CN103304627B - 通过电泳特异性分离富集小分子量蛋白质或多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了通过电泳特异性分离富集小分子量蛋白质或多肽的方法。该方法采用的电泳支持介质是不同孔径的载体介质，如聚丙烯酰胺凝胶。该聚丙烯酰胺凝胶由浓缩胶、分离胶和位于浓缩胶和分离胶之间的储存胶和隔离胶组成类似凝胶漏斗的装置。所述隔离胶的层数大于等于1层；所述浓缩胶在电泳过程中不参与分子筛分离，样品经过所述浓缩胶被浓缩；所述分离胶根据分子筛作用对样品进行分离，根据被分离物质的相对分子质量的要求选择分离胶的浓度；所述储存胶用于接纳来自所述浓缩胶的样品，防止样品在浓缩胶和所述隔离胶界面扩散；所述隔离胶用于在电泳过程中截阻分子量大于30kDa的蛋白质；所述小分子量蛋白质或多肽的分子量小于等于30kDa。

Description

通过电泳特异性分离富集小分子量蛋白质或多肽的方法

技术领域

本发明涉及通过电泳分离富集小分子量蛋白质或多肽的方法。

背景技术

随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在整体水平上对细胞内部蛋白质及其活动规律进行研究的蛋白质组学领域受到广泛的关注。当前蛋白质组学研究中，最成熟、最有效的技术仍然是依赖凝胶电泳分离-生物质谱鉴定技术，随后运用现代生物信息学技术对所得的海量数据进行处理，对蛋白质及其执行的生命活动做出尽可能精确、准确及本质的阐述。

在蛋白质组中存在一群种类多但分子量较小的蛋白，比如在酵母蛋白质组理论数据库中分子量小于20kDa的蛋白超过1000种，约占总数据库中蛋白数目的15%。这类蛋白除了分子量小外，往往丰度也较低，造成了可用于特异鉴定小分子量蛋白质的有效肽段的数量偏低，这给基于质谱的蛋白质鉴定造成了很大的困难，使得低分子量蛋白覆盖率相对于整体蛋白覆盖率偏低。然而这些小分子量蛋白质却在很多生命过程中起着非常重要的作用，如核糖体的形成，应激反应，周期调控，信号转导，翻译调控等，因此小分子量蛋白质覆盖度偏低的问题严重阻碍了我们在整体水平上对生命活动的理解。

从组织或细胞中直接提取的蛋白质，以人类细胞为例，种类高达上万种，不同种类间的丰度可能相差六个数量级甚至更高，如血液中的白蛋白，浓度高达35-50mg/mL，约占血清总蛋白的55%，而许多低丰度蛋白含量极低，为pg级，如IL-6，浓度为0-5pg/mL。在质谱检测过程中高丰度蛋白的存在会掩盖和抑制低丰度蛋白的信号，影响低丰度蛋白的鉴定，这种情况在低丰度的小蛋白的鉴定方面表现尤为突出。一些与疾病和信号转导、调控相关的蛋白质往往也是属于低丰度的小分子量蛋白质，如5个Che蛋白参与极端嗜盐古菌（Halobacteriumsalinarum）信号传导网络，传递化学与光信号到鞭毛马达，这些蛋白分子量小于20kDa；在埃希氏杆菌（Escherichia coli）中，大部分的Che蛋白在每个细胞中的拷贝数少于40个。如果可以对此类蛋白进行有效的分离富集从而进行鉴定甚至定量，将会使我们对疾病的发生和发展过程的理解产生巨大的推动作用。因此如何对样品中低丰度、小分子量蛋白进行有效的分离与富集是进行小分子量蛋白质高覆盖蛋白质组研究的关键。

在对小分子蛋白的研究中，样品处理的首要步骤就是高丰度蛋白的去除和低丰度蛋白的富集，通过这个步骤可提高低丰度蛋白质在样品中的相对量，增加色谱分离的峰容量和质谱检测的动态范围等。目前，常用的样品预处理方法包括亲和层析法、滤膜超滤法、有机溶剂沉淀法（differential solubilization，DS法）以及凝胶过滤等。亲和层析法作为一种有效的富集纯化方法，它对特定生物分子选择性的吸附和分离，可取得较高的纯化倍数，然而该技术价格昂贵，配基制备困难，仅适用于富集纯化少数已知的蛋白。超滤法通过滤膜将蛋白按照分子量卡值分为大分子量蛋白和小分子量蛋白两类，然而该方法样品损失严重，不能保证所有分子量低于滤膜卡值的小蛋白均能通过，从而无法保障小分子量蛋白组学样品的完备性。有机溶剂沉淀法也面临同样的问题。由于有机试剂本身的疏水性，使得样品在沉淀或者溶解的过程中对某种性质的小蛋白有一定的偏向性，造成样品的非完备性以及改变原样品中蛋白间的相对丰度关系等。

对于凝胶电泳的方法，蛋白质样品在制备后通过与SDS的结合带上电荷，因此可在电场中以聚丙烯酰胺凝胶为载体介质进行电泳。双向电泳（2-DE）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）都是经典的蛋白质组学中的凝胶电泳分离技术。2-DE是根据蛋白质所带电荷量和分子量两个性质分离复杂的蛋白混合物。虽然这是蛋白质分离纯化的主流技术，但该技术对样品中低丰度、小分子量蛋白、疏水性蛋白、极酸或极碱性蛋白的分离困难，操作繁琐，研究成本高，重复性也比较差。这些问题限制了该技术的应用。SDS-PAGE凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂作用下聚合而成。凝胶孔径的大小取决于两个单体（单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺）的总百分浓度（%T）和交联百分比浓度（%C）。通过调整它们的组成比例，从而实现SDS-PAGE对不同分子量蛋白的有效分离。SDS-PAGE具有制作方法简便易行、研究成本低、重现性高等特点，常用于分离中等大小或大蛋白（相对分子量范围在20-200kDa的蛋白质），但对分子量较小的蛋白质难于有效的分离和鉴定。

发明内容

针对现有技术存在的小分子量蛋白分离、富集困难的问题，本发明旨在提供一种有效、简便的通过在蛋白质分离过程中截阻大分子量蛋白质进而特异性富集小分子量蛋白质或多肽的方法。

