CN112014198A - 一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法 - Google Patents

一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法，通过甲基叔丁基醚、甲醇和水三种溶剂的配制形成单相有机溶剂体系，即混合溶剂A，并将此单相有机溶剂体系作为血清/血浆中的高丰度蛋白的沉淀剂。与传统的有机或无机溶剂沉淀剂相比，显著提高对血清/血浆中的高丰度蛋白的去除效率、以及内源性低分子量蛋白和多肽与高丰度蛋白之间的解离效率；同时，通过混合溶剂B增加甲基叔丁基醚及去离子水的含量，将单相溶剂体系一步转换为有机和水两相溶剂体系，使疏水性脂质主要分布于有机相中，实现对血清/血浆中疏水性脂质组分的有效去除或提取、以及LMWPs的高效富集和纯化，进而提高了LMWPs的鉴定数目。

Description

一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及一种富集方法，具体涉及一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法，尤其是一种基于甲基叔丁基醚/甲醇/水体系的去除血清/血浆中高丰度蛋白及脂质和富集内源性低分子量蛋白/多肽的试剂盒及方法。
背景技术
血液中内源性低分子量蛋白质与多肽(<30kDa，缩写为：LMWPs)通常主要包括体内自身存在的活性多肽(如激素、细胞因子、神经肽等)以及体内蛋白质经特殊水解酶特异性水解的产物。由于其具有分质量小的特点，LMWPs可以从机体组织或病灶等各个位置自由通过内皮细胞进入血液。LMWPs作为参与生命活动中细胞分化、神经激素递质调节、炎症、肿瘤发生和发展、免疫细胞渗透等进程的产物，可以准确、灵敏地反映机体的生理和病理状态。因此，对血液等样本中LMWPs的研究可以为临床疾病的早期诊断、分期和分型，以及预后和药物安全性和有效性评估等方面提供高灵敏、高特异性的分子标志物。同时，针对内源性LMWP的活性酶相关性、后修饰以及与其相互作用蛋白质的更深入研究也将有助于探索疾病的发生、发展、转移机制等。因此，LMWPs在临床医学和生物制药等领域有着广阔的应用前景。
然而，目前血液中LMWPs的分析和鉴定仍面临着很大的挑战，主要原因如下：1)LMWPs的丰度比较低，其分析和鉴定往往容易受到血液中高丰度蛋白(占总含量的99％以上)屏蔽作用的影响；2)LMWPs容易被血液中存在的多种蛋白酶降解，导致其丰度进一步降低；3)由于其分子量小，容易被肾脏或肝脏快速的清除和吸收，导致LMWPs的半衰期比较短；4)为了避免被快速地清除，LMWPs往往选择依附于其他高丰度蛋白(载体蛋白)，如果不能有效的解离，容易导致在去除高丰度蛋白的过程中一并丢失。因此，对低分子量蛋白/多肽的提取和富集是系统分析和鉴定血液中LMWPs的重要前提步骤。
目前，针对血液中内源性LMWPs具有分子量小和丰度低的特点，研究者发展了许多不同的提取和富集方法，主要包括有机和无机溶剂沉淀方法、超滤技术(分子量截留膜)、固相萃取技术、免疫亲和法及凝胶分离法等。其中，有机和无机溶剂沉淀法，例如乙腈、甲醇和TCA等，由于具有操作简便、富集效率高的特点而备受青睐。尽管如此，由于血液样本的高度复杂性和大量高丰度蛋白质的存在，使得这些方法在LMWPs分析和鉴定中的应用仍存在一定的局限性。
发明内容
针对以上现有技术存在的不足之处，本发明提供了一种用于富集血清/血浆中内源性低分子量蛋白和多肽的方法，能够将血清/血浆中的高丰度蛋白及脂质的去除与内源性低分子量蛋白/多肽(LMWPs)的富集同时进行，以克服传统的有机或无机溶剂沉淀法等在血清/血浆中的高丰度蛋白的去除、以及LMWPs与高丰度蛋白解离等方面效率的不足的问题。
本发明第一方面提供了一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒，包括用于盛放溶剂的容器，所述容器盛放的溶液包括：
混合溶剂A，包括去离子水、甲基叔丁基醚和甲醇，用于使血清/血浆样本处于单相有机溶剂体系中，实现对高丰度蛋白沉淀析出；
