CN107976492A - 一种血栓通注射剂中蛋白质类生物大分子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血栓通注射剂中蛋白质类生物大分子的检测方法，采用高效液相法测定血栓通注射剂中的蛋白质类生物大分子的含量，其色谱条件为：色谱柱采用凝胶色谱柱（TSK GEL2000SWxl 7.8mm×300mm，5μm）；流动相为三氟醋酸‑乙腈‑水（0.05～0.1:10～15:85～90）；流速0.6～0.8ml/min；柱温23～30℃；测定波长212～216nm；进样量15～25μl；理论板数按肌红蛋白计算不低于4000。该法具有操作简单、快速、准确度高、精密度高、稳定性好的优点，适合实验室对于血栓通注射剂的专门性检测工作，可批量进行检测，提高检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及药品检测领域，具体是一种血栓通注射剂中蛋白质类生物大分子的检测方法。
背景技术
血栓通注射液和注射用血栓通统称为血栓通注射剂，其主要成分是三七总皂苷和氯化钠。血栓通注射液（别名：田七人参注射液），是一种注射剂处方药，由三七主根提取的三七总皂苷的注射液，淡黄色至黄色的澄明液体，适用于视网膜中央静脉阻塞、眼前房出血、青光眼、脑血管病后遗症的治疗，也可用于治疗病毒性肝炎，还具备活血祛瘀，扩张血管，改善血循环的作用，但偶有过敏反应。注射用血栓通是由三七总皂苷制成的冻干粉末，为类白色或淡黄色无定形粉末或疏松固体状物，昧微苦、微甘，有引湿性。适应症为活血祛瘀，通脉活络。用于瘀血阻络，中风偏瘫，胸痹心痛及视网膜中央静脉阻塞症。
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子，包括蛋白质、核酸、脂类、糖类等。目前中药注射剂的不良反应越来越受到重视，引发中药注射剂不良反应的原因很多，研究发现中药中的蛋白质等杂质易作为抗原或半抗原，刺激机体产生病理性免疫反应。本发明旨在检测注射剂中的蛋白质类生物大分子，从而更全面地对注射剂的安全性进行评价。
目前公开文献中还没有关于蛋白质类生物大分子高效液相法检测的相关技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种血栓通注射剂中蛋白质类生物大分子的检测方法，该法具有操作简单、快速、准确度高、精密度高、稳定性好的优点。
本发明通过以下技术方案实现：
一种血栓通注射剂中蛋白质类生物大分子的检测方法，包括以下步骤：
（a）对照品溶液的制备：取杆菌肽对照品、抑肽酶对照品、肌红蛋白对照品适量，精密称定，分别加流动相制成1mg/ml的溶液；
（b）样品溶液的制备：取血栓通注射液直接作为样品溶液或注射用血栓通配成35mg/ml的溶液作为样品；
（c）高效液相色谱法检测：分别精密吸取对照品溶液与样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定，得到色谱图；
（d）计算得出结果：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中各蛋白质类生物大分子的含量。
步骤（a）所述流动相为：与高效液相色谱法检测时的色谱条件所采用的流动相相同。
步骤(c)所述色谱条件为：
色谱柱：凝胶色谱柱（TSK GEL2000SWxl 7.8mm×300mm，5μm）；
流动相：三氟醋酸-乙腈-水（0.05～0.1:10～15:85～90）；乙腈为色谱纯，水为高纯水；
柱温：23～30℃；
流速0.6～0.8ml/min；
检测波长：212～216nm；
进样量：15～25μl；
理论板数：按肌红蛋白计算不低于4000。
本发明采用的检测条件和方法是在查阅大量文献的基础上，经过多次实验探索研究之后筛选出来的，能够达到精确度高、稳定性好的目的。以下为本发明的稳定性、准确度、精密度、重复性和现行关系的验证试验：
（1）精密度试验
取对照品混合溶液按上述色谱条件，连续测定6次。结果表明6次测定中，肌红蛋白、抑肽酶和杆菌肽的平均峰面积分别为30136274、10379770和17849071，RSD分别为1.05%、0.19%和0.16%（n＝5），详见表1。试验表明本发明所述方法的精密度良好。
表1 精密度试验结果
本发明的有益效果：
本发明所述血栓通注射剂中蛋白质类生物大分子的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，以杆菌肽、抑肽酶和肌红蛋白为对照品，具有操作简单、快速、准确度高、精密度高、稳定性好、重现性好等优点，适合检测机构等实验室中对于血栓通注射剂的专门性检测工作，特别是可大批量检测，大大提高检测效率。此外，本发明所述方法可以为企业标准或者行业标准的建立提供重要的参考依据。
附图说明
图1是杆菌肽对照品溶液的HPLC图。
图2是抑肽酶对照品溶液的HPLC图。
图3是肌红蛋白对照品溶液的HPLC图。
图4是血栓通注射液的HPLC图。
图5是注射用血栓通（冻干）的HPLC图。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例和附图，对本发明做进一步说明。
实施例1
（1）仪器和试剂
Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2487紫外检测器，Empower色谱工作站，MILLI-PORE纯水处理器；肌红蛋白对照品（SIGMA-ALDRICH提供，分子量17000）、抑肽酶对照品（SIGMA-ALDRICH提供，分子量6511.44）、杆菌肽对照品（Dr.Ehrenstorfer Gmbh提供，分子量1422.69）；其高效液相色谱图分别如图1、图2、图3所示；乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯；血栓通注射液生产企业为广西梧州制药（集团）股份有限公司。
（2）方法与结果
（a）对照品溶液的制备：取杆菌肽对照品、抑肽酶对照品、肌红蛋白对照品适量，精密称定，分别加流动相制成1mg/ml的溶液；
（b）样品溶液的制备：取血栓通注射液直接作为样品溶液或注射用血栓通配成35mg/ml的溶液作为样品；
（c）高效液相色谱法检测：分别精密吸取对照品溶液与样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定，得到色谱图；
（d）计算得出结果：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中各蛋白质类生物大分子的含量。
所述流动相与高效液相色谱法检测时的色谱条件所采用的流动相相同。
所述色谱条件为：色谱柱采用凝胶色谱柱（TSK GEL2000SWxl 7.8mm×300mm，5μm）；流动相为三氟醋酸-乙腈-水（0.05:10: 90）；流速0.7ml/min；柱温25℃；测定波长214nm；进样量20μl；理论板数按肌红蛋白计算为4000。
检测结果如图4所示。
实施例2
（1）仪器和试剂
Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2487紫外检测器，Empower色谱工作站，MILLI-PORE纯水处理器；肌红蛋白对照品（SIGMA-ALDRICH提供，分子量17000）、抑肽酶对照品（SIGMA-ALDRICH提供，分子量6511.44）、杆菌肽对照品（Dr.Ehrenstorfer Gmbh提供，分子量1422.69）；其高效液相色谱图分别如图1、图2、图3所示；乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯； 注射用血栓通（冻干）生产企业为广西梧州制药（集团）股份有限公司。
（2）方法与结果
（a）对照品溶液的制备：取杆菌肽对照品、抑肽酶对照品、肌红蛋白对照品适量，精密称定，分别加流动相制成1mg/ml的溶液；
（b）样品溶液的制备：取血栓通注射液直接作为样品溶液或注射用血栓通配成35mg/ml的溶液作为样品；
（c）高效液相色谱法检测：分别精密吸取对照品溶液与样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定，得到色谱图；
（d）计算得出结果：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中各蛋白质类生物大分子的含量。
所述流动相为：与高效液相色谱法检测时的色谱条件所采用的流动相相同。
所述色谱条件为：色谱柱采用凝胶色谱柱（TSK GEL2000SWxl 7.8mm×300mm，5μm）；流动相为三氟醋酸-乙腈-水（0.05:12:88）；流速0.6ml/min；柱温28℃；测定波长215nm；进样量20μl；理论板数按肌红蛋白计算为4000。
检测结果如图5所示。
分别取血栓通注射液34批，注射用血栓通（冻干）28批，按上述实施例1和实施例2色谱条件进行测定，结果样品中均未检出蛋白质类生物大分子，表明所检测样品的生产工艺已对蛋白质类生物大分子等物质进行控制并能有效去除。
Claims (3)
1.一种血栓通注射剂中蛋白质类生物大分子的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）对照品溶液的制备：取杆菌肽对照品、抑肽酶对照品、肌红蛋白对照品适量，精密称定，分别加流动相制成1mg/ml的溶液；
（b）样品溶液的制备：取血栓通注射液直接作为样品溶液或注射用血栓通配成35mg/ml的溶液作为样品；
（c）高效液相色谱法检测：分别精密吸取对照品溶液与样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定，得到色谱图；
（d）计算得出结果：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中各蛋白质类生物大分子的含量。
2.根据权利要求1所述血栓通注射剂中蛋白质类生物大分子的检测方法，其特征在于：步骤（a）所述流动相与高效液相色谱法检测时的色谱条件所采用的流动相相同。
3.根据权利要求1所述血栓通注射剂中蛋白质类生物大分子的检测方法，其特征在于：步骤(c)所述色谱条件为：
色谱柱：凝胶色谱柱（TSK GEL2000SWxl 7.8mm×300mm，5μm）；
流动相：三氟醋酸-乙腈-水（0.05～0.1:10～15:85～90）；乙腈为色谱纯，水为高纯水；
柱温：23～30℃；
流速0.6～0.8ml/min；
检测波长：212～216nm；
进样量：15～25μl；
理论板数：按肌红蛋白计算不低于4000。
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