además de las propiedades específicas de la muestra y del analito de interés. Por ejemplo, en caso de que el analito esté altamente concentrado en la muestra, puede ser adecuado proporcionar un agente de liberación que requiera una fuerte dilución de la muestra, por ejemplo, un agente de liberación 1,1 veces concentrado. Por otra parte, en caso de que se espere que el analito esté presente en la muestra a concentraciones bajas, se pueden considerar factores de concentraciones mayores.

En un modo de realización, el agente de liberación es una solución triplemente concentrada. En consecuencia, en un modo de realización, la concentración del agente caotrópico en el agente de liberación, en particular, en un agente de liberación triplemente concentrado, es de desde 2 M a saturada, en un modo de realización, de desde 2,5 M a 6 M. En otro modo de realización, la concentración del disolvente orgánico en el agente de liberación, en particular, en un agente de liberación triplemente concentrado, es de desde un 2 % (v/v) a un 30 % (v/v), en un modo de realización, de desde un 5 % (v/v) a un 20 % (v/v), en un modo de realización, de desde un 15 % (v/v) a un 20 % (v/v). En otro modo de realización, la concentración del detergente en el agente de liberación, en particular, en un agente de liberación triplemente concentrado, es de desde un 0,5 % (p/v) a un 20 % (p/v), en un modo de realización, de desde un 1%(p/v) a un 3%(p/v). En otro modo de realización, la concentración de iones de bicarbonato proporcionados formalmente por el al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato en el agente de liberación, en particular, en un agente de liberación triplemente concentrado, es de desde 0,1 M a 6 M, en un modo de realización, de desde 0,5 M a 2 M. En otro modo de realización, la suma de concentraciones de (i) el agente caotrópico y (ii) los iones de bicarbonato proporcionados formalmente por dicho al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato en el agente de liberación, en particular, en un agente de liberación triplemente concentrado, es de al menos 2 M, en un modo de realización es de desde 3 M a 8 M. Por tanto, en un modo de realización, en el agente de liberación, en particular, en un agente de liberación triplemente concentrado, la concentración del agente caotrópico es de desde 2 M a saturada, en un modo de realización, de desde 2,5 M a 6 M; la concentración del disolvente orgánico es de desde un 2 % (v/v) a un 30 % (v/v), en un modo de realización, de desde un 5 % (v/v) a un 20 % (v/v), en un modo de realización, de desde un 15 % (v/v) a un 20 % (v/v); la concentración del detergente es de desde un 0,5 % (p/v) a un 20 % (p/v), en un modo de realización, de desde un 1 % (p/v) a un 3 % (p/v); y la concentración de iones de bicarbonato proporcionados formalmente por el al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato es de desde 0,1 M a 6 M, en un modo de realización, de desde 0,5 M a 2 M; y, opcionalmente, la suma de concentraciones de (i) el agente caotrópico y (ii) los iones de bicarbonato proporcionados formalmente por dicho al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato es de al menos 2 M, en un modo de realización, es de desde 3 M a 8 M.

El agente de liberación puede comprender compuestos además de los compuestos especificados. Por ejemplo, en un modo de realización, un compuesto de tiol, un tampón o similares.

La presente invención también se refiere al uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 7; otra divulgación se refiere a un uso de una composición que comprende (i) un agente caotrópico, (ii) un disolvente orgánico, (iii) un detergente y (iv) al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato, en un modo de realización, un agente de liberación de acuerdo con la presente invención, y/o del procedimiento para liberar analitos de una muestra de la presente invención para liberar al menos un analito de una muestra.

Además, la presente invención se refiere a un kit de acuerdo con la reivindicación 9; otra divulgación se refiere a un kit que comprende (i) un agente caotrópico, (ii) un disolvente orgánico, (iii) un detergente y (iv) al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato, en un modo de realización, que comprende el agente de liberación de la presente invención, comprendidos en una carcasa, en un modo de realización, que comprende además al menos un agente de detección para al menos un analito.

El término "kit", como se usa en el presente documento, se refiere a una colección de los compuestos, medios o reactivos mencionados anteriormente de la presente invención que se pueden o no envasar conjuntamente. Los componentes del kit pueden estar comprendidos por carcasas separadas (es decir, como un kit de piezas separadas), o se pueden proporcionar dos o más componentes en una carcasa única. Por tanto, el kit puede comprender los compuestos indicados como compuestos únicos, por ejemplo, como compuestos puros para disolverse por el usuario y/o como soluciones listas para usar. El kit también puede comprender mezclas de dos o más de los compuestos mencionados anteriormente, por ejemplo, un reactivo que comprende el agente caotrópico y el al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato y un segundo reactivo que comprende el disolvente orgánico y el detergente, o el kit puede comprender un reactivo que comprende todos los compuestos mencionados anteriormente, en particular, puede comprender el agente de liberación de la presente invención. Además, se debe entender que el kit de la presente invención, en un modo de realización, se va a usar para poner en práctica el procedimiento para liberar analitos de una muestra y/o el procedimiento para determinar al menos un analito en una muestra al que se hace referencia en el presente documento. En un modo de realización, se contempla que los componentes se proporcionen de una manera lista para usar para poner en práctica los procedimientos a los que se hace referencia en el presente documento. En un modo de realización, todos o algunos de dichos compuestos se proporcionan en forma líquida concentrada en la que el componente concentrado se diluye usando un líquido, tal como una solución acuosa tamponada o agua como se especifica en otra parte en el presente documento. Además, el kit, en un modo de realización, contiene instrucciones para llevar a cabo dichos procedimientos. Las instrucciones se pueden proporcionar por un manual de usuario en formato impreso o electrónico. Además, el manual puede comprender instrucciones para interpretar los resultados obtenidos al llevar a cabo los procedimientos mencionados anteriormente usando el kit de la presente invención. En un modo de realización, el kit comprende además agua, un tampón y/o recipientes adecuados para realizar el procedimiento.