混合溶剂B，包括去离子水和甲基叔丁基醚，用于将含有所述血清/血浆样本的单相有机溶剂体系转换成有机和水两相溶剂体系，使所述血清/血浆样本中的疏水性脂质位于有机相中，以便对疏水性脂质分离。
本发明第二方面提供了一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法，应用上述所述的试剂盒对血浆/血清样本的内源性低分子量蛋白和多肽富集，富集方法包括：
向所述血浆/血清样本中加入混合溶剂A，使所述血浆/血清样本处于单相有机溶剂体系中，使高丰度蛋白沉淀析出；
通过离心分离去除高丰度蛋白沉淀，获得上清溶液；
向所述上清溶液中加入混合溶剂B，使上清溶液转换成有机和水两相溶剂体系，其中，疏水性脂质位于有机相中，内源性低分子量蛋白和多肽位于水相中；
将有机相去除或对有机相进行真空冻干，完成对血浆/血清的疏水性脂质的提取；
对水相溶液进行冻干处理，即可完成对血清/血浆中内源性低分子量蛋白和多肽的富集。
进一步的，在向血浆/血清样本中加入混合溶剂A时，包括：
向血浆/血清样本中按比例加入混合溶剂A后，涡旋震荡均匀，获得混合溶液，其中，血浆/血清样本与混合溶剂A体积比为1:9。
进一步的，在对所述单相有机溶剂体系中沉淀的高丰度蛋白进行分离时，包括：
对混合溶液静置，静置温度为3-5℃，静置时间为20-40min，待完成对高丰度蛋白的沉淀析出后，再通过离心将混合溶液中的上清溶液与沉淀的高丰度蛋白分离。
进一步的，在将所述混合溶液中的高丰度蛋白与上清溶液分离时，包括：
将所述混合溶液放置在离心机中，在3-5℃的温度下，以21000×g的离心力，离心20-40min，即可将沉淀的高丰度蛋白与上清溶液分离。
进一步的，向所述上清溶液加入混合溶剂B时，包括：
向上清溶液中加入混合溶剂B，经涡旋震荡均匀后，获得有机和水两相溶剂体系，其中，上清溶液和混合溶剂B的体积比为5:6。
进一步的，所述有机和水两相有机溶剂体系中的去离子水、甲基叔丁基醚和甲醇的体积比为1:5:1。
进一步的，对血浆/血清的疏水性脂质的提取时，包括：
通过对所述有机和水两相溶剂体系进行离心处理，对有机相溶液和水相分离，即可将疏水性脂质组分与水溶性内源性低分子量蛋白和多肽组分分离。
进一步的，在对所述有机和水两相溶剂体系进行离心处理时，包括：
将所述混合两相溶液放置在离心机中，在3-5℃的温度下，以1000×g的离心力，离心10-30min，即可将含有疏水性脂质组分的上相有机相与含有内源性低分子量蛋白和多肽的下相水相分离。
本发明提供的一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法，通过甲基叔丁基醚、甲醇和水三种溶剂的配制成单相有机溶剂体系的混合溶剂A，并使此单相有机溶剂体系作为溶解血清/血浆中的高丰度蛋白的沉淀剂，与乙腈、甲醇、TCA等传统的有机或无机溶剂沉淀剂相比，显著提高对血清/血浆中的高丰度蛋白的去除效率、以及内源性低分子量蛋白和多肽(LMWPs)与高丰度蛋白之间的解离效率；同时，通过使用混合溶剂B增加甲基叔丁基醚及去离子水的含量，将单相溶剂体系一步转换为有机和水两相溶剂体系，使疏水性脂质主要分布于有机相中，LMWPs主要分布在水相中，并通过离心分离两相，即可实现对血清/血浆中疏水性脂质组分的有效去除、以及LMWPs的高效富集和纯化，进而大大提高了LMWPs的鉴定数目，同时，也实现了血清/血浆中总脂质的提取。
附图说明
图1为本发明示例性实施例的用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法的流程示意图；
图2为本发明示例性实施例的用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法的操作流程示意图；
图3为通过本发明示例性实施例的方法富集的LMWPs与通过ACN法、30kDa分子量截留膜和TCA方法富集的LMWPs的凝胶电泳分析比较图；
图4为通过本发明示例性实施例的方法富集的LMWPs与通过TCA方法富集的LMWPs的鉴定数目对比图；
图5为通过本发明示例性实施例的方法富集的LMWPs与通过TCA方法富集的LMWPs的分子量分布对比图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