更为特异的，本发明通过利用电泳体系在电泳过程中截阻大分子量蛋白质通过而特异性地富集小分子量蛋白质或多肽的方法。

本发明所述的电泳体系可为凝胶电泳体系，所用的支持介质可为聚丙烯酰胺凝胶，所述的截阻大分子量蛋白质和富集小分子量蛋白质通过多层不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶构成的凝胶过滤装置（Gel filter）的体系实现。所述的多层聚丙烯酰胺凝胶包括浓缩胶、蛋白质储存胶（简称储存胶）、高分子量蛋白质隔离胶（简称隔离胶）和分离胶。所述的浓缩胶在电泳过程中不参与分子筛分离。蛋白质样品经过大孔径、低浓度的浓缩胶过程中被压缩成狭窄的区带，并形成一致的蛋白质分离起跑线。所述的储存胶将经由浓缩胶富集的蛋白质混合物接纳到胶分离装置，避免蛋白质样品在胶浓度悬殊的浓缩胶和隔离胶之间扩散。所述的隔离胶可根据需要分离的目的蛋白质的分子量分布选择合适的胶的种类、浓度和交联度，实现截阻大分子量和中等分子量蛋白质，放行小分子量蛋白质的目的，特异性地富集小分子量蛋白质和多肽。隔离胶的层数可大于等于1层。所述分离胶根据分子筛作用对目的样品亚组进行分离，分离胶的浓度和交联度取决于被分离目的样品亚组的性质和后续的研究需求。本发明所述的不同性质的凝胶体系组合成一个类似于漏斗状的特异性截阻大分子量蛋白质和富集小分子量的蛋白质或多肽的装置，成为凝胶过滤装置（Gel filter）。利用这个凝胶过滤装置，通过所述的电泳分离方法，可实现蛋白质组样品中低丰度小分子量蛋白质的无损分离、富集和浓缩。这些小分子量蛋白质或多肽可通过常规的液相色谱-串联质谱分析，实现鉴定、定量之目的。

本发明所提供的通过电泳分离生物样品中小分子量蛋白质或多肽的方法，所述电泳中采用的电泳系统是Gel filter凝胶体系。其中，所述电泳系统中的电泳支持介质是但不限于聚丙烯酰胺凝胶，所述聚丙烯酰胺凝胶由浓缩胶、分离胶和位于所述浓缩胶和所述分离胶之间的储存胶和隔离胶组成，所述隔离胶的层数可大于或等于1层；所述浓缩胶在电泳过程中不参与分子筛分离，样品经过大孔径、低浓度的浓缩胶，被浓缩成狭窄的区带；所述分离胶根据分子筛作用对样品进行分离，根据被分离物质的相对分子质量的要求选择分离胶的浓度；所述储存胶用于接纳来自浓缩胶的蛋白质样品，防止蛋白质在浓缩胶和高浓度的隔离胶界面扩散；隔离胶用于截阻特定分子量以上的，如但不限于分子量大于30kDa的蛋白质；

所述小分子量蛋白质或多肽的分子量小于等于30kDa。

上述方法中，所述浓缩胶和所述分离胶均为一层，所述储存胶的层数为大于或等于一层。

上述方法中，所述聚丙烯酰胺凝胶为不连续凝胶。不连续凝胶是指所述聚丙烯酰胺凝胶中的凝胶浓度不同。

上述方法中，所述浓缩胶中，凝胶浓度可为4%-5%，凝胶的交联度可为2%-3%；

所述储存胶中，凝胶浓度可在6%-15%内，凝胶的交联度可为2%-3%；

所述隔离胶中，凝胶浓度较高，可选择但不限于20%，凝胶的交联度可以但不限于2%-3%；

所述分离胶中，凝胶浓度可为6%-20%，如12%-20%，凝胶的交联度可以但不限于2%-3%。

在本发明的一个实施例中，所述储存胶为一层，所述储存胶的凝胶浓度为10%，所述隔离胶为一层，所述隔离胶的凝胶浓度为20%；所述分离胶的凝胶浓度为10%-16%（如12%）。

上述方法中，所述分离胶的长度可为1-12厘米；储存胶的长度可为0.5-2厘米；隔离胶长度可为0.5-6厘米；浓缩胶长度可为1-3厘米。

在实际应用中，可通过调整所述聚丙烯酰胺凝胶的各层胶长度、浓度和/或层数实现对不同种类以及不同量的小分子量蛋白质的分离富集。

在本发明的一个实施例中，所述聚丙烯酰胺凝胶为四层聚丙烯酰胺凝胶，由一层浓缩胶、一层储存胶、一层隔离胶和一层分离胶组成。该聚丙烯酰胺凝胶按照样品的电泳方向依次为浓缩胶、储存胶、隔离胶和分离胶。其中浓缩胶的凝胶浓度为5%、交联度为2.6%；储存胶的凝胶浓度为10%、交联度为3%；隔离胶的凝胶浓度为20%、交联度为3%；分离胶的凝胶浓度为12%、交联度为3%。

对于酵母小分子量蛋白质或多肽的分离，所述分离胶的长度可为1-12厘米（如8.5-10.2厘米）；储存胶长度可为1-1.5厘米；隔离胶长度可为0.8-1.5厘米；浓缩胶长度可为1-3厘米（如1cm）。

对于动物血清（如人血清）小分子量蛋白质或多肽的分离，所述分离胶的长度可为1-12厘米（如9.5厘米）；储存胶长度可为1.5厘米；隔离胶长度可为0.5-1.5厘米（如0.5厘米）；浓缩胶长度可为1-3厘米（如1.5cm）。

上述方法中，所述电泳系统的电泳缓冲液可为但不限于Tricine凝胶系统缓冲液、普通的Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液。所述的Tricine凝胶系统缓冲液中，包括正极缓冲液和负极缓冲液。所述的正极缓冲液的工作液由三羟甲基氨基甲烷、盐酸和水组成，其中水为溶剂。所述正极缓冲液的工作液中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.1M，盐酸浓度为0.0225M。所述正极缓冲液的工作液pH值为8.9。所述负极缓冲液的工作液由三羟甲基氨基甲烷、三（羟甲基）甲基甘氨酸、十二烷基硫酸钠和水组成，其中水为溶剂。所述负极缓冲液的工作液中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.1M，三（羟甲基）甲基甘氨酸的浓度为0.1M，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1%（质量百分含量）。所述负极缓冲液的工作液pH值为8.25。

所述普通Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液的工作液由三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸钠和水组成，其中水为溶剂。所述的普通Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液的工作液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为3g/L，甘氨酸的浓度为14.4g/L，十二烷基硫酸钠的浓度为1g/L。

在实际应用中，可先配制所述正极缓冲液的储备液、所述负极缓冲液的储备液和所述的普通的Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液的储备液，使用时稀释至工作液的浓度即可。