El kit puede comprender además un agente de detección para al menos un analito. El término "agente de detección", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente que asista en la detección de un analito. Por tanto, el agente de detección puede ser un compuesto químico que interactúe o se someta a una reacción química con el analito. En un modo de realización, el agente de detección es una molécula química que se une, directa o indirectamente, al analito de la presente invención. Como se entenderá por el experto en la técnica, el agente de detección también puede ser un agente de detección indirecto, es decir, un agente de detección que no se pone en contacto directamente con el analito, sino por medio de un otro compuesto que se une por sí mismo al analito. En un modo de realización, el agente de detección es un agente de detección directo, es decir, es un agente que se une directamente al analito. En un modo de realización, el agente de detección es un anticuerpo, en un modo de realización, es una IgG. En un modo de realización, el agente de detección es un anticuerpo monoclonal. En otro modo de realización, el agente de detección es un anticuerpo unido a un compuesto indicador, es decir, a un compuesto en el que su presencia en una muestra se puede detectar por medios conocidos para el experto en la técnica. Los compuestos indicadores conocidos incluyen tintes, grupos electroquímicamente activos o microesferas como microesferas de látex. En un modo de realización, el kit comprende además un recipiente de extracción, que puede ser un recipiente para una extracción única, por ejemplo, un tubo de plástico o un vaso Eppendorf, o un dispositivo para una multitud de extracciones, en particular, una placa de múltiples pocillos, por ejemplo, una placa de 96 pocillos. En un modo de realización, el recipiente de extracción puede comprender una cantidad o volumen predeterminado del reactivo de liberación de la presente invención; por ejemplo, en un modo de realización, se puede proporcionar un volumen predeterminado en los pocillos de una placa de múltiples pocillos o se puede secar en dichos pocillos.

La presente invención también se refiere a un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12; otra divulgación se refiere a un procedimiento para determinar al menos un analito en una muestra que comprende

(a) liberar dicho analito de acuerdo con el procedimiento para liberar analitos de una muestra de acuerdo con la presente invención para generar un extracto;

(b) determinar dicho analito liberado en dicho extracto; y, de este modo,

(c) determinar dicho analito en una muestra.

El término "determinar", como se usa en el presente documento, se refiere a determinar al menos un rasgo característico de un analito que se va a determinar en un extracto obtenido de la muestra. Los rasgos característicos característicos de acuerdo con la presente invención son rasgos característicos que caracterizan las propiedades físicas y/o químicas, incluyendo las propiedades bioquímicas de un analito. Dichas propiedades incluyen, por ejemplo, peso molecular, viscosidad, densidad, carga eléctrica, espín, actividad óptica, color, fluorescencia, quimioluminiscencia, composición elemental, estructura química, capacidad de reaccionar con otros compuestos, capacidad de provocar una respuesta en un sistema de lectura biológico (por ejemplo, inducción de un gen indicador) y similares. Los valores de dichas propiedades pueden servir como rasgos característicos característicos y se pueden determinar por técnicas bien conocidas en la técnica. Además, el rasgo característico característico puede ser cualquier rasgo característico que se derive de los valores de las propiedades físicas y/o químicas de un analito por operaciones estándar, por ejemplo, cálculos matemáticos, tales como multiplicación, división o cálculo logarítmico. En un modo de realización, el al menos un rasgo característico característico permite la determinación y/o identificación química del analito y su cantidad. En consecuencia, el valor característico, en un modo de realización, también comprende información relacionada con la abundancia del analito del que se deriva el valor característico. Por ejemplo, un valor característico de un analito puede ser un pico en un espectro de masas. Dicho pico contiene información característica del analito, es decir, la información m/z, así como un valor de intensidad que está relacionado con la abundancia del dicho analito (es decir, su cantidad) en el extracto.

Un analito comprendido por una muestra se puede determinar, en un modo de realización, de acuerdo con la presente invención cuantitativa o semicuantitativamente. Para la determinación cuantitativa, se determinará la cantidad absoluta o bien precisa del analito o se determinará la cantidad relativa del analito en base al valor determinado para el/los rasgo(s) característico(s) característico(s) a los que se hace referencia anteriormente en el presente documento. La cantidad relativa se puede determinar en un caso en el que la cantidad precisa de un analito no se puede determinar o no se determinará. En dicho caso, se puede determinar si la cantidad en la que el analito está presente está aumentada o disminuida con respecto a una segunda muestra que comprende dicho analito en una segunda cantidad. Por tanto, analizar cuantitativamente un analito también incluye lo que a veces se denomina análisis semicuantitativo de un analito.

Además, la determinación, como se usa en el procedimiento de la presente invención, en un modo de realización, puede incluir usar una etapa de separación de compuestos antes de la etapa de análisis a la que se hace referencia anteriormente. En un modo de realización, dicha etapa de separación de compuestos proporciona una separación resuelta en el tiempo de los metabolitos comprendidos por la muestra. Por lo tanto, las técnicas adecuadas para la separación que se van a usar de acuerdo con la presente invención incluyen todas las técnicas de separación cromatográfica, tales como cromatografía de líquidos (CL), cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), cromatografía de gases (CG), cromatografía en capa fina, cromatografía de exclusión por tamaño o de afinidad. Estas técnicas son bien conocidas en la técnica y se pueden aplicar por el experto en la técnica sin más preámbulos. En un modo de realización, la CL y/o CG son técnicas cromatográficas que se van a contemplar por el procedimiento de la presente invención. También son conocidos en la técnica dispositivos adecuados para dicha determinación de analitos. En un modo de realización, se usa espectrometría de masas para determinar el analito, en particular, espectrometría de masas con cromatografía de gases (CG-EM), espectrometría de masas con cromatografía de líquidos (CL-EM), espectrometría de masas por infusión directa o espectrometría de masas por resonancia de ciclotrón iónica por transformada de Fourier (FT-ICR-EM), espectrometría de masas por electroforesis capilar (EC-EM), espectrometría de masas acoplada a cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC-EM), espectrometría de masas cuadrupolar, cualquier espectrometría de masas acoplada secuencialmente, tal como EM-EM o EM-EM-EM, espectrometría de masas por plasma acoplado inductivamente (ICP-EM), espectrometría de masas por pirólisis (Py-EM), espectrometría de masas con movilidad iónica o espectrometría de masas por tiempo de vuelo (TOF). Como alternativa o además de las técnicas de espectrometría de masas, se pueden usar las siguientes técnicas para la determinación de compuestos: resonancia magnética nuclear (RMN), resonancia magnética (RM), análisis de infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR), espectroscopia ultravioleta (UV), índice de refracción (IR), detección fluorescente, detección radioquímica, detección electroquímica, dispersión de luz (DL), espectroscopia Raman dispersiva o detección por ionización de llama (FID). Estas técnicas son bien conocidas para el experto en la técnica y se pueden aplicar sin más preámbulos. El procedimiento de la presente invención estará, en un modo de realización, asistido por automatización. Por ejemplo, el procesamiento de muestras se puede automatizar por robótica. El procesamiento y comparación de datos están, en un modo de realización, asistidos por programas informáticos y bases de datos adecuados. La automatización como se describe anteriormente en el presente documento permite usar el procedimiento de la presente invención en enfoques de alto rendimiento. Por tanto, en un modo de realización, el procedimiento es un procedimiento para determinar una multitud de analitos, en un modo de realización, en el que dicha multitud es de al menos dos, en un modo de realización, de al menos cuatro, en otro modo de realización, de al menos diez, en otro modo de realización, de al menos 25, en otro modo de realización, de al menos 50 analitos. En otro modo de realización, la multitud de analitos se determina a partir de uno o de una multitud de extractos de acuerdo con la etapa a) del procedimiento para determinar al menos un analito.

