CN101144802A - 莪术油的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种莪术油及其制剂的HPLC分析方法。本发明的HPLC分析方法应用于各种制备工艺(超临界CO2流体萃取、水蒸气蒸馏、有机溶剂提取等)提取的莪术油成分分离分析测定，应用于由莪术油制备的各种制剂中莪术油成分分离分析测定，应用于莪术油制备过程中的监测和莪术油制剂的中间样品的监测；应用于莪术油中有关物质的检查及进行莪术油和制剂指纹图谱的研究。本发明的HPLC分析方法简便快速，灵敏度高，重复性好，并且能准确、真实的反映莪术油的主要成分。
Description
技术领域
本发明涉及莪术油及其制剂的分析方法，具体的涉及莪术油及其制剂的HPLC分析方法。
背景技术
莪术油及其注射液为中国药典收载品种，是一种经临床证明疗效确切的抗病毒、抗癌药。莪术油的分离分析方法一直是采用气相色谱法(GC)或气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，但由于莪术油的有效组分为多种倍半萜类化合物，而GC或GC-MS进样室和色谱柱的温度高，使得某些倍半萜类化合物在高热条件下发生转化，影响了莪术油的临床疗效和其制剂稳定性。例如温莪术油抗癌主成分-呋喃二烯(Furanodiene，又名：蓬莪术环二烯，分子式：C15H20O)在100℃或100℃以上加热过程中易发生周环化发应，生成莪术烯(6-甲二叉甲基-4，5，6，7-四氢-3，6-二甲基-5异丙烯基-反式-苯并呋喃)。莪术烯经家兔肌肉刺激性实验证实会产生明显刺激性作用。
药典收载的莪术油注射液和莪术油葡萄糖注射液含量测定均是采用香草醛硫酸显色，于520nm波长处测定吸光度值检测莪术醇含量的可见分光光度法。由于香草醛硫酸显色剂是通用型显色剂，专属性差，经试验证明不含有莪术醇的莪术油注射液采用此方法测定会呈假阳性反应，且含量往往高于68％，说明该方法不适合作为莪术油注射液的含量测定方法。因此找到一种适合作为莪术油及其注射液含量的测定方法是药学人员长期以来都想解决的难题。
发明内容
本发明提供了莪术油的HPLC分析方法。
本发明提供的方法中：固定相为C2、C4、C8、C10或C18的反相柱，流动相为有机溶剂和水的混合物，洗脱方式分为等度洗脱和梯度洗脱，等度洗脱流动相为：乙腈∶水＝60∶40～90∶10或甲醇∶水＝70∶30～98∶2；梯度洗脱方式的流动相中乙腈的起始浓度为100～80％，最终浓度为80～60％。
本发明方法中的梯度洗脱方式中，有机溶剂的浓度是连续性递减或者间歇性递减。
本发明提供的方法可应用于各种制备工艺(超临界CO2流体萃取、水蒸气蒸馏、有机溶剂提取等)提取的莪术油成分分离分析测定，可应用于由莪术油制备的各种制剂中莪术油成分分离分析测定，也可应用于莪术油制备过程中的监测和莪术油制剂的中间样品的监测；还可应用于莪术油中有关物质的检查及进行莪术油和制剂的指纹图谱研究。
本发明提供的高效液相色谱法(HPLC)作为莪术油及其制剂的检测方法，由HPLC法代替气相色谱法(GC)或气相色谱-质谱联用法(GC-MS)分离分析莪术油的倍半萜类成分，避免了GC或GC-MS进样室和色谱柱的高温对莪术油及其制剂中有效成分的破坏，并且代替可见分光光度法分离分析莪术油制剂中的多种倍半萜类化合物。该方法能真实的反应莪术油及其制剂的成分，且可以同时分离分析多种倍半萜类化合物，可以为其质量控制提供依据。
本发明的有益效果在于：将莪术油的有效组分多种倍半萜类化合物同时进行分离分析，各成分间的分离度提高，分析莪术油及其制剂的准确性提高。
以下以具体实施例对本发明做进一步说明，但并不限于此。
具体实施方式：
实施例1：选用反相HPLC法定性定量分析6种倍半萜类化合物对照品，
仪器：美国Agilent1100高效液相色谱：配备DE23922775型四元泵；DE2392205series自动进样系统；JP24020624型紫外检测器；JP13208646型在线脱气机；Agilent Rev.A.09.03[1417]化学工作站。
色谱条件：Discovery C18HPLC色谱柱：25cm×4.6mm×5um；流动相：甲醇-水(90∶10)；
检测波长：215nm；柱温：室温；流速：1ml/min；进样量：20μl。
对照品：
吉马酮(牻牛儿酮)由黑龙江省药品检验所提供；
莪术醇由中国药品生物制品检定所提供；
β-榄香烯由大连医药科学研究所提供；
莪术二酮、呋喃二烯、莪术烯自提，纯度均大于98％(孙秀燕；郑艳萍等，温莪术环状含氧倍半萜类化学成分的研究，分析测试学报，2006年，第25卷，第6期，第27-30页)结果显示：6个倍半萜类化合物对照品在上述色谱条件下所得色谱图中的色谱峰从左到右分别为莪术二酮、莪术醇、吉马酮、莪术烯、呋喃二烯和β-榄香烯(见附图1)，且6个成分可达到完全分离，分离度均大于1.5。
实施例2：选用反相HPLC法定性定量分析超临界CO2流体萃取法制备的莪术油
仪器：同实例1；
色谱条件：Discovery C18HPLC色谱柱：25cm×4.6mm×5um；流动相：甲醇-水(90∶10)；
检测波长：215nm；柱温：室温；流速：1ml/min；进样量：20μl。