利用上述方法进行电泳时，电泳条件的设置取决于需要分离和浓缩的目的蛋白质亚组的分子量组成，电泳起始电压可设为但不限于30V，当溴酚蓝指示剂进入所述浓缩胶后，可调整电压到但不限于200V直至电泳结束。

本发明还保护上述方法中所述的通过电泳分离小分子量蛋白质或多肽的凝胶过滤装置和聚丙烯酰胺凝胶体系，所述小分子量蛋白质或多肽的分子量小于等于30kDa。

本发明还保护通过电泳富集小分子量蛋白质或多肽的电泳系统。

该通过电泳富集小分子量蛋白质或多肽的电泳系统，由Tricine凝胶系统缓冲液或普通Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液和上述通过电泳分离小分子量蛋白质或多肽的多层分离介质系统，如但不限于聚丙烯酰胺凝胶组成；所述的Tricine凝胶系统缓冲液包括正极缓冲液和负极缓冲液；所述正极缓冲液的工作液由三羟甲基氨基甲烷、盐酸和水组成，水为溶剂，所述正极缓冲液的工作液中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.1M，盐酸浓度为0.0225M；所述正极缓冲液的工作液pH值为8.9；

所述负极缓冲液的工作液可但不限于由三羟甲基氨基甲烷、三（羟甲基）甲基甘氨酸、十二烷基硫酸钠和水组成，水为溶剂，所述负极缓冲液的工作液中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.1M，三（羟甲基）甲基甘氨酸的浓度为0.1M，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1%（质量百分含量）；所述负极缓冲液的工作液pH值为8.25。

所述普通Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液的工作液由三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸钠和水组成，水为溶剂，所述普通Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液的工作液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为3g/L，甘氨酸的浓度为14.4g/L，十二烷基硫酸钠的浓度为1g/L。

上述方法、上述聚丙烯酰胺凝胶或上述电泳系统可用于制备色谱串联质谱的小分子量蛋白质或多肽样品或满足其它生产需要。

上文中，凝胶浓度（T）均是指凝胶溶液中丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的总质量浓度，均为质量百分含量，上述凝胶的交联度（C）均是指凝胶溶液中甲叉双丙烯酰胺占丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量分数。

上文中，所述小分子量蛋白质或多肽的分子量具体可小于等于15kDa。

本发明的通过电泳分离富集小分子量蛋白质或多肽的方法，首先利用低浓度、凝胶孔径大的浓缩胶对蛋白进行压缩堆积，然后利用稍高浓度（如但不限10%）的储存胶接纳来自浓缩胶的浓缩了的蛋白质样品，再通过高浓度的隔离胶或多层梯度凝胶对大分子量蛋白进行截阻，小分子量蛋白可以无保留地顺利通过，最后利用一定浓度的分离胶实现对小分子量蛋白的分离富集。本发明通过电泳分离小分子量蛋白质或多肽的方法其样品上样量高于普通聚丙烯酰胺凝胶（凝胶的孔径相同），如但不限于作为电泳支持介质的SDS-PAGE（如Tricine-SDS-PAGE,Glycine-SDS-PAGE）。富集到的小分子量蛋白条带清晰，分辨率高，弥补了普通凝胶体系进行蛋白质分离时受上样量受限和难于富集特定分子量蛋白质亚组的不足。另外也可调整各层凝胶的长度、浓度或者凝胶体系中凝胶的层数实现对不同种类以及不同量的小分子量蛋白质的分离富集。

本发明的通过电泳分离小分子量蛋白质或多肽的方法在凝胶电泳分离后，酶切胶块，抽提的肽段组分可直接应用高效液相色谱-串联质谱进行分析和鉴定。

本发明方法中所用的聚丙烯酰胺凝胶具有制作方法相对简单、研究成本低、重现性好、分辨率高，对需要分离富集的目的样品无损失以及质谱兼容性好等特点，可有效应用于各种样品的小蛋白富集，为小分子量蛋白质的分离富集提供有效工具，可广泛应用于蛋白质组学的研究。

附图说明

图1为采用基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel filter1分离富集酵母小分子量蛋白一维凝胶电泳图

图2为采用基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel filter2分离富集酵母小分子量蛋白一维凝胶电泳图

图3为采用基于Glycine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel fitler3分离富集酵母小分子量蛋白一维凝胶电泳图

图4为采用步骤1中（4）12%Tricine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液进行电泳分离富集酵母小分量蛋白一维凝胶电泳图1

图5为采用步骤1中（4）12%Tricine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液进行电泳分离富集酵母小分量蛋白一维凝胶电泳图2

图6为采用步骤1中（3）10%Glycine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液进行电泳分离富集酵母小分子量蛋白一维凝胶电泳图

图7为采用基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel filter4分离富集血清小分子量蛋白一维凝胶电泳图

图8为采用基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel filter5分离富集血清小分子量蛋白一维凝胶电泳图

图9为采用基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel filter6分离富集血清小分子量蛋白一维凝胶电泳图

图10为采用实施例3步骤1中（3）12%Tricine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液分离富集血清小分子量蛋白一维凝胶电泳图

图11为采用实施例3步骤1中（2）12%Glycine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液分离富集血清小分子量蛋白一维凝胶电泳图

图12为三种血清小分子量蛋白分离富集方法一维凝胶电泳图

图13为三种血清小分子量蛋白分离富集方法小分子量蛋白鉴定维恩图

图14为三种血清小分子量蛋白分离富集方法鉴定到的小分子量蛋白分子量分布柱状图

图15为三种血清小分子量蛋白分离富集方法鉴定到的小分子量肽段曲线图

图16为三种血清小分子量蛋白分离富集方法共同鉴定到50个血清小分子量蛋白序列覆盖度柱状图

图17为三种血清小分子量蛋白分离富集方法鉴定到的小分子量蛋白浓度分布柱状图

图18为Gel filter分离富集酵母小分子量蛋白一维凝胶电泳图

图19为Gel filter方法鉴定到的小分子量蛋白分子量分布柱状图

图20为Gel filter方法鉴定到的小分子量肽段分布柱状图

图1-图12和图18中泳道上方的质量或体积均为该泳道的样品上样量，如图1中的150μg表示该泳道的上样量是150μg。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的凝胶浓度（T）均是指凝胶溶液中丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的总质量浓度，均为质量百分含量；凝胶的交联度（C）均是指凝胶溶液中甲叉双丙烯酰胺占丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量分数。