Además, el al menos un analito también se puede determinar por un ensayo químico o biológico específico. Dicho ensayo comprenderá medios que permitan detectar específicamente el al menos un analito en la muestra. En un modo de realización, dichos medios pueden reconocer específicamente la estructura química del analito o pueden identificar específicamente el analito en base a su capacidad de reaccionar con otros compuestos o su capacidad de provocar una respuesta en un sistema de lectura biológico (por ejemplo, inducción de un gen indicador). Los medios que pueden reconocer específicamente la estructura química de un analito son, en un modo de realización, anticuerpos u otras proteínas que interactúan específicamente con estructuras químicas, tales como receptores o enzimas. Por ejemplo, se pueden obtener anticuerpos específicos usando el analito como antígeno por procedimientos bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos como se hace referencia en el presente documento incluyen anticuerpos tanto policlonales como monoclonales, así como fragmentos de los mismos, tales como fragmentos Fv, Fab y F(ab)<2>que se pueden unir al antígeno o hapteno. Además, se engloban nanocuerpos y anticuerpos monocatenarios. También se incluyen anticuerpos híbridos humanizados en los que las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo donante no humano que presenta una especificidad de antígeno deseada se combinan con secuencias de un anticuerpo aceptor humano. Las secuencias donantes incluirán normalmente al menos los residuos aminoacídicos de unión a antígeno del donante, pero pueden comprender además otros residuos aminoacídicos estructural y/o funcionalmente pertinentes del anticuerpo donante. Dichos híbridos se pueden preparar por varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Las proteínas adecuadas que pueden reconocer específicamente el analito son, en un modo de realización, enzimas que están implicadas en la conversión metabólica del dicho analito. Dichas enzimas pueden usar el analito como sustrato o bien pueden convertir un sustrato en el analito. Además, dichos anticuerpos se pueden usar como base para generar oligopéptidos que reconozcan específicamente el analito. Estos oligopéptidos comprenderán, por ejemplo, las cavidades o dominios de unión de la enzima para el dicho analito. Los ensayos basados en anticuerpos y/o enzimas adecuados pueden ser RIA (radioinmunoanálisis), ELISA (ensayo de inmunoadsorción enzimática), pruebas inmunitarias enzimáticas de tipo sándwich, inmunoanálisis de tipo sándwich con electroquimioluminiscencia (ECLIA), fluoroinmunoanálisis de disociación potenciada por lantánidos (DELFIA) o pruebas inmunitarias en fase sólida. Además, el analito también se puede determinar en base a su capacidad de reaccionar con otros compuestos, es decir, por una reacción química específica. Además, el analito se puede determinar en una muestra debido a su capacidad de provocar una respuesta en un sistema de lectura biológico. La respuesta biológica se detectará como lectura que indique la presencia y/o la cantidad del analito comprendido por la muestra. La respuesta biológica puede ser, por ejemplo, la inducción de la expresión génica o una respuesta fenotípica de una célula o un organismo. En un modo de realización, la determinación del al menos un analito es un procedimiento cuantitativo, por ejemplo, que permite también la determinación de la cantidad del al menos un analito en la muestra.

La presente invención se refiere además a un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 14; otra divulgación se refiere a un dispositivo para determinar un analito en una muestra que comprende el agente de liberación de acuerdo con la presente invención y/o configurado para realizar un procedimiento de la presente invención.

El término "dispositivo", como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de medios que comprende al menos los medios descritos, enlazados de forma funcional entre sí para permitir la determinación. Cómo enlazar los medios del dispositivo de una manera funcional dependerá del tipo de medios incluidos en el dispositivo. En un modo de realización, los medios están comprendidos por un dispositivo único. En un modo de realización, el dispositivo comprende al menos una unidad de análisis, estando configurada dicha unidad de análisis para realizar la extracción de al menos un analito de una muestra; en un modo de realización, la unidad de análisis comprende el agente de liberación de acuerdo con la presente invención y/o está configurada para realizar un procedimiento de la presente invención. La unidad de análisis también se puede configurar para detectar al menos un analito. Además, el dispositivo puede comprender además una unidad de evaluación para evaluar datos obtenidos de la unidad de análisis, por ejemplo, datos relacionados con la determinación de un analito.

Por tanto, en un modo de realización, el dispositivo comprende además una unidad de análisis adaptada para determinar al menos un analito y/o una unidad de evaluación adaptada para calcular una cantidad y/o concentración de dicho analito en dicha muestra. Por tanto, en un modo de realización, el dispositivo es un dispositivo analítico, en un modo de realización, un dispositivo de diagnósticoin vitro.El experto en la técnica se dará cuenta de cómo enlazar los medios mencionados anteriormente sin más preámbulos. En un modo de realización, el dispositivo está adaptado para incluir un rasgo característico adicional como se describe en el presente documento.

En las figuras:

Figura 1: cromatogramas de CL-EM rápidos de una muestra de suero humano preparada con microesferas de enriquecimiento a) sin pretratamiento (PT) y b) con F como reactivo de pretratamiento (PT) y a la que se le agregaron 0,7 ng/ml de testosterona (testo.). Ambas muestras, a) y b), se miden por triplicado.

MRM con ESI, frag.=380,0 V CF=0,000 DF=0,000 CID a 25,0 (292,2000 ^ 99,8000), testo. lgc0001.d;

eje X: tiempo de adquisición (s); eje Y: recuentos x 102

Figura 2: análisis por CL-EM de ciclosporina (CSA) agregada a 64 ng/ml en sangre completa humana libre de analitos purificada por flujo de trabajo con microesferas de enriquecimiento a) sin pretratamiento y b) con un pretratamiento con F4.