由于，在现有技术中的有机或无机溶剂沉淀法在血清/血浆中高丰度蛋白去除、以及内源性低分子量蛋白和多肽(LMWPs)与载体蛋白(高丰度蛋白)解离等方面的效率还有待提高，以及未考虑脂质对LMWPs续液相分离和质谱分析的影响，本发明提供了一种基于甲基叔丁基醚/甲醇/水体系的同步去除血浆高丰度蛋白及脂质和富集内源性低分子量蛋白/多肽的试剂盒及方法。
本发明提供的一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒，包括用于盛放溶剂的容器，容器盛放的溶液包括混合溶剂A和混合溶剂B，混合溶剂A包括去离子水、甲基叔丁基醚和甲醇，混合溶剂A用于使血清/血浆样本处于单相有机溶剂体系中，实现对高丰度蛋白沉淀析出；混合溶剂B包括去离子水和甲基叔丁基醚，混合溶剂B用于将含有血清/血浆样本的单相有机溶剂体系转换成有机和水两相溶剂体系，使血清/血浆样本中的疏水性脂质位于有机相中，以便对疏水性脂质分离。
作为一优选实施方式，混合溶剂A中的去离子水、甲基叔丁基醚和甲醇的体积比为1:5:3。
作为一优选实施方式，混合溶剂B中的去离子水和甲基叔丁基醚的体积比为1：5。
混合溶剂A和混合溶剂B的用量均可以根据实际血浆/血清样品量进行成比例缩放。
本发明提供的一种用于富集血清/血浆中内源性低分子量蛋白和多肽的方法，参见图1，应用上述所述的试剂盒对血浆/血清样本的内源性低分子量蛋白和多肽富集，富集方法包括：
S100、向血浆/血清样本中加入混合溶剂A，使血浆/血清样本处于单相有机溶剂体系中，使高丰度蛋白沉淀析出；
S200、通过离心分离去除高丰度蛋白沉淀，获得上清溶液；
S300、向上清溶液中加入混合溶剂B，使上清溶液转换成有机和水两相溶剂体系，其中，疏水性脂质位于有机相中，内源性低分子量蛋白和多肽位于水相中；
S400、将有机相去除或对有机相进行真空冻干，完成对血浆/血清的疏水性脂质的提取；
S500、对水相溶液进行冻干处理，即可完成对血清/血浆中内源性低分子量蛋白和多肽的富集。
本发明提供的一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法，通过甲基叔丁基醚、甲醇和水三种溶剂的配制成单相有机溶剂体系的混合溶剂A，并使此单相有机溶剂体系作为溶解血清/血浆中的高丰度蛋白的沉淀剂，与乙腈、甲醇、TCA等传统的有机或无机溶剂沉淀剂相比，显著提高对血清/血浆中的高丰度蛋白的去除效率、以及内源性低分子量蛋白和多肽(LMWPs)与高丰度蛋白之间的解离效率；同时，通过使用混合溶剂B增加甲基叔丁基醚及去离子水的含量，将单相溶剂体系一步转换为有机和水两相溶剂体系，使疏水性脂质主要分布于有机相中，LMWPs主要分布在水相中，并通过离心分离两相，即可实现对血清/血浆中疏水性脂质组分的有效去除、以及LMWPs的高效富集和纯化，进而大大提高了LMWPs的鉴定数目，同时，也实现了血清/血浆中总脂质的提取。
作为一优选实施方式，在向血浆/血清样本中加入混合溶剂A时，包括：向血浆/血清样本中按比例加入混合溶剂A后，涡旋震荡均匀，获得混合溶液，其中，血浆/血清样本与混合溶剂A体积比为1:9。由于，混合溶剂A中的甲基叔丁基醚、甲醇、和水之间的比例通过适当的调整，才能使其成为单相有机溶剂体系，作为优选的，去离子水、甲基叔丁基醚和甲醇的体积比为1:5:3；其中，血浆/血清与混合溶剂A的体积比为1:9，并且混合溶剂A单相有机溶剂体系的用量也可以根据实际血浆/血清样本量进行成比例缩放。
进一步的，为了提高高丰度蛋白从第一混合溶液中沉淀分离效率，在对所述单相有机溶剂体系中沉淀的高丰度蛋白进行分离时，包括：对混合溶液静置，静置温度为3-5℃，静置时间为20-40min，待完成对高丰度蛋白的沉淀析出后，再通过离心将混合溶液中的上清溶液与沉淀的高丰度蛋白分离。
作为具体地，在将混合溶液中的高丰度蛋白与上清溶液分离时，包括：将所述混合溶液放置在离心机中，在3-5℃的温度下，以21000×g的离心力，离心20-40min，将高丰度蛋白有效沉淀，并与上清溶液分离，即可将沉淀的高丰度蛋白与上清溶液分离。
作为一优选实施方式，向所述上清溶液加入混合溶剂B时，包括：向上清溶液中加入混合溶剂B，经涡旋震荡均匀后，获得有机和水两相溶剂体系，具体的，上层为含有疏水性脂质组分的有机相溶液，下层为含有LMWPs组分的水溶液，其中，上清溶液和混合溶剂B的体积比为5:6。