供试品：超临界CO2流体萃取工艺制备(莪术药材购自瑞安市陶山镇沙洲村温莪术专业合作社，由沈阳药科大学中药学院包文芳教授鉴定为温郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。提取工艺：萃取压力18Mpa，萃取温度为55℃；分离釜I压力12Mpa，温度为55℃，分离釜II压力为7Mpa，温度为45℃；CO2流量为100kg/h，萃取时间2h)的温莪术油，用甲醇溶解，制成浓度为11.2μg/ml的溶液。
检测结果显示：该莪术油中含有呋喃二烯为31.3％，吉马酮(牻牛儿酮)为15.5％，莪术二酮为11.7％(见附图2)。
实施例3：选用反相HPLC法定性定量分析水蒸气蒸馏法制备的莪术油-1
仪器：同实例1；
色谱条件：Discovery C18HPLC色谱柱：25cm×4.6mm×5um；流动相：甲醇-水(90∶10)；
检测波长：215nm；柱温：室温；流速：1ml/min；进样量：20μl。
供试品：水蒸气蒸馏得到的莪术油-1(莪术药材来源同实例2，依据《中国药典》2005版1部莪术油项下提取工艺制得)，用甲醇溶解，制成浓度为35.6μg/ml的溶液。检测结果显示：该莪术油中含有呋喃二烯为18.6％，莪术烯为15.3％，吉马酮为10.4％，莪术二酮含量为6.7％(见附图3)。
实施例4：选用反相HPLC法定性定量分析有机溶剂提取的莪术油
仪器：同实例1；
色谱条件：Discovery C18HPLC色谱柱：25cm×4.6mm×5um；流动相：甲醇-水(95∶5)；
检测波长：215nm；柱温：室温；流速：1ml/min；进样量：20μl。
供试品：有机溶剂乙酸乙酯提取(莪术药材来源同实例2，采用乙酸乙酯20ml浸泡2g温莪术药材粉末(过24目筛)24h，室温下挥干溶剂)得到的莪术油，用甲醇溶解，制成浓度为120.6μg/ml的溶液。
检测结果显示：该莪术油中含有呋喃二烯为35.8％，吉马酮为12.5％，莪术二酮含量为7.6％(见附图4)。
实施例5：选用反相HPLC法定性定量分析呋喃二烯和莪术烯
仪器：同实例1；
色谱条件：Discovery C18HPLC色谱柱：25cm×4.6mm×5um；流动相：乙腈-水(75∶25)；
检测波长：215nm；柱温：35℃；流速：1ml/min；进样量：20μl。
对照品：呋喃二烯、莪术烯(来源如检测方法1所述)。
结果显示：在上述色谱条件下，呋喃二烯和莪术烯的分离度均大于1.5。该方法可用于定性和定量分析温莪术油中的呋喃二烯和莪术烯，并可作为莪术油中的相关物质-莪术烯的检测方法。色谱图见附图5。
实施例6：选用反相HPLC法定性定量分析水蒸气蒸馏法制备的莪术油-2
仪器：同实例1；
色谱条件：Discovery C8硅胶柱：25cm×4.6mm×5um；流动相：乙腈-水的体积比＝92∶8，乙腈的比例是连续性递减，洗脱10分钟后，流动相中乙腈-水的体积比＝70∶30；检测波长：215nm；柱温：室温；流速：1ml/min；进样量：20μl。
供试品：水蒸气蒸馏得到的莪术油-2(莪术药材来源同实例2，自提，依据《中国药典》2005版1部莪术油项下提取工艺制得)，用甲醇溶解，制成浓度为152.8μg/ml的溶液。
检测结果显示：梯度洗脱分析莪术油中极性大的多个组分的分离效果明显优于等度洗脱，说明在分离分析结构性质相近的多个组分中更适合采用梯度洗脱方式。色谱图见附图6。
附图说明
图1是6个倍半萜类化合物对照品的HPLC色谱图。
图2是超临界CO2流体萃取法制备的莪术油的HPLC色谱图。
图3是水蒸气蒸馏法制备的莪术油-1的HPLC色谱图。
图4是有机溶剂(乙酸乙酯)提取得到的莪术油的HPLC色谱图。
图5是呋喃二烯和莪术烯的HPLC色谱图。
图6是水蒸气蒸馏法制备的莪术油-2的HPLC色谱图。
Claims (5)
1.一种莪术油及其制剂的HPLC分析方法，在该方法中：固定相为C2、C4、C8、C10或C18的反相柱，流动相为有机溶剂和水的混合物，洗脱方式分为等度洗脱和梯度洗脱，度洗脱流动相为：乙腈∶水＝60∶40～90∶10或甲醇∶水＝70∶30～98∶2，梯度洗脱方式中流动相中乙腈的起始浓度为100～80％，最终浓度为80～60％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在该梯度洗脱的方式中，有机溶剂的浓度是连续性递减或者间歇性递减。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：等度洗脱流动相为：乙腈∶水＝70∶30～85∶15或甲醇∶水＝80∶20～95∶5，梯度洗脱流动相中乙腈的起始浓度为95～85％，最终浓度为75～65％。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，本发明提供的方法可应用于各种制备工艺(超临界CO2流体萃取、水蒸气蒸馏、有机溶剂提取等)提取的莪术油成分分离分析测定。
5.根据权利要求4所述的方法，该方法可应用于由莪术油制备的各种制剂中的成分分离分析测定，也可应用于莪术油制备过程中的监测和莪术油制剂的中间样品的监测；还可应用于莪术油中有关物质的检查及进行莪术油和制剂的指纹图谱研究。
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