实施例1、本发明Gel filter的电泳支持介质和电泳缓冲液

（1）本实施例中Gel filter采用的电泳支持介质是基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶，为四层聚丙烯酰胺凝胶，由一层浓缩胶、一层储存胶、一层隔离胶和一层分离胶组成。该SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶按照样品的电泳方向依次为浓缩胶、储存胶、隔离胶和分离胶。其中浓缩胶的凝胶浓度为5%、交联度为2.6%；储存胶的凝胶浓度为10%、交联度为3%；隔离胶的凝胶浓度为20%、交联度为3%；分离胶的凝胶浓度为12%、交联度为3%。

该Gel filter的不连续聚丙烯酰胺凝胶的厚度为0.75毫米，总长为13cm，制备方法如下：按照表1配方，先配置凝胶浓度为12%的分离胶（表1中12%列凝胶），加入胶板中，该部分凝胶长度为3-12厘米，3毫升0.1%SDS溶液封胶，静置30分钟后将0.1%SDS溶液倒出。第二步配置凝胶浓度为20%的隔离胶（表1中20%列凝胶），长度为0.5-3厘米，3毫升0.1%SDS溶液封胶，静置30分钟后将0.1%SDS液体倒出。第三步配置凝胶浓度为10%的储存胶（表1中10%列凝胶），长度为0.5-3厘米，3毫升0.1%SDS溶液封胶，静置30分钟后将0.1%SDS液体倒出。第四步配置凝胶浓度为5%的浓缩胶，长度为1-3厘米。

表1为Tricine-SDS-PAGE中的储存胶、隔离胶和分离胶制备

凝胶终浓度（%）	9%	10%	12%	16%	20%
						总体积(mL)	15.0	15.0	15.0	15.0	15.0
超纯水(mL)	7.3	7.0	6.4	5.2	4.0
						凝胶缓冲液(3×)(mL)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
甘油(g)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
						49.5%丙烯酰胺水溶液(mL)	2.7	3.0	3.6	4.8	6
10%过硫酸铵水溶液(μL)	150	150	150	150	150
						四甲基乙二铵TEMED(μL)	15	15	10	8	5

表2为Tricine-SDS-PAGE中的浓缩胶制备

该Tricine-SDS-PAGE的电泳采用与普通Tricine-SDS-PAGE相同的电泳体系，凝胶缓冲液（3×）以及电泳缓冲液（正极缓冲液和负极缓冲液）的成分如下：

表3.凝胶缓冲液及电泳缓冲液的配置

其中，49.5%丙烯酰胺水溶液的配制方法如下：称取48克丙烯酰胺，1.5克甲叉双丙烯酰胺，超纯水溶解，定容至终体积100毫升，0.45微米滤膜过滤。该49.5%丙烯酰胺水溶液中甲叉双丙烯酰胺占丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量分数为3%。

10%过硫酸铵水溶液：称取10克过硫酸铵超纯水溶解超纯水，定容至100毫升，分装，存放于-20℃冰箱。

备注：三羟甲基氨基甲烷（tris），三（羟甲基）甲基甘氨酸（tricine），丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，过硫酸铵，四甲基乙二铵（TEMED），十二烷基硫酸钠，甘油均购买自美国Amresco公司，30%丙烯酰胺水溶液（甲叉双丙烯酰胺占丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量分数为2.6%）购自美国Bio-rad公司，其余为国产分析纯试剂。

（2）本实施例中Gel filter采用的电泳支持介质是基于Glycine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶，为四层聚丙烯酰胺凝胶，同实施例1（1）。其中浓缩胶的凝胶浓度为5%、交联度为2.6%；储存胶的凝胶浓度为10%、交联度为2.6%；隔离胶的凝胶浓度为20%、交联度为2.6%；分离胶的凝胶浓度为12%、交联度为2.6%。

参照实施例1（1）的方法制备基于Glycine-SDS-PAGE不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel filter凝胶。

表4Glycine-SDS-PAGE储存胶、隔离胶和分离胶的配置

凝胶终浓度(%)	9%	10%	12%	15%	20%
						总体积(mL)	15.0	15.0	15.0	15.0	15.0
超纯水(mL)	6.8	6.3	5.3	3.8	1.2
						4×下层凝胶缓冲液(mL)	3.8	3.8	3.8	3.8	3.8
30%丙烯酰胺水溶液(mL)	4.5	5.0	6.0	7.5	10.0
						10%十二烷基硫酸钠水溶液(μL)	150	150	150	150	300
10%过硫酸铵水溶液(μL)	150	150	150	150	300
						四甲基乙二铵TEMED(μL)	15.0	15.0	12.0	10.0	6.0

表5Glycine-SDS-PAGE浓缩胶的配置

其中，10%过硫酸铵水溶液的组成及配制方法同实施例1（1）。其它几种溶液的配置方法如下：

4×下层凝胶缓冲液：1.5M Tris-HCL(pH8.8)，称取90.75克三羟甲基氨基甲烷溶解在400毫升超纯水中，盐酸调节pH至8.8，超纯水定容至500毫升。

8×上层凝胶缓冲液：1.0M Tris-HCL(pH6.8)，称取60.5克三羟甲基氨基甲烷溶解至400毫升水中，盐酸调节pH至6.8。

10%十二烷基硫酸钠水溶液：称取10克十二烷基硫酸钠，溶解，超纯水定容至100毫升。

电泳缓冲液：称取3克三羟甲基氨基甲烷和14.4克甘氨酸，加入10毫升10%十二烷基硫酸钠水溶液，超纯水定容至1升。

备注：三羟甲基氨基甲烷（tris），过硫酸铵，四甲基乙二铵（TEMED），十二烷基硫酸钠，甘油，均购买自美国Amresco公司；30%丙烯酰氨水溶液（甲叉双丙烯酰胺占丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量分数为2.6%）购自美国Bio-rad公司；其余为国产分析纯试剂。

实施例2、Gel filter分离富集酵母小分子量蛋白应用实例及与其它凝胶方法的比较

10%Glycine-SDS-PAGE蛋白质分离的分子量范围介于15kDa到70kDa之间，是常用分离样品全蛋白的凝胶。12%Tricine-SDS-PAGE可以对分子量小于30kDa的小分子量蛋白进行较好的分离，同时大分子量蛋白在其中的分辨率尚可，且凝胶的孔径大小可以兼容蛋白质组学样品的后期制备，是小分子量蛋白的较好分离体系。酵母是实验室常用的模式生物，其样品复杂度介于大肠杆菌与哺乳动物之间，本部分实施例选择酵母全蛋白对各种凝胶体系进行比较，包括10%Glycine-SDS-PAGE和12%Tricine-SDS-PAGE凝胶体系，本实施例与实施例1中的Gel filter凝胶具有不同的凝胶组成、长度和不同凝胶层数的凝胶体系，研究这些参数对酵母小分子量蛋白分离富集的效果。

