CN107064073A - 一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，所述的方法主要包括以下步骤：(1)多肽的分离纯化：将水解胶原蛋白粉通过溶解、搅拌、离心、超滤浓缩，再用离子交换层析复溶，通过凝胶色谱柱，洗脱，浓缩、干燥，得到分离纯化的多肽；(2)多肽含量测定：将分离纯化的多肽使用水解的酶解液混合溶解，进行透光率检测，使用分光光度计检测透光率所占比例，从而判定得到的分离纯化的多肽含量；(3)多肽分子量测定：采用标准图谱中分子的保留时间与分子量对数值之间存在的线性关系，利用粉样品检测结果与标准图谱的对比，来快速检测出多肽分子量。本发明的测定方法设计合理，科学严密，易于操作，准确性高。

Description

一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法
技术领域
本发明属于多肽分子量测定技术领域，具体来讲是一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法。
背景技术
多肽是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物，由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由三个或三个以上氨基酸分子脱水缩合而成的化合物都可以成为叫多肽。在高二选修有机化学基础中有对多肽的明确定义。
一般肽中含有的氨基酸的数目为二到九,根据肽中氨基酸的数量的不同,肽有多种不同的称呼：由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等,一直到九肽。通常由10-100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10,000Da(Dalton，道尔顿)，能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由2-10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽)；10-50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质,换言之,蛋白质有时也被称为多肽。多肽也简称为肽，是20世纪被发现的。
分子量是蛋白质主要的特征参数之一，近年来其测试方法发展十分迅速。目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳法、渗透压法、电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法。常用的方法为凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法：凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子量的大小；蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子的大小、分子形状和所带电荷的多少，迁移率和分子质量的对数成直线关系。以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，得到标准曲线，根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子质量。然后以上方法对多肽分子量的测定过程复杂，影响因素较多，因此能快速的测定多肽分子量且能得到准确的结果是目前科研工作者研究的难题之一。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法。
本发明的技术方案如下：一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，所述的测定方法主要包括以下步骤：