PI con ciclosporina-D6: MRM con ESI, frag.=380,0 V CF=0,000 DF=0,000 CID a 30,0 (1225,8500 ^ 1208,8500), ciclo. lgc0002.d;

ciclosporina: MRM con ESI, frag.=380,0 V CF=0,000 DF=0,000 CID a 30,0 (1219,8500 ^ 1202,8500), ciclo. lgc0002.d;

calificador 1 para ciclosporina: MRM con ESI, frag.=380,0 V CF=0,000 DF=0,000 CID a 61,0 (1208,8800 ^ 224,1000), ciclo. lgc0002.d;

calificador 2 para ciclosporina: MRM con ESI, frag.=380,0 V CF=0,000 DF=0,000 CID a 33,0 (1202,8500 ^ 1184,8000), ciclo. lgc0002.d;

eje X: tiempo de adquisición (s); eje Y: recuentos x 102

Figura 3. Análisis por CLEM de testosterona (testo.) agregada a 250 pg/ml en suero humano libre de analitos purificada por un flujo de trabajo con microesferas de enriquecimiento a) sin pretratamiento y b) con un pretratamiento con F4.

a) MRM con ESI, frag.=380,0 V CF=0,000 DF=0,000 CID a 25,0 (289,2200 ^ 96,8000), muestra 16.d; b) MRM con ESI, frag.=380,0 V CF=0,000 DF=0,000 CID a 25,0 (289,2200 ^ 96,8000), muestra 4.d; eje X: tiempo de adquisición (s); eje Y: recuentos x 102

Los siguientes ejemplos meramente ilustrarán la invención. No se interpretarán, en absoluto, para limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1: procedimientos

Muestras:

Muestras de vitamina D (VitD): plasma humano en EDTA, con 0 y 140 o 700 ng/ml de VitD.

Muestras de testosterona (testo.): plasma humano en EDTA, 0 y 15 ng/ml de testo.

Muestras de ciclosporina (CSA): sangre completa humana en EDTA, con 0 y 2000 ng/ml de CSA.

Muestras de everólimus (eve.): sangre completa humana en EDTA, y 0 y 30 ng/ml de eve.

Patrón interno (PI):

10 |jl de PI por 100 |jl de muestra, disuelto en plasma en EDTA o suero humano con 465 ng/ml de VitD (25-hidroxi-vitamina D3, d6), 50 ng/ml de testo. (testosterona, 3x C13), 6600 ng/ml de CSA (ciclosporina, d4 y 3x C l3), 100 ng/ml de eve. (everólimus, d4 y 3x C13).

Procedimiento para el pretratamiento de muestra:

Se usaron vasos Eppendorf como recipientes de pretratamiento (PT). Se mezclaron 100 |jl de muestra (véase anteriormente) con 10 j l de patrón interno (véase anteriormente), se agitó en vórtex durante 10 segundos a temperatura ambiente (TA) y, a continuación, se incubó durante 5 minutos a 37 °C en un agitador (1400 rpm). A continuación, se le añadió el volumen indicado de reactivo de PT a la muestra, se agitó en vórtex durante 10 segundos a TA y, a continuación, se incubó durante un periodo de tiempo definido a 37 °C en un agitador (1400 rpm). Finalmente, la muestra pretratada se evaluó con respecto a la precipitación de proteínas, hemólisis y liberación de analito, como se describe a continuación.

Inspección de la muestra pretratada con respecto a la completitud de los acontecimientos de hemólisis y precipitación:

Se realizó una evaluación cualitativa de los reactivos de PT con respecto a la precipitación de proteínas y hemólisis de sangre completa. Se analizaron por separado la precipitación de proteínas y la hemólisis. Para los experimentos de precipitación de proteínas, se usó plasma en<e>D<t>A como matriz de muestra. Después de realizar el pretratamiento, la muestra pretratada se centrifugó durante 20 minutos a TA (20000 g). Las formulaciones se clasificaron como adecuadas o no adecuadas por análisis visual. Si se observaba un sedimento en el fondo del vaso, la formulación se clasificaba como no adecuada. Para la evaluación de la hemólisis, se usó sangre completa (EDTA) como matriz de muestra. Después de realizar el pretratamiento, la muestra pretratada se introdujo en un capilar de microhematocrito y se centrifugó durante 30 minutos a TA (13000 rpm). La formulación se clasificó como no adecuada para la hemólisis cuando, después de la centrifugación, todavía se observaban glóbulos rojos. En los casos en los que con una determinada formulación no se pudo obtener la hemólisis o bien se observó precipitación, no se realizó ninguna otra evaluación con respecto al grado de liberación de analito.

Inspección de la muestra pretratada con respecto a la completitud de la liberación de analito: procedimiento de Elecsys directo:

Después de pretratar las muestras, la cuantificación de la liberación de analito se realizó en el analizador Elecsys 2010 con ensayos de Elecsys comerciales (CSA, everólimus, testosterona, vitamina D total) por protocolos propios omitiendo la etapa de pretratamiento de Elecsys (CSA y everólimus por medio de precipitación fuera de línea, vitamina D total por medio de desnaturalización en línea, testosterona por medio de competidor R1). Como controles para un 0 o un 100 % de liberación de analito, se midieron las recuperaciones con muestras que contenían analitos libres (acetonitrilo al 30 % v/v/agua con 0 y 700 ng/ml de VitD; octil-13-D-glucopiranósido acuoso al 1 % con 0 y 15 ng/ml de testo.; ZnSO4 100 mM en metanol:etilenglicol 90:10 con 0 y 2000 ng/ml de CSA; y 0 y 30 ng/ml de eve.). Puesto que los fuertes efectos de matriz que proceden de la muestra pretratada provocan problemas en los ensayos de Elecsys (por ejemplo, reducción de la dinámica de señal, deterioro de la reproducibilidad y/o contaminación de la celda de medición), se necesitaron implementar algunas contramedidas. Se desarrollaron y usaron nuevos protocolos de Elecsys con volúmenes de muestra pretratada (PT-S) reducidos y volúmenes de reactivo incrementados. En algunos casos, el efecto de matriz todavía interfería en la señal, por lo tanto, la PT-S se diluyó antes de la medición. Las mediciones de Elecsys se realizaron por triplicado. Adicionalmente, la celda de medición se limpió regularmente. Debido a la imprecisión de los procedimientos de Elecsys modificados, las formulaciones se clasificaron como que generaban una "liberación de analito completa" cuando ya mostraban recuperaciones > 90 %, y como aceptables cuando mostraban recuperaciones de un 80-90 %. Las buenas formulaciones muestran los 3 rasgos característicos: una liberación de analito completa, hemólisis completa y ninguna precipitación.