1.几种凝胶的制备

（1）两种基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel filter凝胶

按照实施例1（1）的方法制备两种实施例1的Gel filter凝胶，分别命名为Gelfilter1和Gel filter2。Gel filter1和Gel filter2均为四层聚丙烯酰胺凝胶，除浓缩胶、储存胶、隔离胶和分离胶的长度与实施例1的Gel filter凝胶不同外，其它均与实施例1的Gel filter凝胶相同。Gel filter1的分离胶的凝胶长度为8.5厘米，储存胶的凝胶长度为1.5厘米，隔离胶的凝胶长度为1.5厘米，浓缩胶的长度为1.5厘米。Gel filter2的分离胶的凝胶长度为10.2厘米，储存胶的凝胶长度为1.0厘米，隔离胶的凝胶长度为0.8厘米，浓缩胶的长度为1.0厘米。

（2）基于Glycine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel filter凝胶

按照实施例1（2）的方法制备实施例1的Gel filter凝胶，命名为Gel filter3。Gel filter3为四层聚丙烯酰胺凝胶，包括一层浓缩胶、一层储存胶、一层隔离胶和一层分离胶。其中浓缩胶的凝胶长度为1.5cm，储存胶的凝胶长度为1.5cm；隔离胶的凝胶长度为1.5cm；分离胶的凝胶长度为8.5cm。

（3）10%Glycine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液

10%Glycine-SDS-PAGE的电泳支持介质是两层聚丙烯酰胺凝胶，由一层浓缩胶和一层分离胶组成。浓缩胶的凝胶浓度为5%，交联度为2.6%，凝胶长度为1厘米。分离胶的凝胶浓度为10%、交联度为2.6%（表4中10%列凝胶），凝胶长度为12厘米。该10%Glycine-SDS-PAGE中所采用的电泳缓冲液同实施例1（2）。

（4）12%Tricine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液

12%Tricine-SDS-PAGE的电泳支持介质是两层聚丙烯酰胺凝胶，由一层浓缩胶和一层分离胶组成。浓缩胶的凝胶浓度为5%，交联度为2.6%，凝胶长度为1厘米。分离胶的凝胶浓度为12%、交联度为3%（表1中12%列凝胶），凝胶长度为12厘米。

12%Tricine-SDS-PAGE的电泳缓冲液同实施例1（1）。

2.酵母全蛋白的制备：取酿酒酵母BY4741（Ping Xu,Duc M.Duong,Junmin Peng,et al.,Quantitative proteomics reveals the function of unconventionalubiquitin chains in proteasomal degradation.Cell.2009.137:1-13。公众可从美国Open Biosystems保藏中心获得该菌株）菌体，加入250μL裂解液（8M尿素，50mM碳酸氢铵，10mM碘乙酰胺），加入直径为0.5毫米的玻璃珠0.2克，涡旋混合仪以最大转速涡旋8min；13300rpm离心2min，上清移至新的EP管，13300rpm离心6min，收集上清，共260μL，用常用的Bradford法测定蛋白浓度，为9.6μg/μL；加入5×loading buffer（20%Ficoll，10%SDS，50mM Tris(pH6.8)，0.1%bromophenol blue），13300rpm离心7min。

3.电泳

分别进行A1、A2、A3、B1、B2和B3的电泳。

A1、分别取150，200，250，300，350，400μg样品采用步骤1中（1）的Gel filter1作为电泳支持介质、采用实施例1的电极缓冲液进行电泳分离。电泳起始电压为30V，当溴酚蓝指示剂进入浓缩胶后，调整电压为200V。当样品指示剂进入最下层12%分离胶3厘米处停止电泳，凝胶固定，考马斯亮蓝染色，脱色。结果如图1所示。

A2、分别取30，35，40，45，50，55，60μg样品采用步骤1中（1）的Gel filter2作为电泳支持介质、采用实施例1的电极缓冲液进行电泳分离。其它操作同A1所述。结果见图2所示。

A3、分别取80，150μg样品采用步骤1中（2）的Gel filter3电泳支持介质和电泳缓冲液进行电泳分离。其它操作同B3，结果如图3所示。

B1、分别取20，30，40，45，50，60μg样品采用步骤1中（4）12%Tricine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液进行电泳分离。其它操作同A1所述。结果如图4。

B2、取100，150，200，300μg样品采用步骤1中（4）12%Tricine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液进行电泳分离。其它操作同A1所述。结果如图5。

B3、取60，120，200，300μg样品采用步骤1中（3）10%Glycine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液进行电泳分离。电泳起始电压为80V，当指示剂（溴酚蓝）进入分离胶3厘米处调整电压为100V，随后每隔1.5h调整电压，以20V递增，分别为120V，140V，160V，当溴酚蓝指示剂距离凝胶底部2厘米处停止电泳，考马斯亮蓝染色，脱色。结果如图6。

图1-2显示，利用步骤1中（1）的两种基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的Gel filter凝胶体系中凝胶浓度为20%的隔离胶对大分子量蛋白起到显著的截留作用，而分子量在10-15kDa范围的蛋白条带清晰可见，且随着上样量的增加，小分子量蛋白质条带着色逐步加深，说明低丰度的小分子量蛋白质可被有效富集，且不为高丰度的大分子量蛋白质干扰。即使当样品上样量达到350μ_g时仍然可以保持相对较好的分辨率（图1）。另外，调整Gel filter凝胶中各层凝胶的长度或凝胶层数，小分子量区域的蛋白质也可获得较好的富集效率。

图4-5显示，采用步骤1中（4）12%Tricine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液进行电泳，随着蛋白上样量的增加，富集的小蛋白质也随之增多；然而当样品量逐渐增大，条带弥散现象也逐渐明显，分辨率随之降低，尤其是当样品量达到300u_g时，整条泳道的蛋白质条带模糊，可见这个蛋白质上样量在该凝胶体系上已经过饱和（图5），超出了凝胶的承载量，降低了分辨率。相比采用Gel filter1和Gel filter2作为电泳支持介质的分离方法，12%Tricine-SDS-PAGE的电泳体系存在样品上样量有限的问题，降低了后续的联合应用质谱鉴定低丰度蛋白的效率。

图3显示，采用步骤1中（2）Gel filter3，大部分大分子量蛋白被截留在20%隔离胶，小分子量蛋白得到一定富集，通过增加蛋白上样量可提高富集的小分子量蛋白质的量。这将有利于后续联合应用质谱进行分析鉴定。