(1)将水解胶原蛋白粉和超纯水按照1:5的体积比混合，搅拌30min，然后在5-10℃下，10000～12000r/min条件下离心1h，取出上清液，将上清液使用UF膜进行超滤浓缩，浓缩前后的体积比为5:1-2，将超滤浓缩后的粉浓缩液通过使用缓冲液经离子交换层析进行复溶，得到的复溶液经含Sephadex G-100凝胶色谱柱，以0.3-0.5mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，洗脱，在5-10℃下收集洗脱液在在真空环境下浓缩，浓缩前后体积比为5:1，然后进行喷雾干燥，得到分离纯化的多肽，备用；
(2)将步骤(1)分离纯化的多肽使用水解的酶解液混合溶解，搅拌后得到混合溶液，使用固形物含量检测仪检测混合溶液中的固形物含量，继续添加酶解液并搅拌使混合溶液中固形物含量为3％并过滤，得到澄清的过滤液，将一部分澄清的过滤液备用，在另外一部分澄清过滤液中加入质量浓度为40％三氯乙酸溶液至三氯乙酸在澄清溶液中的最终浓度为15％，混和均匀后，在常温、转数3000rpm条件下离心15min，然后在300nm条件下进行透光率检测，与所述的未经过三氯乙酸处理的澄清过滤液作对比，使用分光光度计检测透光率所占比例，从而判定得到的分离纯化的多肽含量；
(3)采用水溶性体积排阻色谱柱，将缓冲液作为流动相，以0.8-1.4mL/min的流速，在合适的色谱检测条件下，对从步骤(1)得到的多肽标准样品测定，建立相应的标准图谱，并由标准图谱中分子的保留时间与分子量对数值之间存在的线性关系，所述的线性关系为：Y＝-0.525X+8.2036，其中X为多肽在色谱柱中的保留时间Y为多肽的分子量的相对数值，实现对多肽的分子量测算，同时利用所述色谱检测条件对水解胶原蛋白粉样品进行检测，并依据检测结果标准图谱的对比，来快速检测出多肽分子量。
进一步的，所述的步骤(1)中的缓冲液为0.05mol/L pH7-7.5的Tris-硼酸平衡缓冲液。
进一步的，所述的步骤(3)中的色谱检测条件为：温度为15-30℃，采用pH值为6.0-7.0的，浓度为100-200mM的磷酸盐缓冲液作为流动相，且流速为0.8-1.2mL/min，检测波长范围设于260-300nm。
进一步的，所述的步骤(2)中的酶解液制备方法为：将洗净、粉碎的鱼鳞、蒸馏水、蛋白酶按照5:1000:3的质量比置入反应器中，搅拌5-10min后，调节pH值为6-7，加热升温，反应温度在60-70℃酶解3-5h，酶解结束后升温至90-100℃灭酶5-10min，灭酶结束后降温至30-40℃，室温下静置30-60min，60目筛网过滤，滤除残渣，收集滤液即为所述的酶解液。
进一步的，所述的多肽的分子量的对数值Y与小分子多肽在色谱柱中的保留时间X之间的线性关系中相关系数R2＝0.8657。
进一步的，所述的水溶性体积排阻色谱柱优选为美国-SRT体积排阻色谱柱，PH范围2-8.5。
与现有技术相比，本发明的友谊效果体现在：本发明的多肽分子量的快速测定方法通过将水解胶原蛋白粉的多肽分离纯化：将水解胶原蛋白粉通过搅拌、离心、超滤浓缩，再用离子交换层析复溶，通过凝胶色谱柱，得到分离纯化的多肽，将多肽使用水解的酶解液混合溶解，进行透光率检测，从而判定得到的分离纯化的多肽含量，采用标准图谱中分子的保留时间与分子量对数值之间存在的线性关系，利用粉样品检测结果与标准图谱的对比，来快速检测出多肽分子量。本发明的测定方法设计合理，科学严密，易于操作，准确性高。
附图说明
图1为分子量矫正曲线
具体实施方式
实施例1：一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，所述的测定方法主要包括以下步骤：
(1)将水解胶原蛋白粉和超纯水按照1:5的体积比混合，搅拌30min，然后在5℃下，10000r/min条件下离心1h，取出上清液，将上清液使用UF膜进行超滤浓缩，浓缩前后的体积比为5:1，将超滤浓缩后的粉浓缩液通过使用缓冲液经离子交换层析进行复溶，得到的复溶液经含Sephadex G-100凝胶色谱柱，以0.3mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，洗脱，在5℃下收集洗脱液在在真空环境下浓缩，浓缩前后体积比为5:1，然后进行喷雾干燥，得到分离纯化的多肽，备用；