Inspección de la muestra pretratada con respecto a la completitud de la liberación de analito: procedimiento de ELL (extracción líquido-líquido):

Después de pretratar las muestras, la PT-S se envió a una ELL para reducir los efectos de matriz para la etapa de cuantificación de analito final con los ensayos de Elecsys. Se añadieron 650 j l de disolvente orgánico a la PT-S (n-hexano para VitD, testo. y CSA, acetato de etilo para eve.) y se mezclaron suavemente durante 3 minutos a temperatura ambiente (TA). Después de una breve centrifugación (40 s a 21000 g, TA), se transfirieron 500 j l de la fase orgánica sobrenadante a un tubo Eppendorf y se evaporó a 30 °C en un SpeedVac hasta sequedad. El extracto seco se disolvió. CSA y eve. en 300 j l del reactivo de pretratamiento ISD de Elecsys, diluido 1:2 con solución de NaCl al 0,9 %; VitD en 100 j l de acetonitrilo al 50 % v/v/agua seguido de dilución de 80 j l de este reactivo con 180 j l de suero humano, empobrecido en VitD. Se disolvió testo. en acetonitrilo al 30 % v/v/agua seguido de una dilución de 50 j l de este reactivo con 200 j l de suero humano, libre de esteroides. Finalmente, las soluciones se midieron en el Elecsys con los protocolos de ensayo originales. Como controles para una liberación de analito de un 100 %, las muestras también se trataron en paralelo con un reactivo de PT que funcionaba bien, como se determinó con el procedimiento de Elecsys directo mencionado anteriormente, y se procesaron de forma análoga con el procedimiento de ELL, y finalmente se cuantificaron en el Elecsys usando los protocolos de ensayo originales. Debido a la imprecisión del procedimiento, las formulaciones se clasificaron como que generaban una "liberación de analito completa" cuando ya mostraban recuperaciones > 90 %, y como aceptables cuando mostraban recuperaciones de un 80-90 %. Las buenas formulaciones muestran los 3 rasgos característicos: una liberación de analito completa, hemólisis completa y ninguna precipitación.

Ejemplo 2: liberación de analito

La primera formulación "F" que se evaluó de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente y que proporcionó una liberación de analito y hemólisis completas sin formar precipitados consistía en:

guanidina (gua.) HCl 5 M, carbonato de etileno (EtC) 0,5 M, ACN al 15 %, octil-13-D-glucopiranósido (OI3DG) al 1,5 %, pH 6,5±0,3, volumen de 200 |jl por 100 |jl de muestra y tiempo de incubación de 15 min a 37 °C (tabla 1).

Tabla 1: formulación F, volumen de 200 j l por 100 j l de muestra y tiempo de incubación de 15 min a 37 °C

Se pudo demostrar que los reactivos se pueden intercambiar por reactivos alternativos de la misma clase sin afectar a la función, y también proporcionó una liberación de analito y hemólisis completas sin formar precipitados. También se sometieron a prueba las variantes usando 200 j l de reactivo de PT por 100 j l de muestra y tiempo de incubación de 15 min a 37 °C (tabla 2).

• F-V1: urea 5 M, EtC 0,5 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

• F-V2: gua. 5 M, carbonato de propileno 0,5 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

• F-V3: gua. 5 M, 1,2-carbonato de glicerol 0,5 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

• F-V4: gua. 5 M, EtC 0,5 M, n-propanol al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

Tabla 3: variantes de F, volumen de 200 j l por 100 j l de muestra y tiempo de incubación de 15 min a 37 °C

Se redujeron progresivamente los componentes únicos de F para mostrar su impacto sobre el pretratamiento. También se sometieron a prueba las variantes usando 200 j l de reactivo de PT por 100 j l de muestra y tiempo de incubación de 15 min a 37 °C (tabla 3).

• F-V5: gua. 2,5 M, EtC 0,5 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

• F-V6: gua.1,25 M, EtC 0,5 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

• F-V7: gua.0,63 M, EtC 0,5 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

• F-V8: gua.0 M, EtC 0,5 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

• F-V9: gua.5 M, EtC 0,25 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

F-V10: gua. 5 M, EtC 0,13 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

F-V11: gua. 5 M, EtC 0 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

F-V12: gua. 5 M, EtC 0,5 M, ACN al 30 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

F-V13: gua. 5 M, EtC 0,5 M, ACN al 20 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

F-V14: gua. 5 M, EtC 0,5 M, ACN al 10 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

F-V15: gua. 5 M, EtC 0,5 M, ACN al 5 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

F-V16: gua. 5 M, EtC 0,5 M, ACN al 0 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3.

Tabla 3a: variantes de F, volumen de 200 |jl por 100 |jl de muestra y tiempo de incubación de 15 min a 37 °C (LA: liberación de analito, SP: sin precipitación de proteínas; hem.: hemólisis completa)

Ejemplo 3: interferencia en el enriquecimiento con microesferas

La formulación F muestra interferencias para testo. y CSA en el análisis por CL-EM/EM basada en enriquecimiento con microesferas, es decir, pérdida de intensidad de señal por supresión iónica: durante la optimización del flujo de trabajo de enriquecimiento con microesferas, se investigaron las condiciones para el pretratamiento de las muestras usando el diseño de experimentos. El procedimiento de lectura para este estudio fue un procedimiento de HPLC multiplexada con una larga etapa de cromatografía (7,5 min) y detección espectrométrica de masas. Se eligió el reactivo F como reactivo de pretratamiento y las condiciones del flujo de trabajo fueron como sigue:

Para suero (testosterona/25-OH-vitamina D3): 100 j l de suero 100 j l de PT-F; microesferas de 50 j l en formiato de amonio al 0,1 % (25 mg/ml); lavado: 2x con ACN/H<2>O 5:95 NH<4>OH 5 mM; elución: 100 j l de A<c>N FA al 2 %.

Para sangre completa (ciclosporina/everólimus): 100 j l de muestra 200 j l de PT-F; microesferas de 50 j l en ACN al 15 % (25 mg/ml); lavado: 2x con ACN/H<2>O 35:65 NH<4>OH 5 mM;

elución: 100 j l de ACN FA al 2 %

A continuación, se prepararon muestras humanas usando estos flujos de trabajo optimizados y se les agregaron concentraciones de analitos correspondientes al punto de decisión médica. El análisis se realizó usando procedimientos de CL-EM específicos de analito con una etapa de cromatografía rápida. El ejemplo (figura 1) muestra el efecto de una etapa de pretratamiento con el reactivo F sobre la sensibilidad del análisis por CL-EM de testosterona (testo.). Se obtuvo una reducción de señal similar para ciclosporina (CSA). La intensidad de señal para testosterona cuando se usó F como pretratamiento fue de solo aprox. un 10 % de la señal de analito obtenida sin pretratamiento. Sin quedar vinculado a ninguna teoría, este efecto se debe lo más probablemente al hecho de que el procedimiento de lavado en el flujo de trabajo de enriquecimiento no fue suficiente para retirar todos los rastros de reactivo después de la etapa de pretratamiento. La sal de guanidinio residual que se arrastró a través del flujo de trabajo hasta la etapa de elución pudo ser la causa de fuertes efectos de supresión iónica que dieron lugar a la pérdida de sensibilidad.

Formulaciones con menos guanidina HCl, F4, F6:

Se evaluaron otras dos formulaciones, F4 y F6, que contenían menos guanidina HCl de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente y consistían en:

• F4: gua. 2 M, EtC 0,5 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3, volumen de 200 |jl por 100 |jl de muestra y tiempo de incubación de 15 min a 37 °C.

