CN103115982A

CN103115982A - 转移因子口服液的分子量分布测试方法

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Publication number: CN103115982A
Application number: CN201310033767XA
Authority: CN
Inventors: 龚立冬; 邵娜; 李彧娜; 崔爱艳; 徐香
Original assignee: SHENZHEN SEPAX TECHNOLOGIES Inc
Current assignee: SHENZHEN SEPAX TECHNOLOGIES Inc; Sepax Technologies Inc
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2013-05-22

Abstract

一种转移因子口服液的分子量分布测试方法，包括：建立色谱检测条件，藉以测算转移因子口服液中所含不同小分子多肽的分子量；采用该色谱检测条件，通过至少三种已知分子量的标准品，在该检测条件下建立分子量标准曲线，由分子的色谱峰保留时间与分子量对数值之间存在的线性关系，实现对未知小分子多肽的分子量测算；利用该色谱检测条件对转移因子口服液样品进行检测，并依据检测结果及标准图谱，实现对转移因子口服液样品中不同小分子多肽分子量分布的测定。进一步，该测试方法中优先采用水溶性体积排阻色谱柱。本发明方法简单，易于操作，能实现对转移因子口服液中多肽分子量信息的准确测定。

Description

转移因子口服液的分子量分布测试方法

技术领域

本发明特别涉及一种用于对转移因子口服液的分子量分布进行测试的方法。

背景技术

转移因子（TF）又称传输因子，由具有细胞性免疫功能的淋巴细胞产生，作为一种特定的细胞因子参与机体的免疫反应，能提高动物机体细胞免疫功能，促进机体抗感染和防御能力。转移因子口服液是以口服为给药形式的免疫增强剂。转移因子属多肽类物质，是由多核苷酸、多肽及其它成份组成的复合分子。其中小分子肽类物质的分子量小于5000D，是转移因子的功能标示物，并作为其主要功效成份。当前转移因子中不同分子量多肽的结构研究成为热点，通过对小分子多肽的分子量和结构研究，对进一步的了解多肽与其功能活性之间的关系具有重要意义。

迄今为止，已有较多关于以高效液相色谱法对转移因子口服液中游离氨基酸、防腐剂和抑菌剂等进行检测的报道，但对于其中小分子多肽分子量分布的研究则较少见诸报道。

近来，有研究人员采用Follin-酚法（Lowry）对转移因子中多肽含量进行了测定，但该检测方法只能对样品中总多肽含量进行测定，无法对不同小分子多肽进行分离后测定，亦无法知道多肽的分子量信息。

又及，虽然曾有研究人员以反相高效液相色谱方法对多肽类物质进行了检测，其主要是基于多肽类物质的疏水性，在不同介质条件下将不同多肽分子进行分离，该方法主要采用有机相作为检测流动相，但由于疏水性不同的小分子多肽在有机相中的溶解性存在差异，导致检测结果出现较大偏差。

发明内容

本发明的目的在于提出一种转移因子口服液的分子量分布测试方法，其能够实现对转移因子口服液中多肽分子量信息的准确测定，从而克服现有技术中的不足。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种转移因子口服液的分子量分布测试方法，包括：

依据转移因子口服液中所含小分子多肽的情况，建立色谱检测条件；

利用所述色谱检测条件对至少三种选定标准样品进行测定，建立相应的标准图谱，并由标准图谱中分子的保留时间与分子量对数值之间存在的线性关系，实现对未知小分子多肽的分子量测算；

以及，利用所述色谱检测条件对与转移因子口服液样品进行检测，并依据检测结果及标准图谱，实现对转移因子口服液样品中小分子多肽分子量分布的测定。

进一步的，所述标准样品可包括牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶，但不限于此。

作为较为优选的实施方案之一，所述色谱检测条件包括：采用水溶性体积排阻色谱柱。

作为较为优选的具体应用方案之一，所述水溶性体积排阻色谱柱可选用苏州赛分科技有限公司生产的Zenix-C SEC 100型色谱柱或类似产品，但不限于此。

所述色谱检测条件还包括：

采用pH值为6.5-7.5的，浓度为50-200 mM的磷酸盐缓冲液作为流动相，且流速为0.6-1.2 mL/min.