图6显示采用步骤1中（3）10%Glycine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液进行电泳，随着蛋白上样量的增加，小蛋白的量并无显著提高，这可能由于小蛋白质在10%Glycine-SDS-PAGE的电泳支持介质中扩散，无法富集所致。

该实施例的所有电泳中，各种电泳支持介质的加样孔体积和形状均一致，加样孔体积为80μL。

实施例3、Gel filter分离富集血液小分子量蛋白应用实例及与其他凝胶方法的比较

血液在体内不断循环，与各种体液相互交换，血清中蛋白的变化常能反应出一定的生理变化，因此血清检测常作为疾病的诊断标准。蛋白质组学得到广泛发展后，人们希望通过研究血清蛋白质组的变化诊断甚至预测更多疾病的发生发展情况。血清中含有多种不同种类和功能的蛋白质/多肽。其浓度相差10⁸-10¹²个数量级以上（35-50mg/mL白蛋白至0-5pg/mL IL6）。其中22种高丰度蛋白质的量占到血清中所有蛋白质量的99%，而剩余的1%的血清蛋白质却包含了成千上万的低丰度、小分子量的蛋白/多肽，这些低丰度小蛋白质在人体的生理和病理过程中起着非常重要的作用，富含多种潜在的生物标志物。然而血清中高丰度蛋白的存在干扰了许多重要的低丰度、小分子量蛋白质的检测与鉴定。针对以上因素，本部分实施例采用包括实施例1的Gelfilter凝胶、12%Glycine-SDS-PAGE和12%Tricine-SDS-PAGE等在内的三种凝胶体系分离富集血清小分子量蛋白。

1.各种凝胶的制备

（1）三种基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel filter

按照实施例1（1）的方法制备三种实施例1的基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶，分别命名为Gel filter4、Gel filter5和Gel filter6。Gel filter4、Gel filter5和Gel filter6凝胶，均为四层聚丙烯酰胺凝胶，除浓缩胶、储存胶、隔离胶和分离胶的长度与实施例1（1）的Gel filter凝胶不同外，其它均与实施例1（1）的Gel filter凝胶相同。Gel filter4和Gel filter5的分离胶的凝胶长度均为8.5厘米，隔离胶的凝胶长度均为1.5厘米，储存胶的凝胶长度均为1.5厘米，浓缩胶的长度均为1.5厘米。Gel filter6的分离胶的凝胶长度为9.5厘米，储存胶的凝胶长度为1.5厘米，隔离胶的凝胶长度为0.5厘米，浓缩胶的长度为1.5厘米。

（2）12%Glycine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液

12%Glycine-SDS-PAGE的电泳支持介质是两层聚丙烯酰胺凝胶，该两层聚丙烯酰胺凝胶的浓缩胶浓度为5%，交联度为2.6%，分离胶的浓度为12%、交联度为2.6%（表4中12%列凝胶）。该12%Glycine-SDS-PAGE中所采用的电泳缓冲液同实施例1（2）。

（3）12%Tricine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液同实施例2。

2.血清样品的制备

取60μL人血清，加入120μL裂解液（8M尿素，10mM碘乙酰胺），室温静置5min，加入150μL5×loading buffer（20%Ficoll,10%SDS,50mM Tris(pH6.8),0.1%bromophenol blue），13300rpm离心7min。得到血清样品。

3.电泳

分别进行C1、C2、C3、D1和D2的电泳。该实施例的所有电泳中，各种电泳支持介质的加样孔体积和形状均一致，加样孔体积为80μL。

C1、分别取1μL，2μL，3μL，4μL，5μL，6μL血清，采用步骤1中（1）的Gel filter4作为电泳支持介质和电极缓冲液进行电泳分离。电泳起始电压为30V。当溴酚蓝指示剂完全进入浓缩胶后，调整电压为200V。当溴酚蓝指示剂到达距离最下层的12%分离胶底部2厘米处停止电泳。凝胶上的蛋白质经考马斯亮蓝染色，脱色。结果如图7所示。

C2、分别取3μL，5μL，10μL和10μL血清采用步骤1中（1）的Gel filter5作为电泳支持介质和电极缓冲液进行电泳分离。其它操作同C1所述。结果见图8所示。

C3、取6μL血清采用步骤1中（1）的Gel filter6作为电泳支持介质和电极缓冲液进行电泳分离。其它操作同C1所述。结果见图9所示。

D1、分别取1μL，3μL，5μL，7μL血清采用步骤1中（3）12%Tricine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液进行电泳分离。其它操作同C1所述。结果如图10所示。

D2、分别取3μL，5μL，7μL血清采用步骤1中（2）12%Glycine-SDS-PAGE的电泳支持介质和电泳缓冲液进行电泳分离。电泳电压为80V。当溴酚蓝指示剂距离凝胶底部2厘米处停止电泳，考马斯亮蓝染色，脱色。结果如图11所示。

图7-9显示，Gel filter凝胶中高浓度的隔离胶可截留大量高丰度的大分子量蛋白，对小分子量蛋白有较好的分离富集效果，且分子量在15kDa以下的蛋白质的条带清晰可见，表明该体系对小分子量蛋白的分辨率高。随着样品上样量的增加，富集的小分子量蛋白质也逐步增多。图9显示，Gel filter7对小分子量蛋白有较好的分离富集效果，分子量10kDa以下条带清晰可见，说明调整Gel filter凝胶体系中的凝胶长度也可获得较好的小分子量蛋白富集效果。图10-11显示，12%Tricine-SDS-PAGE在小分子量蛋白的分辨率较优于12%Glycine-SDS-PAGE，随着蛋白上样量的增加，5-30kDa分子量范围内的蛋白质条带的着色在一定程度的逐步加深，表明

12%Tricine-SDS-PAGE小蛋白的富集效率有所提高，然而提高的幅度并不大。当样品量达到7μL（图10中上样量为7μL/泳道）时，该凝胶体系存在过载现象，再增加上样量，小蛋白的富集效率因为过载反而降低。同样样品上样量（如图7、8和10中上样量为3μL和5μL泳道），Gel filter凝胶方法的小蛋白富集效率均优于

12%Tricine-SDS-PAGE。这在分子量15kDa以下区域的蛋白质显得更为明显，表现在通过Gel filter凝胶分离方法富集到的小蛋白质的条带着色更深。而Gel filter凝胶方法即使在承载更多量的蛋白质的情况下也不影响小蛋白在凝胶上的分辨率（如图8所示），可有效提高样品中目的小蛋白质的富集度，有利于后续的质谱鉴定。图11显示，12%Glycine-SDS-PAGE未能对小分子量蛋白进行有效的分离，条带模糊，分辨率较差。另外，同样的上样量，Glycine-SDS-PAGE有明显的过载现象（见图11中泳道3），而Gel filter凝胶电泳仍然保持较好的分辨率。