进一步的，为了提高疏水性脂质组分的去除效率，因此，有机和水两相有机溶剂体系中的去离子水、甲基叔丁基醚和甲醇的体积比为1:5:1。
具体的，由于疏水性脂质主要存在于上层的有机相中，而内源性低分子量蛋白和多肽主要存在于下层的水相溶液中，因此，对血浆/血清的疏水性脂质的提取时，包括：通过对有机和水两相溶剂体系进行离心处理，对有机相溶液和水相分离，即可将疏水性脂质组分与水溶性内源性低分子量蛋白和多肽组分分离。
作为优选的，在对有机和水两相溶剂体系进行离心处理时，包括：将混合两相溶液放置在离心机中，在3-5℃的温度下，以1000×g的离心力，离心10-30min，即可将含有疏水性脂质组分的上相有机相与含有内源性低分子量蛋白和多肽的下相水相分离。
实施例
一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法，参见图2，包括如下步骤：
(1)按照去离子水-甲基叔丁基醚-甲醇(1:5:3,v/v)组成和比例制备混合溶剂A；
(2)取50μL血浆/血清于新的1.5mL试管中，在通风橱中，向血浆/血清中加入450μL混合溶剂A，涡旋震荡均匀，然后置于4℃冰箱中，沉淀30分钟；
(3)待步骤(2)中的沉淀完成后，将试管放置在4℃的离心机中，以21000×g的离心力离心30分钟，将高丰度蛋白沉淀与上清溶液进行充分分离；
(4)将含有LMWPs的上清溶液转入到新的试管中，并注意避免吸取到沉淀物；
(5)按照去离子水-甲基叔丁基醚(1:5,v/v)组成和比例制备混合溶剂B；
(6)向上清溶液中按照5:6的体积比，加入混合溶剂B，充分混合后形成有机和水两相溶剂体系，上相有机相含有疏水性脂质组分，下相水相则含有LMWPs；
(7)对步骤(6)中的溶液进行涡旋震荡后，将试管放置在4℃的离心机中，以1000×g的离心力离心10分钟，将两相充分分离；
(8)待离心结束后，将试管内的上相有机相清液和下相水相分别收集，再分别进行离心浓缩或冷冻干燥，即获得LMWPs部分和总脂质部分，获得的LMWPs可用于后续凝胶电泳或质谱分析等。
对通过本实施例的方法富集的LMWPs与通过ACN方法富集的LMWPs分别进行蛋白质电泳分析，参见图3，位于第一个泳道是蛋白分子量标志物(marker)的电泳分析图，第二三个泳道的是本实施例的方法得到的低分子量蛋白与多肽的电泳分析图，第四五个泳道是60％ACN的方法得到的低分子量蛋白与多肽(<30kDa)的电泳分析图，最后一个泳道是未经过任何处理的血浆的电泳分析图。由此可见，通过本实施例的方法富集的LMWPs中的高丰度蛋白的含量相对较少，因此，本发明提供的方法显著提高了血浆/血清的高丰度蛋白的去除效率和LMWPs与高丰度蛋白之间的解离效率。
对通过本实施例的方法富集的LMWPs与通过TCA方法富集的LMWPs分别鉴定数目，参见图4，其中，将本实施例的方法记为SPD(Sequential Precipitation andDelipidation)，从图4可以看出SPD法富集的LMWPs鉴定到的多肽数据高于TCA法富集的LMWPs的鉴定到的多肽的具体数目，其中，图4的total指三次技术重复鉴定到的所有的多肽，total后面的是三次技术重复每次的鉴定情况。
对SPD法富集的LMWPs、TCA法富集的LMWPs、以及血浆蛋白质库的蛋白分子量的分布进行对比分析，参见图5，可以看出SPD法富集的LMWPs所鉴定到的分子量小于30kDa的蛋白比例最高，具体的比例展示在右半部分饼图中，这说明本发明提供的方法可以有效的富集低分子量的蛋白，且其富集效果优于TCA法。
本发明通过调整甲基叔丁基醚、甲醇和水三种溶剂之间的比例，选择和优化了一个甲基叔丁基醚/甲醇/水(5:3:1,v/v/v)的单相有机溶剂体系混合溶剂A作为沉淀剂，与乙腈、甲醇、TCA等传统的有机或无机溶剂沉淀剂相比，显著提高了血浆/血清的高丰度蛋白的去除效率和LMWPs与高丰度蛋白之间的解离效率，并通过优化甲基叔丁基醚及去离子水的体积比(5:1，v/v)组成混合溶剂B,按上清溶液-混合溶剂B的体积比(5:6)混合后，将体系一步变换为两相溶剂体系，再利用离心分离两相，实现血浆/血清中疏水性脂质组分的有效去除和LMWPs的高效富集和纯化，进而大大提高了LMWPs的鉴定数目。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒，其特征在于，包括用于盛放溶剂的容器，所述容器盛放的溶液包括：