• F6: gua. 0,5 M, EtC 0,5 M, ACN al 15 %, OI3DG al 1,5 %, pH 6,5±0,3, volumen de 200 j l por 100 j l de muestra y tiempo de incubación de 15 min a 37 °C.

Los resultados se muestran en la tabla 4. Son posibles tiempos de pretratamiento más cortos que los 15 min indicados. Para F4, se inspeccionó que también 3 min funcionaban bien.

Tabla 4: F4 y F6, volumen de 200 j l por 100 j l de muestra y tiempo de incubación de 15 min a 37 °C

Estas formulaciones no muestran interferencias en el análisis por CL-EM/EM basada en enriquecimiento con microesferas.

La reducción de la concentración de guanidina tuvo un efecto positivo sobre la liberación de analito o hemólisis de las muestras. El efecto de F4 sobre la detección por CL-EM usando cromatografía rápida se evaluó usando ciclosporina (CSA), testosterona (testo.) y vitamina D (VitD). La menor concentración de guanidina frente a F es beneficiosa para reducir el efecto de supresión iónica. La figura 2 muestra que la ciclosporina se pudo medir por CL-EM rápida después del pretratamiento usando el reactivo F4 sin pérdida de sensibilidad significativa en comparación con la matriz extraída sin pretratamiento. También para la testosterona se pudo demostrar que no se observaba pérdida de sensibilidad al pretratarse/liberarse con F4 (véase la figura 3) en comparación con la supresión iónica observada con F (véase la figura 1).

Ejemplo 4: estabilidad del reactivo

Los reactivos de PT se sometieron a agresión a 35 °C durante 3 semanas en el estudio de periodo de validez acelerado (PVA, modelo de tiempo de periodo de validez de 18 meses) y a 12 °C durante hasta 29 días en el estudio de estabilidad a bordo (EaB). En ambos estudios, los reactivos se sometieron a agresión en microtubos de 2 ml (polipropileno). Los reactivos de PVA y EaB sometidos a agresión y los correspondientes reactivos no sometidos a agresión (T0) se almacenaron a -80 °C hasta sus pruebas funcionales. Los reactivos de PT sometidos a agresión y no sometidos a agresión se sometieron a prueba aplicándolos en el flujo de trabajo de pretratamiento de muestra (véase anteriormente, 100 j l de muestra, 10 j l de PI, pretratamiento con 200 j l de reactivo de PT durante 15 min a 37 °C) seguido de la medición de las recuperaciones de liberación de analito con el procedimiento de Elecsys descrito anteriormente. El valor de recuperación de la muestra sometida a agresión se comparó con el análogo no sometido a agresión (T0, 100 %) y, debido a la imprecisión del procedimiento de Elecsys modificado, las formulaciones se clasificaron como estables cuando ya mostraban recuperaciones > 90 %. Los resultados se muestran en la tabla 5.

Tabla 5: recuperaciones en PVA y EaB de F/F4/F6, volumen de 200 j l por 100 j l de muestra y tiempo de incubación de 15 min a 37 °C (n.a.: no aplicable puesto que no se puede lograr una hemólisis completa)

Ejemplo 4: disminución del volumen de reactivo de pretratamiento

Se evaluó otra formulación, F0, que contenía las concentraciones más altas de componentes únicos de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente con respecto a tiempos de PT más rápidos y el uso de menores volúmenes para el PT (véase la tabla 6). F0 consistía en: gua. 6 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3. Los tiempos y volúmenes sometidos a prueba se representan en la tabla 6; ninguna de las condiciones sometidas a prueba provocó una precipitación. Sin embargo, con volúmenes inferiores a 50 |jl no se pudo lograr una hemólisis completa; por lo tanto, el volumen mínimo sometido a prueba para la determinación de la liberación de analito fue de 50 jl. Las condiciones seleccionadas en base a estos resultados para los experimentos de seguimiento fueron:

F0: gua. 6 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3, volumen de 50 j l por 100 j l de muestra y tiempo de incubación de 5 min a 37 °C

Tabla 6: liberación de analito con F0, 100 j l de muestra e incubación a 37 °C con tiempo y volumen variables

Se redujeron progresivamente los componentes únicos de F0 para mostrar su impacto sobre el pretratamiento. También se sometieron a prueba las variantes usando 50 j l de reactivo de PT por 100 j l de muestra y tiempo de incubación de 5 min a 37 °C (tabla 7).

F0-V1: gua. 4 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3

F0-V2: gua. 3 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3.

F0-V3: gua. 1 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3.

F0-V4: gua. 0 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3.

F0-V5: gua. 6 M, EtC 0,3 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3.

F0-V6: gua. 6 M, EtC 0,15 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3.

F0-V7: gua. 6 M, EtC 0 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3.

F0-V8: gua. 6 M, EtC 0,6 M, ACN al 9 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3.

F0-V9: gua. 6 M, EtC 0,6 M, ACN al 4,5 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3.

F0-V10: gua. 6 M, EtC 0,6 M, ACN al 0 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3.

• F0-V11: gua.6 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 0,9 %, pH 6,5±0,3.

• F0-V12: gua.6 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 0,45 %, pH 6,5±0,3.

• F0-V13: gua.6 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 0 %, pH 6,5±0,3.

Tabla 7: variantes de F0, volumen de 50 pl por 100 pl de muestra y tiempo de incubación de 5 min a 37 °C (LA: liberación de analito, SP: sin precipitación de proteínas; hem.: hemólisis completa)

Se evaluó la influencia de otros valores de pH para F0 y otras temperaturas para el pretratamiento con F0. También se sometieron a prueba las variantes usando 50 pl de reactivo de PT por 100 pl de muestra y tiempo de incubación de 5 min (tabla 8). 60 °C dan lugar a precipitaciones y formación de costras en los bordes de los viales.

• F0-V14: gua. 6 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 5,0. PT a 37 °C

• F0-V15: gua. 6 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 8,0. PT a 37 °C

• F0-V16: gua. 6 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3. PT a 6 °C.

• F0-V17: gua. 6 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3. PT a 22 °C.

• F0-V18: gua. 6 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3. PT a 50 °C.

• F0-V19: gua. 6 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 %, pH 6,5±0,3. PT a 60 °C.