实施例4、Gel filter-LC-MS/MS路线的应用实例1

采用血清样本全蛋白进行本发明的基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel filter电泳分离，与常规12%Glycine-SDS-PAGE分离方法和差异溶出（Differential Solubilization，DS)方法进行比较。切取目的蛋白条带，胶内酶解并抽提肽段，进行LC-MS/MS鉴定，评估三种方法对高丰度蛋白去除效率以及小分子量蛋白富集效率。

1.血清样品制备及电泳

1）12%Glycine-SDS-PAGE方法

取6μL人血清，加入12μL裂解液（8M尿素，10mM碘乙酰胺），室温静置5min，加入5×loading buffer（20%Ficoll，10%SDS，50mM Tris(pH6.8),0.1%bromophenolblue），13300rpm离心7min。得到血清样品。

取1μL，2μL，3μL血清样品按照实施例3的方法进行12%Glycine-SDS-PAGE分离。结果如图12中A所示。

2）差异溶出方法

取12μL人血清，加入24μL裂解液（8M尿素，10mM碘乙酰胺），室温静置5min，其中20μL加入200μL预冷丙酮，然后将该混合液置于-20℃冰箱中静置4小时，4℃，19000g，15min，收集的沉淀中加入200μL含有70%乙腈和12mM盐酸的混合溶液，冰上静置1小时，4℃，19000g离心15min，收集上清。加入20μL1×loading buffer，13300rpm离心7min。另余4μL样品加入16μL1×loading buffer（20%Ficoll,10%SDS,50mM Tris(pH6.8),0.1%bromophenol blue），13300rpm离心7min。得到血清样品。

对照组为未经DS方法处理2μL血清，处理组为经DS方法处理10μL血清样品，按照实施例3的方法进行12%Tricine-SDS-PAGE分离。结果如图12中B所示。图12的B中，2μL表示对照组，10μL表示血清样品。

3）本发明的Gel filter凝胶电泳方法

取18μL人血清，加入36μL裂解液（8M尿素，10mM碘乙酰胺），室温静置5min，加入5×loading buffer（20%Ficoll，10%SDS，50mM Tris(pH6.8)，0.1%bromophenolblue），13300rpm，7min。得到血清样品。

取3μL，5μL，10μL血清样品采用实施例3的Gel filter4作为电泳支持介质按照实施例3的C2的电泳方法进行电泳分离。结果如图12中C所示。

该实施例的所有电泳中，各种电泳支持介质的加样孔体积和形状均一致，加样孔体积为80μL。

2．样品酶解

根据分子量标准，切取各凝胶30kDa以下的含有蛋白质的胶条，再将胶条切为长、宽各1毫米的颗粒。使用含有50mM碳酸氢铵的30%乙腈对胶粒进行脱色，100%乙腈脱水干燥后以10ng/μL的胰蛋白酶trypsin消化12小时。消化12小时后加入5%甲酸和50%乙腈的混合液终止消化，13300rpm离心后收集上清，然后加入60μL乙腈，涡旋20分钟，13300rpm离心1分钟后收集上清，再次加入乙腈60μL，重复涡旋离心操作，直至凝胶颗粒中液体抽干，胶粒完全变硬。将得到的三种方法的肽段溶液在真空干燥仪器中完全蒸干。

3．色谱-质谱联用分析

将上述蒸干的肽段用10μL的0.5%乙腈和0.1%甲酸的色谱-质谱联用上样缓冲液进行溶解，取2μL进行色谱-质谱联用分析，具体参照文献Ping Xu,Duc M Duong,Junming Peng,et al.,Systematical optimization of reverse-phasechromatography for shotgun proteomics.Journal of Proteome Research.2009,8(8),3944-50.中记载的方法。

4．结果

12%Glycine-SDS-PAGE方法结果显示，随着样品上样量增加，小分子量蛋白的富集效率并无显著增加，表明该体系的分辨率不高，样品上样量也受到限制。该凝胶体系仅是根据分子量大小对样品进行分离，对高丰度蛋白并不能达到去除的效果。因此会在一定程度上影响后续质谱鉴定（图12中A）。应用DS方法对血清样品进行处理后，与对照组相比，高丰度蛋白得到一定程度去除，同时富集到小分子量蛋白（图12中B）。本发明的Gel filter凝胶电泳方法中，大分子量、高丰度蛋白被高浓度的隔离胶有效截留，随着样品上样量的增加，小分子量蛋白的富集效率也逐步提高，同时仍可保持较好的分辨率，10μL血清样品中的5-30kDa的条带清晰可见，条带数目多于DS方法获得的蛋白质条带数目，蛋白质条带的深浅也发生了变化，表明Gel filter可在保留样品中小蛋白质相对含量的前提下提高了小蛋白质总体的富集效果（图12中C）。

图13显示，本发明的Gel filter凝胶电泳方法鉴定的小分子量蛋白（≤30kDa）总数为332个，而12%Glycine-SDS-PAGE和DS方法鉴定到的小蛋白总数分别是130个和191个，表明Gel filter凝胶电泳方法富集小蛋白质的效果显著高于12%Glycine-SDS-PAGE和DS方法。另外，本发明的Gel filter电泳方法特有鉴定的小蛋白数为225个，显著比另外两种方法特有鉴定到的小蛋白数目多。对三种方法鉴定到的小分子量蛋白分子量分布进行分析，结果如图14所示，本发明的Gel filter凝胶电泳方法鉴定到的小蛋白其分子量更偏向25kDa以下的蛋白，而其他两种方法鉴定到的小蛋白分子量更偏向30kDa，说明本发明的Gel filter凝胶电泳方法可富集到更多小于25kDa的蛋白，且在富集更小分子量的蛋白质/多肽方面更有优势。小分量蛋白肽段总数比较结果显示，本发明的Gel filter凝胶电泳方法可鉴定到950个小分子量肽段，DS方法和12%Glycine-SDS-PAG方法鉴定到的小分子量肽段总数分别为576个和347个（图15）。对三种方法共同鉴定到的50个小分子量蛋白的序列覆盖度进行分析，结果显示，本发明的Gel filter凝胶电泳方法鉴定到的蛋白序列覆盖度高于其他两种方法（图16）。此外，本发明的Gel filter凝胶电泳方法可富集到更多的低丰度小分子量蛋白(图17)。