(2)将步骤(1)分离纯化的多肽使用水解的酶解液混合溶解，搅拌后得到混合溶液，使用固形物含量检测仪检测混合溶液中的固形物含量，继续添加酶解液并搅拌使混合溶液中固形物含量为3％并过滤，得到澄清的过滤液，将一部分澄清的过滤液备用，在另外一部分澄清过滤液中加入质量浓度为40％三氯乙酸溶液至三氯乙酸在澄清溶液中的最终浓度为15％，混和均匀后，在常温、转数3000rpm条件下离心15min，然后在300nm条件下进行透光率检测，与所述的未经过三氯乙酸处理的澄清过滤液作对比，使用分光光度计检测透光率所占比例，从而判定得到的分离纯化的多肽含量；
(3)采用水溶性体积排阻色谱柱，将缓冲液作为流动相，以0.8mL/min的流速，在合适的色谱检测条件下，对从步骤(1)得到的多肽标准样品测定，建立相应的标准图谱，并由标准图谱中分子的保留时间与分子量对数值之间存在的线性关系，所述的线性关系为：Y＝-0.525X+8.2036，其中X为多肽在色谱柱中的保留时间Y为多肽的分子量的相对数值，实现对多肽的分子量测算，同时利用所述色谱检测条件对水解胶原蛋白粉样品进行检测，并依据检测结果标准图谱的对比，来快速检测出多肽分子量。
其中，所述的步骤(1)中的缓冲液为0.05mol/L pH7的Tris-硼酸平衡缓冲液。所述的步骤(3)中的色谱检测条件为：温度为15℃，采用pH值为6.0的，浓度为100mM的磷酸盐缓冲液作为流动相，且流速为0.8mL/min，检测波长范围设于260nm。所述的步骤(2)中的酶解液制备方法为：将洗净、粉碎的鱼鳞、蒸馏水、蛋白酶按照5:1000:3的质量比置入反应器中，搅拌5min后，调节pH值为6，加热升温，反应温度在60℃酶解3h，酶解结束后升温至90℃灭酶5min，灭酶结束后降温至30℃，室温下静置30min，60目筛网过滤，滤除残渣，收集滤液即为所述的酶解液。所述的多肽的分子量的对数值Y与小分子多肽在色谱柱中的保留时间X之间的线性关系中相关系数R2＝0.8657。所述的水溶性体积排阻色谱柱优选为美国-SRT体积排阻色谱柱。
实施例2：一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，所述的测定方法主要包括以下步骤：
(1)将水解胶原蛋白粉和超纯水按照1:5的体积比混合，搅拌30min，然后在7.5℃下，11000r/min条件下离心1h，取出上清液，将上清液使用UF膜进行超滤浓缩，浓缩前后的体积比为5:1.5，将超滤浓缩后的粉浓缩液通过使用缓冲液经离子交换层析进行复溶，得到的复溶液经含Sephadex G-100凝胶色谱柱，以0.4mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，洗脱，在7.5℃下收集洗脱液在在真空环境下浓缩，浓缩前后体积比为5:1，然后进行喷雾干燥，得到分离纯化的多肽，备用；
(2)将步骤(1)分离纯化的多肽使用水解的酶解液混合溶解，搅拌后得到混合溶液，使用固形物含量检测仪检测混合溶液中的固形物含量，继续添加酶解液并搅拌使混合溶液中固形物含量为3％并过滤，得到澄清的过滤液，将一部分澄清的过滤液备用，在另外一部分澄清过滤液中加入质量浓度为40％三氯乙酸溶液至三氯乙酸在澄清溶液中的最终浓度为15％，混和均匀后，在常温、转数3000rpm条件下离心15min，然后在300nm条件下进行透光率检测，与所述的未经过三氯乙酸处理的澄清过滤液作对比，使用分光光度计检测透光率所占比例，从而判定得到的分离纯化的多肽含量；
(3)采用水溶性体积排阻色谱柱，将缓冲液作为流动相，以1.1mL/min的流速，在合适的色谱检测条件下，对从步骤(1)得到的多肽标准样品测定，建立相应的标准图谱，并由标准图谱中分子的保留时间与分子量对数值之间存在的线性关系，所述的线性关系为：Y＝-0.525X+8.2036，其中X为多肽在色谱柱中的保留时间Y为多肽的分子量的相对数值，实现对多肽的分子量测算，同时利用所述色谱检测条件对水解胶原蛋白粉样品进行检测，并依据检测结果标准图谱的对比，来快速检测出多肽分子量。