混合溶剂A，包括去离子水、甲基叔丁基醚和甲醇，用于使血清/血浆样本处于单相有机溶剂体系中，实现对高丰度蛋白沉淀析出；
混合溶剂B，包括去离子水和甲基叔丁基醚，用于将含有所述血清/血浆样本的单相有机溶剂体系转换成有机和水两相溶剂体系，使所述血清/血浆样本中的疏水性脂质位于有机相中，以便对疏水性脂质分离。
2.一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法，其特征在于，应用权利要求1所述的试剂盒对血浆/血清样本的内源性低分子量蛋白和多肽富集，富集方法包括：
向所述血浆/血清样本中加入混合溶剂A，使所述血浆/血清样本处于单相有机溶剂体系中，使高丰度蛋白沉淀析出；
通过离心分离去除高丰度蛋白沉淀，获得上清溶液；
向所述上清溶液中加入混合溶剂B，使上清溶液转换成有机和水两相溶剂体系，其中，疏水性脂质位于有机相中，内源性低分子量蛋白和多肽位于水相中；
将有机相去除或对有机相进行真空冻干，完成对血浆/血清的疏水性脂质的提取；
对水相溶液进行冻干处理，即可完成对血清/血浆中内源性低分子量蛋白和多肽的富集。
3.根据权利要求2所述的用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法，其特征在于，在向血浆/血清样本中加入混合溶剂A时，包括：
向血浆/血清样本中按比例加入混合溶剂A后，涡旋震荡均匀，获得混合溶液，其中，血浆/血清样本与混合溶剂A体积比为1:9。
4.根据权利要求3所述的用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法，其特征在于，在对所述单相有机溶剂体系中沉淀的高丰度蛋白进行分离时，包括：
对混合溶液静置，静置温度为3-5℃，静置时间为20-40min，待完成对高丰度蛋白的沉淀析出后，再通过离心将混合溶液中的上清溶液与沉淀的高丰度蛋白分离。
5.根据权利要求4所述的用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法，其特征在于，在将所述混合溶液中的高丰度蛋白与上清溶液分离时，包括：
将所述混合溶液放置在离心机中，在3-5℃的温度下，以21000×g的离心力，离心20-40min，即可将沉淀的高丰度蛋白与上清溶液分离。
6.根据权利要求2所述的用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法，其特征在于，向所述上清溶液加入混合溶剂B时，包括：
向上清溶液中加入混合溶剂B，经涡旋震荡均匀后，获得有机和水两相溶剂体系，其中，上清溶液和混合溶剂B的体积比为5:6。
7.根据权利要求6所述的用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法，其特征在于，所述有机和水两相有机溶剂体系中的去离子水、甲基叔丁基醚和甲醇的体积比为1:5:1。
8.根据权利要求7所述的用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法，其特征在于，对血浆/血清的疏水性脂质的提取时，包括：
通过对所述有机和水两相溶剂体系进行离心处理，对有机相和水相进行分离，即可将疏水性脂质组分与水溶性内源性低分子量蛋白和多肽组分分离。
9.根据权利要求8所述的用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的方法，其特征在于，在对所述有机和水两相溶剂体系进行离心处理时，包括：
将所述混合两相溶液放置在离心机中，在3-5℃的温度下，以1000×g的离心力，离心10-30min，即可将含有疏水性脂质组分的上相有机相与含有内源性低分子量蛋白和多肽的下相水相分离。
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