实施例5、Gel filter-LC-MS/MS路线的应用实例2

采用酿酒酵母BY4741样品全蛋白进行本发明的基于Tricine-SDS-PAGE的不连续聚丙烯酰胺凝胶的Gel filter电泳分离，切取目的蛋白条带，胶内酶解并抽提肽段，进行LC-MS/MS鉴定，评估随着蛋白上样量的增加，高丰度蛋白去除效率以及小分子量蛋白富集效率。

1.酵母样品制备及本发明的Gel filter凝胶电泳方法

同实施例2中步骤2样品制备方法。按照实施例1（1）的方法制备Gel filter凝胶，命名为Gel filter7。Gel filter7凝胶为四层聚丙烯酰胺凝胶，除隔离胶和分离胶的长度与实施例1（1）的Gel filter凝胶不同外，其它均与实施例1（1）的Gelfilter凝胶相同。Gel filter7的分离胶的凝胶长度为9.2厘米，隔离胶的凝胶长度为0.8厘米，储存胶和浓缩胶的长度均为1.5厘米。

取110μg，150μg，200μg酵母样品采用实施例1（1）的电极缓冲液进行电泳分离。结果如图18所示。

该实施例的电泳中，电泳支持介质的加样孔体积和形状与实施例1,2,3,4均一致，加样孔体积为80μL。

2．样品酶解

同实施例4步骤2所述。本发明的Gel filter凝胶电泳方法分离的每条泳道（图18中上样量为110μg，150μg和200μg的三个泳道）均切为15个条带。

3．色谱-质谱联用分析

同实施例4步骤3所述。

4．结果

图19-20显示，随着样品上样量的增加，本发明的Gel filter电泳方法鉴定的小分子量蛋白数目和小分子量蛋白对应的肽段鉴定数均逐步提高（图中有两个纵坐标，左边纵坐标为柱状图的坐标，右边纵坐标指示的是曲线坐标轴，曲线均为累积曲线）。

通过实验数据表明，本发明的Gel filter凝胶电泳方法可有效去除高丰度蛋白以及提高小分子量蛋白的富集效率。

Claims (9)

1.通过电泳富集样品中小分子量蛋白质或多肽的方法，其特征在于：所述电泳中采用的电泳支持载体是不同孔径的介质，所述的介质是聚丙烯酰胺凝胶；所述聚丙烯酰胺凝胶由浓缩胶、分离胶和位于所述浓缩胶和所述分离胶之间的储存胶和隔离胶组成；所述隔离胶的层数大于或等于1层；所述浓缩胶在电泳过程中不作为分子筛参与蛋白质的分离，样品经过所述浓缩胶被浓缩；所述分离胶根据分子筛作用对样品进行分离，根据被分离物质的相对分子质量的要求选择分离胶的浓度；所述储存胶用于接纳来自所述浓缩胶的样品，防止样品在浓缩胶和所述隔离胶界面扩散；所述隔离胶用于截阻分子量大于30kDa的蛋白质；

所述小分子量蛋白质或多肽的分子量小于等于30kDa；所述浓缩胶中，凝胶浓度为4％-5％，凝胶的交联度为2％-3％；

所述储存胶中，凝胶浓度为6％-15％，凝胶的交联度为2％-3％；

所述隔离胶中，凝胶浓度为20％，凝胶的交联度为2％-3％；

所述分离胶中，凝胶浓度为10％-20％，凝胶的交联度为2％-3％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述储存胶为一层，所述储存胶的凝胶浓度为10％；所述隔离胶为一层，所述隔离胶的凝胶浓度为20％；所述分离胶的凝胶浓度为10％-16％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述浓缩胶的凝胶浓度为5％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述浓缩胶的交联度为2.6％；所述分离胶的凝胶浓度为12％。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述电泳中采用的电泳缓冲液为tricine凝胶系统缓冲液或普通Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液；所述的tricine凝胶系统缓冲液由正极缓冲液和负极缓冲液组成；所述正极缓冲液的工作液由Tris、盐酸和水组成，水为溶剂，所述正极缓冲液的工作液中，Tris的浓度为0.1M，盐酸浓度为0.0225M；所述正极缓冲液的工作液pH值为8.9；

所述负极缓冲液的工作液由Tris、tricine、十二烷基硫酸钠和水组成，水为溶剂，所述负极缓冲液的工作液中，Tris的浓度为0.1M，tricine的浓度为0.1M，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1％质量百分含量；所述负极缓冲液的工作液pH值为8.25；

所述普通Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液的工作液由Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸钠和水组成，水为溶剂，所述普通Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液的工作液中Tris的浓度为3g/L，甘氨酸的浓度为14.4g/L，十二烷基硫酸钠的浓度为1g/L。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：进行电泳时，电泳起始电压为30V，当溴酚蓝进入所述浓缩胶后，调整电压到200V直至电泳结束。

7.通过电泳分离小分子量蛋白质或多肽的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶为权利要求1至4中任一所述方法中的聚丙烯酰胺凝胶；

所述小分子量蛋白质或多肽的分子量小于等于30kDa。

8.通过电泳分离小分子量蛋白质或多肽的电泳系统，由电泳缓冲液和权利要求7所述的通过电泳分离小分子量蛋白质或多肽的聚丙烯酰胺凝胶组成；所述电泳缓冲液为Tricine凝胶系统缓冲液或普通Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液；

所述的Tricine凝胶系统缓冲液由正极缓冲液和负极缓冲液组成；所述正极缓冲液的工作液由Tris、盐酸和水组成，水为溶剂，所述正极缓冲液的工作液中，Tris的浓度为0.1M，盐酸浓度为0.0225M；所述正极缓冲液的工作液pH值为8.9；所述负极缓冲液的工作液由Tris、Tricine、十二烷基硫酸钠和水组成，水为溶剂，所述负极缓冲液的工作液中，Tris的浓度为0.1M，Tricine的浓度为0.1M，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1％质量百分含量；所述负极缓冲液的工作液pH值为8.25；

所述普通Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液的工作液由Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸钠和水组成，水为溶剂，所述普通Glycine-SDS-PAGE电泳缓冲液的工作液中Tris的浓度为3g/L，甘氨酸的浓度为14.4g/L，十二烷基硫酸钠的浓度为1g/L；

所述小分子量蛋白质或多肽的分子量小于等于30kDa大于等于1kDa。

9.权利要求1至6中任一所述的方法、权利要求7所述的聚丙烯酰胺凝胶或权利要求8所述的电泳系统在制备液相色谱-串联质谱的小分子量蛋白质或多肽样品中的应用。