其中，所述的步骤(1)中的缓冲液为0.05mol/L pH7.25的Tris-硼酸平衡缓冲液。所述的步骤(3)中的色谱检测条件为：温度为22.5℃，采用pH值为6.5的，浓度为150mM的磷酸盐缓冲液作为流动相，且流速为1mL/min，检测波长范围设于280nm。所述的步骤(2)中的酶解液制备方法为：将洗净、粉碎的鱼鳞、蒸馏水、蛋白酶按照5:1000:3的质量比置入反应器中，搅拌7.5min后，调节pH值为6.5，加热升温，反应温度在65℃酶解4h，酶解结束后升温至95℃灭酶7.5min，灭酶结束后降温至35℃，室温下静置45min，60目筛网过滤，滤除残渣，收集滤液即为所述的酶解液。所述的多肽的分子量的对数值Y与小分子多肽在色谱柱中的保留时间X之间的线性关系中相关系数R2＝0.8657。所述的水溶性体积排阻色谱柱优选为美国-SRT体积排阻色谱柱。
实施例3：一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，所述的测定方法主要包括以下步骤：
(1)将水解胶原蛋白粉和超纯水按照1:5的体积比混合，搅拌30min，然后在10℃下，12000r/min条件下离心1h，取出上清液，将上清液使用UF膜进行超滤浓缩，浓缩前后的体积比为5:2，将超滤浓缩后的粉浓缩液通过使用缓冲液经离子交换层析进行复溶，得到的复溶液经含Sephadex G-100凝胶色谱柱，以0.5mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，洗脱，在10℃下收集洗脱液在在真空环境下浓缩，浓缩前后体积比为5:1，然后进行喷雾干燥，得到分离纯化的多肽，备用；
(2)将步骤(1)分离纯化的多肽使用水解的酶解液混合溶解，搅拌后得到混合溶液，使用固形物含量检测仪检测混合溶液中的固形物含量，继续添加酶解液并搅拌使混合溶液中固形物含量为3％并过滤，得到澄清的过滤液，将一部分澄清的过滤液备用，在另外一部分澄清过滤液中加入质量浓度为40％三氯乙酸溶液至三氯乙酸在澄清溶液中的最终浓度为15％，混和均匀后，在常温、转数3000rpm条件下离心15min，然后在300nm条件下进行透光率检测，与所述的未经过三氯乙酸处理的澄清过滤液作对比，使用分光光度计检测透光率所占比例，从而判定得到的分离纯化的多肽含量；
(3)采用水溶性体积排阻色谱柱，将缓冲液作为流动相，以1.4mL/min的流速，在合适的色谱检测条件下，对从步骤(1)得到的多肽标准样品测定，建立相应的标准图谱，并由标准图谱中分子的保留时间与分子量对数值之间存在的线性关系，所述的线性关系为：Y＝-0.525X+8.2036，其中X为多肽在色谱柱中的保留时间Y为多肽的分子量的相对数值，实现对多肽的分子量测算，同时利用所述色谱检测条件对水解胶原蛋白粉样品进行检测，并依据检测结果标准图谱的对比，来快速检测出多肽分子量。
其中，所述的步骤(1)中的缓冲液为0.05mol/L pH7.5的Tris-硼酸平衡缓冲液。所述的步骤(3)中的色谱检测条件为：温度为30℃，采用pH值为7.0的，浓度为200mM的磷酸盐缓冲液作为流动相，且流速为1.2mL/min，检测波长范围设于300nm。所述的步骤(2)中的酶解液制备方法为：将洗净、粉碎的鱼鳞、蒸馏水、蛋白酶按照5:1000:3的质量比置入反应器中，搅拌10min后，调节pH值为7，加热升温，反应温度在70℃酶解5h，酶解结束后升温至100℃灭酶10min，灭酶结束后降温至40℃，室温下静置60min，60目筛网过滤，滤除残渣，收集滤液即为所述的酶解液。所述的多肽的分子量的对数值Y与小分子多肽在色谱柱中的保留时间X之间的线性关系中相关系数R2＝0.8657。所述的水溶性体积排阻色谱柱优选为美国-SRT体积排阻色谱柱。