Tabla 8: variantes de F0, volumen de 50 pl por 100 pl de muestra y tiempo de incubación de 5 min a 37 °C (LA: liberación de analito, SP: sin precipitación de proteínas; hem.: hemólisis completa)

Con la variante F0 F0-V7 se descubrió que no se requería carbonato de etileno para lograr una liberación de analito completa. En la siguiente etapa se inspeccionó si el carbonato de etileno ayuda a reducir la cantidad requerida de guanidina HCl en F0, dando, por tanto, la posibilidad de minimizar su interferencia en el análisis por CL-EM/EM (por ejemplo, supresión iónica). Puesto que VitD es el caso más difícil en términos de liberación de analito, estos experimentos se realizaron solo con VitD. Finalmente, con la variante de trabajo (F0-29) se sometieron a prueba los demás analitos. Las variantes se sometieron a prueba usando 50 |jl de reactivo de PT por 100 |jl de muestra y tiempo de incubación de 5 min (tabla 9); solo para 2 variantes (V26, V-27) el tiempo de incubación sometido a prueba fue de 15 min.

• F0-V20: gua.2 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 % pH 6,5±0,3.

• F0-V21: gua.2 M, EtC 1,2 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 % pH 6,5±0,3.

• F0-V22: gua.2 M, EtC 2,4 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 % pH 6,5±0,3.

• F0-V23: gua. 3 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 % pH 6,5±0,3.

• F0-V24: gua. 3 M, EtC 1,2 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 % pH 6,5±0,3.

• F0-V25: gua. 3 M, EtC 2,4 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 % pH 6,5±0,3.

• F0-V26: gua.2 M, EtC 2,4 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 % pH 6,5±0,3. 15 min

• F0-V27: gua. 3 M, EtC 2,4 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 % pH 6,5±0,3. 15 min

• F0-V28: gua.4 M, EtC 0,6 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 % pH 6,5±0,3.

• F0-V29: gua.4 M, EtC 2,4 M, ACN al 18 %, OI3DG al 1,8 % pH 6,5±0,3.

Tabla 9: variantes de F0, volumen de 50 j l por 100 j l de muestra y tiempo de incubación de 5 min a 37 °C (LA: liberación de analito, SP: sin precipitación de proteínas; hem.: hemólisis completa)

Como se apreciará también a partir de experimentos con las variantes F-V11 y F0-V7 anteriormente, incluir un agente que proporcione iones de bicarbonato permite la reducción de la concentración del agente caotrópico en un factor de aproximadamente 2.

Además, se evaluaron formulaciones minimalistas tomando solo un componente de F0, así como una variante de dos componentes que contenía los solubilizantes ACN u OI3DG. Se sometieron a prueba las variantes usando 50 j l de reactivo de PT por 100 j l de muestra y tiempo de incubación de 5 min (tabla 10).

• F0-V30: gua. 6 M

• F0-V31: EtC 0,6 M

• F0-V32: ACN al 18 %

• F0-V33: OI3DG al 1,8 %

• F0-V34: gua. 6 M, OI3DG al 1,8 %

• F0-V35: gua. 6 M, ACN al 18%

•F0-V36: EtC 0,6 M, OI3DG al 1,8 %

• F0-V37: EtC 0,6 M, ACN al 18 %

Tabla 10: variantes de F0, volumen de 50 |jl por 100 |jl de muestra y tiempo de incubación de 5 min a 37 °C (LA: liberación de analito, SP: sin precipitación de proteínas; hem.: hemólisis completa)

Ejemplo 5: flujo de trabajo con microesferas

Las formulaciones F, F4 y F0 se inspeccionaron en el flujo de trabajo de enriquecimiento con microesferas. Se equilibraron 100 j l de muestra (suero al que se le agregó VitD, testo., CSA y eve.) durante 15 min a TA. A continuación, se añadió reactivo de PT (F y F4: 200 jl; F0: 50 j l) a la muestra y se incubó (F y F4: 15 min; F05 min) a 37 °C. Después de la adición de 50 j l de suspensión de microesferas (~2,5 mg de microesferas) y el equilibrio durante 5 minutos a TA, se realizó una separación magnética. Se llevaron a cabo dos etapas de lavado, conteniendo cada una 200 j l de solución acuosa, seguido de la etapa de elución con 100 j l de acetonitrilo (ACN)/ácido fórmico (FA) acuoso al 2 % 70/30 o acetonitrilo/ácido fórmico al 2 % 98/2. Después de la separación magnética, se mezclaron 80 j l de sobrenadante con 5 j l de PI (en metanol al 50 %/agua), de los que 5 j l se inyectaron y cuantificaron por CL-EM/EM. Para este estudio, el PI se añadió en la etapa final para determinar el rendimiento de analito global después del flujo de trabajo. La recuperación de analito encontrada en el flujo de trabajo de enriquecimiento con microesferas depende de varios parámetros, como el tipo de microesferas usadas para la captura del analito (extracción en fase sólida por medio de exclusión por tamaño, fase inversa y/o intercambio iónico) y la composición del tampón de microesferas, las condiciones de lavado, el disolvente de elución de microesferas, la formulación y el volumen del reactivo de pretratamiento, el tiempo de pretratamiento. Condiciones de CL-EM/EM: columna de Phenomenex, F5 (partícula de 2,6 jm , 150 x 2,1 mm); temperatura de columna de 40 °C; gradiente (véase la tabla 11) con disolvente A (acetato de amonio 2 mM, ácido fórmico al 0,1 % en agua) y disolvente B (acetato de amonio 2 mM, ácido fórmico al 0,1 % en un 95 % de ACN más un 5 % de agua); EM/EM con supervisión de reacciones múltiples.

Tabla 11: gradiente de CL

Los resultados obtenidos para los reactivos de PT F, F4 y F0 en combinación con tipos de microesferas diferentes y tampones de microesferas diferentes se resumen en la tabla 13. Se obtuvieron rendimientos buenos o aceptables, especialmente con F4 y F0 en combinación con la elución del analito por ACN/FA al 2 % 98/2.

Tabla 12: recuperaciones de analito en un flujo de trabajo con microesferas de enriquecimiento y cuantificación por CL-EM/EM

Ejemplo 6: formulaciones genéricas

Se descubrió que varios reactivos de PT eran genéricos para la liberación de analito y hemólisis completas (en el caso de ISD), además de no mostrar precipitación (véase la tabla 13). Las formulaciones eran estables y estaban listas para usar para un procedimiento de PT de 1 etapa y eran compatibles con el flujo de trabajo de enriquecimiento con microesferas. Para reducir el potencial de interferencias en CL-EM/EM, tales como supresión iónica, y, al mismo tiempo, reducir los volúmenes de reactivo requeridos para el PT, se desarrolló la formulación F0-V29.