所述色谱检测条件还包括：将检测波长设于210～280 nm。

所述色谱检测条件还可包括：将柱温控制为室温。

所述小分子多肽的分子量的对数值Y与小分子多肽在色谱柱中的保留时间X之间的线性关系具体为：

Y= -0.475X + 7.4804。

又及，所述小分子多肽的分子量的对数值Y与小分子多肽在色谱柱中的保留时间X之间的线性关系中相关系数R²=0.9991。

与现有技术相比，本发明的优点至少在于：采用高效液相体积排阻色谱法测定转移因子口服液中小分子多肽的分子量，方法简单，易于操作，且能够实现对转移因子口服液中多肽分子量信息的准确测定。

附图说明

图1系本发明一较佳实施方案中牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量标准品色谱图。

图2系本发明一较佳实施方案中牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量对数与保留时间标准曲线图。

图3系本发明一较佳实施方案中转移因子口服液中小分子多肽分子量检测图谱；

图4系本发明实施例1中一种转移因子口服液样品中小分子多肽分子量检测图谱；

图5系本发明实施例2中一种转移因子口服液样品中小分子多肽分子量检测图谱。

具体实施方式

本发明的主要目的在于建立转移因子口服液中不同小分子多肽的分子量测算，其技术方案的要点在于：首先建立合适的检测条件，以保证转移因子样品中所含的全部小分子多肽都能在图谱上体现出来；其次，通过所建立的检测条件对选定标准样品进行检测，由此建立分子量标准曲线，并据此标准曲线计算转移因子样品中的小分子多肽的分子量，而由此获得的多肽分子量信息，对于每个多肽的结构确认具有重要指导意义。

以下结合若干较佳实施例及相应的附图对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例 1 ：

1. 样品配制

分子量标准品配制：分别准确称取牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量标准品适量（精确到0.1mg）于10 mL容量瓶中，用纯水溶解并定容至刻度，得到浓度分别为1.0 mg/mL、1.0 mg/mL和0.1 mg/mL的分子量标准品溶液；

样品配制：取转移因子口服液样品，其所含总多肽浓度为1.0 mg/mL，该样品用0.45 μm微孔滤膜过滤后作为样品溶液。

2.色谱条件

2.1.色谱柱：以亲水硅胶为基质，结合表面修饰的水溶性体积排阻色谱柱，例如，可选用苏州赛分科技有限公司出售的Zenix-C SEC 100型色谱柱 ( 3 µm, 100 Å, 7.8 x 300 mm ) 。

2.2.流动相：150 mM磷酸盐缓冲液（pH 值7.0）

2.3.流速：1.0 mL/min

2.4.检测波长：210～280 nm

2.5.柱温：室温

2.6.进样量：10 µL

3.检测结果

3.1 按上述色谱条件检测，得到分子量标准品的检测信息如下：

参阅图1系牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量标准品色谱图。

而牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量及其保留时间之间的关系可参见表1及图2，并且依据图2，可以看到，牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量及其保留时间之间的关系可以概括为如下线性方程：

Y= -0.475X + 7.4804 ……式1

其中，相关系数R²=0.9991，表明标准品分子量和保留时间存在很好的线性关系。

表1 牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量及其保留时间对照表

	牛血清白蛋白（BSA）	核糖核酸酶A（Ribonuclease）	尿嘧啶（Uracil）
				保留时间（RT）	5.678 min	6.942 min	11.393 min
分子量（Mw）	66000 D	13700 D	120 D
				分子量对数（Lg Mw）	4.8195	4.1367	2.0792

3.2 样品溶液中小分子多肽分子量测试：

在与分子量标准品同样的色谱条件下，样品溶液的检测图谱如图3所示。

将转移因子口服液色谱图中对应多肽分子的9.035 min ~ 11.375 min的峰代入前述式1得到相应分子量结果如下表2。

表2 样品溶液中小分子多肽分子量测试结果

保留时间 min	9.035	9.381	9.836	10.169	10.377	10.746	11.063	11.375
									分子量计算结果 D	1544.45	1057.85	643.13	446.81	355.90	237.71	168.06	119.47