实验验证：分别采用实施例1、实施例2、实施例3所述的水解胶原蛋白粉多肽分子量的测定方法，采用水溶性体积排阻色谱柱，在色谱检测条件下，试用三种方法对多肽标准样品进行测定，建立相应的标准图谱，并由标准图谱中分子的保留时间与分子量对数值之间存在的线性关系，所述的线性关系为：Y＝-0.525X+8.2036，其中X为多肽在色谱柱中的保留时间Y为多肽的分子量的相对数值，如图1所示，从中选择时间为5、8、10分钟实现对多肽的分子量测算，同时利用所述色谱检测条件对水解胶原蛋白粉样品进行检测，并依据检测结果标准图谱的对比，来快速检测出多肽分子量。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，其特征在于，所述的测定方法主要包括以下步骤：
(1)将水解胶原蛋白粉和超纯水按照1:5的体积比混合，搅拌30min，然后在5-10℃下，10000～12000r/min条件下离心1h，取出上清液，将上清液使用UF膜进行超滤浓缩，浓缩前后的体积比为5:1-2，将超滤浓缩后的粉浓缩液通过使用缓冲液经离子交换层析进行复溶，得到的复溶液经含Sephadex G-100凝胶色谱柱，以0.3-0.5mL/min流速进行分离纯化，检测波长为280nm，收集检测器上显示的各个峰的峰值管，洗脱，在5-10℃下收集洗脱液在在真空环境下浓缩，浓缩前后体积比为5:1，然后进行喷雾干燥，得到分离纯化的多肽，备用；
(2)将步骤(1)分离纯化的多肽使用水解的酶解液混合溶解，搅拌后得到混合溶液，使用固形物含量检测仪检测混合溶液中的固形物含量，继续添加酶解液并搅拌使混合溶液中固形物含量为3％并过滤，得到澄清的过滤液，将一部分澄清的过滤液备用，在另外一部分澄清过滤液中加入质量浓度为40％三氯乙酸溶液至三氯乙酸在澄清溶液中的最终浓度为15％，混和均匀后，在常温、转数3000rpm条件下离心15min，然后在300nm条件下进行透光率检测，与所述的未经过三氯乙酸处理的澄清过滤液作对比，使用分光光度计检测透光率所占比例，从而判定得到的分离纯化的多肽含量；
(3)采用水溶性体积排阻色谱柱，将缓冲液作为流动相，以0.8-1.4mL/min的流速，在合适的色谱检测条件下，对从步骤(1)得到的多肽标准样品测定，建立相应的标准图谱，并由标准图谱中分子的保留时间与分子量对数值之间存在的线性关系，所述的线性关系为：Y＝-0.525X+8.2036，其中X为多肽在色谱柱中的保留时间Y为多肽的分子量的相对数值，实现对多肽的分子量测算，同时利用所述色谱检测条件对水解胶原蛋白粉样品进行检测，并依据检测结果标准图谱的对比，来快速检测出多肽分子量。
2.如权利要求1所述的一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的缓冲液为0.05mol/L pH7-7.5的Tris-硼酸平衡缓冲液。
3.如权利要求1所述的一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的色谱检测条件为：温度为15-30℃，采用pH值为6.0-7.0的，浓度为100-200mM的磷酸盐缓冲液作为流动相，且流速为0.8-1.2mL/min，检测波长范围设于260-300nm。
4.如权利要求1所述的一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的酶解液制备方法为：将洗净、粉碎的鱼鳞、蒸馏水、蛋白酶按照5:1000:3的质量比置入反应器中，搅拌5-10min后，调节pH值为6-7，加热升温，反应温度在60-70℃酶解3-5h，酶解结束后升温至90-100℃灭酶5-10min，灭酶结束后降温至30-40℃，室温下静置30-60min，60目筛网过滤，滤除残渣，收集滤液即为所述的酶解液。
5.如权利要求1所述的一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，其特征在于，所述的多肽的分子量的对数值Y与小分子多肽在色谱柱中的保留时间X之间的线性关系中相关系数R2＝0.8657。
6.如权利要求1所述的一种水解胶原蛋白粉多肽分子量的快速测定方法，其特征在于，所述的水溶性体积排阻色谱柱优选为美国-SRT体积排阻色谱柱，PH范围2-8.5。
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