Tabla 13: formulaciones de PT genéricas

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimientoin vitropara liberar analitos de una muestra que comprende poner en contacto dicha muestra con (i) un agente caotrópico, (ii) un disolvente orgánico, (iii) un detergente y (iv) al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato,

en el que la concentración de dicho agente caotrópico es de desde 1 M a 4 M;

en el que la concentración de dicho disolvente orgánico es de desde un 2 % (v/v) a un 20 % (v/v);

en el que la concentración de dicho detergente es de desde un 0,2 % (p/v) a un 20 % (p/v);

en el que la concentración de iones de bicarbonato proporcionados formalmente por dicho al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato es de desde 0,1 M a 2 M,

en el que dicho agente caotrópico es clorhidrato de guanidina y/o urea;

en el que dicho disolvente orgánico es acetonitrilo;

en el que dicho detergente es un detergente no iónico;

en el que dicho al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato comprende un éster de carbonato cíclico,

en el que dicha muestra es una muestra de un líquido corporal, una muestra de células separadas, una muestra de un tejido o un órgano o una muestra de líquido de lavado/aclarado obtenido de una superficie corporal exterior o interior,

en el que dichos analitos comprenden al menos uno de una hormona esteroidea, un oligopéptido, un policétido y una vitamina,

y en el que el pH durante dicho contacto es de desde 3 a 9.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha hormona esteroidea es al menos una de un andrógeno, un estrógeno y un progestágeno, en un modo de realización es testosterona;

en el que dicho oligopéptido es un antibiótico oligopeptídico cíclico, en un modo de realización es ciclosporina; en el que dicho policétido es un macrólido, tacrólimus, sirólimus o everólimus, en otro modo de realización es everólimus; y/o

en el que dicha vitamina es una vitamina D, en otro modo de realización es una vitamina D3, en otro modo de realización es 25-hidroxi-vitamina D3.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dichos analitos comprenden al menos uno, en un modo de realización, al menos dos, en otro modo de realización, al menos tres, en otro modo de realización, todos de testosterona, ciclosporina, everólimus y 25-hidroxi-vitamina D3.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,

en el que dicho detergente es un alquil-glucósido; en otro modo de realización es p-D-octil-glucósido;

en el que dicho al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato comprende o es carbonato de etileno; y/o

en el que dicha muestra es una muestra de sangre, plasma o suero.

5. Un agente de liberación para liberar al menos un analito de una muestra que comprende

(i) un agente caotrópico, (ii) un disolvente orgánico, (iii) un detergente y (iv) al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato

en el que dicho agente caotrópico es clorhidrato de guanidina y/o urea;

en el que dicho disolvente orgánico es acetonitrilo;

en el que dicho detergente es un detergente no iónico, en un modo de realización es un alquil-glucósido; en otro modo de realización es p-D-octil-glucósido;

en el que dicho al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato comprende un éster de carbonato cíclico, en un modo de realización, comprende o es carbonato de etileno;

en el que dicho al menos un analito se selecciona de la lista que consiste en una hormona esteroidea, un oligopéptido, un policétido y una vitamina; y

en el que dicha muestra es una muestra de un líquido corporal, una muestra de células separadas, una muestra de un tejido o un órgano o una muestra de líquido de lavado/aclarado obtenido de una superficie corporal exterior o interior.

6. El agente de liberación de la reivindicación 5, en el que dicho agente de liberación es una solución triplemente concentrada y

en el que la concentración de dicho agente caotrópico es de desde 2 M a saturada;

en el que la concentración de dicho disolvente orgánico es de desde un 2 % (v/v) a un 30 % (v/v);

en el que la concentración de dicho detergente es de desde un 0,5 % (p/v) a un 20 % (p/v);

en el que la concentración de iones de bicarbonato proporcionados formalmente por dicho al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato es de desde 0,1 M a 6 M.

7. Uso de (I) una composición que comprende (i) un agente caotrópico, (ii) un disolvente orgánico, (iii) un detergente y (iv) al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato,

en el que dicho agente caotrópico es clorhidrato de guanidina y/o urea;

en el que dicho disolvente orgánico es acetonitrilo;

en el que dicho al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato comprende un éster de carbonato cíclico, en un modo de realización comprende o es carbonato de etileno

como agente de liberación para al menos un analito de una muestra, en el que dicho analito comprende al menos uno de una hormona esteroidea, un oligopéptido, un policétido y una vitamina; y

en el que dicha muestra es una muestra de un líquido corporal, una muestra de células separadas, una muestra de un tejido o un órgano o una muestra de líquido de lavado/aclarado obtenido de una superficie corporal exterior o interior;

en el que la concentración de dicho agente caotrópico en contacto con la muestra es de desde 1 M a 4 M; en el que la concentración de dicho disolvente orgánico en contacto con la muestra es de desde un 2 % (v/v) a un 20 % (v/v);

en el que la concentración de dicho detergente en contacto con la muestra es de desde un 0,2 % (p/v) a un 20 % (p/v);

en el que la concentración de iones de bicarbonato proporcionados formalmente por dicho al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato en contacto con la muestra es de desde 0,1 M a 2 M; y en el que el pH durante dicho contacto es de desde 3 a 9;

y/o (II) el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para liberar un analito de una muestra.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que dicha composición es un agente de liberación de acuerdo con la reivindicación 6.

9. Un kit para liberar al menos un analito de una muestra que comprende (i) un agente caotrópico, (ii) un disolvente orgánico, (iii) un detergente y (iv) al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato comprendidos en una carcasa,

en el que dicho agente caotrópico es clorhidrato de guanidina y/o urea;

en el que dicho disolvente orgánico es acetonitrilo;

en el que dicho detergente es un detergente no iónico, en un modo de realización es un alquil-glucósido; en otro modo de realización es p-D-octil-glucósido; y

en el que dicho al menos un agente que proporciona iones de bicarbonato comprende un éster de carbonato cíclico, en un modo de realización comprende o es carbonato de etileno; y

10. El kit de la reivindicación 9 que comprende el agente de liberación de acuerdo con la reivindicación 5 o 6.

11. El kit de la reivindicación 9 o 10, que comprende además al menos un agente de detección para al menos un analito.

12. Un procedimiento para determinar al menos un analito en una muestra que comprende

(a) liberar dicho analito de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para generar un extracto;

(b) determinar dicho analito liberado en dicho extracto; y, de este modo,

(c) determinar dicho analito en una muestra.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho procedimiento es un procedimiento para determinar una multitud de analitos, en un modo de realización, en el que dicha multitud es de al menos dos, en un modo de realización, de al menos cuatro, en otro modo de realización, de al menos diez, en otro modo de realización, de al menos 25, en otro modo de realización, de al menos 50 analitos.

14. Un dispositivo para determinar un analito en una muestra que comprende el agente de liberación de acuerdo con la reivindicación 5 o 6 y configurado para realizar el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y/o 12 o 13, en el que dicho dispositivo comprende además una unidad de análisis adaptada para determinar al menos un analito y, opcionalmente, una unidad de evaluación adaptada para calcular una cantidad y/o concentración de dicho analito en dicha muestra.