由计算结果可知，前述转移因子口服液样品中所含小分子多肽的分子量分布范围在1544~119D之间。该检测结果为进一步确认转移因子口服液中多肽的结构信息提供重要依据。

本发明是针对转移因子口服液中小分子多肽分子量测定建立的方法，对于样品在不同检测波长下的测定，也可以得到满意的结果。

实施例 2 ：

1.1 色谱条件

色谱柱：以亲水硅胶为基质，结合水溶性体积排阻色谱柱Zenix-C SEC 100 ( 3 µm, 100 Å, 7.8 x 300 mm )

流动相：150 mM 磷酸盐缓冲液（pH 值7.0）

流速：1.0 mL/min

检测波长：260 nm

柱温：室温

进样量：10µL

1.2 样品配制

转移因子口服液样品，其所含总多肽浓度为1.0 mg/mL，样品用0.45 μm微孔滤膜过滤后作为样品溶液。

1.3 前述样品溶液中小分子多肽分子量测试结果请参阅图4。

1.4 将前述样品溶液色谱图中对应多肽分子的9.147 min ~ 11.493 min的峰代入分子量标准曲线公式（即，实施例1中所示之式1）中得到相应分子量结果如表3。

表3 转移因子口服液样品中小分子多肽分子量测试结果

保留时间 min	9.147	9.483	9.953	10.286	10.503	10.875	11.196	11.493
									分子量计算结果 D	1366.39	946.18	565.88	393.14	310.08	206.43	145.31	105.01

实施例 3 ：

2.1 色谱条件

色谱柱：以亲水硅胶为基质，结合表面修饰的水溶性体积排阻色谱柱（Zenix-C SEC 100 ( 3 µm, 100 Å, 7.8 x 300 mm )

流动相：150 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）

流速：1.0 mL/min

检测波长：270 nm

柱温：室温

进样量：10µL

2.2 样品配制

2.3 前述样品溶液中小分子多肽分子量测试结果如图5所示。

2.4 将前述样品溶液的色谱图中对应多肽分子的9.157 min ~ 11.496 min的峰代入分子量标准曲线公式（即，实施例1所示之式1）中得到相应分子量结果如下表4。

表4 转移因子口服液样品中小分子多肽分子量测试结果

保留时间 min	9.157	9.483	9.953	10.285	10.503	10.878	11.195	11.496
									分子量计算结果 D	1351.53	946.18	565.88	393.57	310.08	205.75	145.47	104.66

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修改，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种转移因子口服液的分子量分布测试方法，其特征在于，包括：

以及，利用所述色谱检测条件对转移因子口服液样品进行检测，并依据检测结果及所述标准图谱，实现对转移因子口服液样品中小分子多肽分子量分布的测定。

2.根据权利要求1所述的转移因子口服液的分子量分布测试方法，其特征在于，所述标准样品包括牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶。

3.根据权利要求1所述的转移因子口服液的分子量分布测试方法，其特征在于，所述色谱检测条件包括：采用水溶性体积排阻色谱柱。

4.根据权利要求3所述的转移因子口服液的分子量分布测试方法，其特征在于，所述水溶性体积排阻色谱柱包括市售的Zenix-C SEC 100型色谱柱。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的转移因子口服液的分子量分布测试方法，其特征在于，所述色谱检测条件还包括：

采用pH值为6.5-7.5的，浓度为50-200 mM的磷酸盐缓冲液作为流动相，且流速为0.6-1.2 mL/min。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的转移因子口服液的分子量分布测试方法，其特征在于，所述色谱检测条件还包括：将检测波长设于210～280 nm。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的转移因子口服液的分子量分布测试方法，其特征在于，所述色谱检测条件还包括：将柱温控制为室温。

8.根据权利要求1所述的转移因子口服液的分子量分布测试方法，其特征在于，该方法中小分子多肽在色谱柱中的保留时间X与小分子多肽的分子量的对数值Y之间的线性关系具体为：

Y= -0.475X + 7.4804。

9.根据权利要求8所述的转移因子口服液的分子量分布测试方法，其特征在于，所述小分子多肽的分子量的对数值Y与小分子多肽在色谱柱中的保留时间X之间的线性关系中相关系数R²=0.9991。