JP2009503498A - 固相緩衝剤を使用した等電点に基づくタンパク質の分離 - Google Patents

Abstract

それぞれ固体緩衝剤およびイオン交換樹脂を含む、一連のクロマトグラフィー材料の使用を通じて、タンパク質をそれらのｐＩ値に基づいて混合物から分離できる。各固体緩衝剤は安定したｐＨを発生させるので、通過するタンパク質は正味電荷を有して、適切なイオン交換体の手段によって分離できる。このようにして、同定および研究のためにタンパク質が複雑な生体液から分離できる。

Description

背景
細胞、組織、または流体などの所定の生物学的環境内で発現されるひとそろいのタンパク質の分析であるプロテオミクスは、生物医学研究の主要な焦点になっている。１５０種を超えるゲノムがカタログ化されているが、生体系の疾患および正常動作状態間の違いを真に機能的に理解するには、遺伝子と発現タンパク質との相関が必要である。多くの遺伝子は、例えばいわゆるスプライセオソームによる処理、いわゆるＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）による制御、または翻訳後の変性を通じて間接的に制御されるので、遺伝子転写分析はこの相関を解明できない。したがって、遺伝子−生成物関係を明らかにするためには、タンパク質のカタログを最初に導き出さなくてはならない。

タンパク質をカタログ化できる前に、その天然環境からそれを単離しなくてはならない。混合物中のタンパク質は、それらの等電点に基づいて効果的に分離できる。分子の等電点（ｐI）は分子が正味電荷を保有しない点のｐＨである。等電点電気泳動はこの特質を活用し、それらの酸性および塩基性残基の相対含量に基づいて、タンパク質を分離する。簡単に述べると、確立されたｐＨ勾配を有するか、または電流を印加した後にこのような勾配を確立できる、ポリアクリルアミド、デンプン、アガロースなどから構成されるゲル内にタンパク質を導入する。この勾配は、異なるｐＩ値を有する小型ポリマーである高分子両性電解質の混合物に電気泳動法を施して確立される。ふるい効果を排除するために、ゲルの孔は非常に大きく作られる。タンパク質がゲル中に導入されて電界が印加されると、それらはｐＨがタンパク質の等電点と等しいゲル中の位置に到達するまで移動する。等電点電気泳動はｐＩ値の違いが０．０１程度に小さなタンパク質を解明できるが、技術は労働集約的であり高速大量処理では扱いにくい。

電界内のタンパク質を精製するために、等電位膜がある多区画電解槽（ＭＥ）が１９８９年に導入された。ＭＥは、タンパク質分解性基を保有するアクリルアミドおよびアクリルアミドモノマーの架橋コポリマーを含んでなる膜を利用する。しかし、連続膜の使用はいくつかの欠点を呈する。ポリアクリルアミドの機械的特徴のために、ゲルは硬質支持材に物理的に接着して、それが崩壊することを防止しなくてはならない。また、支持材は、タンパク質に対して透過性であるために、高度に多孔性の構造を有さなくてはならない。さらに膜の機械的脆弱性は、ＭＥの工業規模の応用を邪魔する。

クレティック（Ｃｒｅｔｉｃｈ）ら著、「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、２４：５７７〜５８１頁、２００３年、は先行技術の連続膜を逆エマルジョン重合工程で得られた同一のコモノマー組成物のゲルビーズ床で置き換えることを提案する。開示された等電位ビーズは膜の機械的脆弱性なしに安定したｐＨを与えるが、技術は電界に依存して混合物中のタンパク質を分離する。

したがってタンパク質をｐＩ値に基づいて分離する、より効果的な方法に対する必要性が存在する。

要約
したがって、一の態様では、固体緩衝剤およびイオン交換樹脂を含んでなるクロマトグラフィー材料が提供される。いくつかの実施形態では、固体緩衝剤は異なるｐＫのモノマーから得られた架橋ポリマーを含んでなる。その他の態様では、固体緩衝剤およびイオン交換樹脂は、同一または異なる固体担体に付着できる。一例では、固体担体は粒子である。別の例では、固体緩衝剤のための固体担体は、実質的に表面から内側に延びる複数の腔を有する多孔性粒子を含む。また、固体担体は、膜またはモノリスを含むことができる。その他の実施形態では、固体緩衝剤およびイオン交換樹脂が固体担体に付着していない。

一例では、クロマトグラフィー材料は、（ｉ）５，０００Ｄａよりも低い排除限界を有して、（ｉｉ）直径が約５０μｍを超える粒子に付着する固体緩衝剤を含む。別の例では、クロマトグラフィー材料は、（ｉ）３，０００Ｄａの排除限界を有して、（ｉｉ）約１５０μｍの粒子に付着する固体緩衝剤を含む。

イオン交換樹脂は、アニオンまたはカチオン交換体を含むことができる。

別の態様では、一連の容器を含む装置が提供され、系列内の第１の容器は流体入り口を含み、系列内の最後の容器は流体出口を含み、系列内の各容器は系列内の次の容器と流体連通し、系列内の各容器は固体緩衝剤およびイオン交換樹脂を含む異なるクロマトグラフィー材料を含み、容器は、イオン交換樹脂タイプに従って、クロマトグラフィー材料のｐＨに従って、増大するか、または低下する順に配列される。最上部から底部までの固体緩衝剤の順序がｐＨ減少の順である場合、イオン交換樹脂はカチオン交換体である。最上部から底部までの固体緩衝剤の順序がｐＨ増大の順である場合、イオン交換樹脂はアニオン交換体である。一例では、固体緩衝剤はｐＨ約１１以下の最高ｐＨを有し、固体緩衝剤はｐＨ約３以上の最低ｐＨを有する。

別の例では、容器はマルチウェルフロープレートのウェルであり、系列内の各容器は脱着式導管によって連接する。また、容器は、積み重ねるとフローカラムを形成する、積み重ね可能なカートリッジを含むことができる。

一例では、イオン交換樹脂はアニオン交換体であり、容器は固体緩衝剤のｐＨに従って増大する順に配列されるのに対し、別の例ではイオン交換樹脂はカチオン交換体であり、容器は固体緩衝剤のｐＨに従って低下する順に配列される。

別の実施形態では、タンパク質は、（Ａ）２つ以上のタンパク質の混合物を一連のクロマトグラフィー材料に適用するステップと、（Ｂ）系列内の最後のクロマトグラフィー材料から通過物を収集するステップと、（Ｃ）各クロマトグラフィー材料からタンパク質を別々に脱離させるステップによって、等電点に基づいて分離でき、各クロマトグラフィー材料は（１）固体緩衝剤および（２）イオン交換樹脂を含み、固体緩衝剤はイオン交換体のタイプに従って増大するか、または低下する順に配列される。

本発明のその他の目的、徴群、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。この詳細な説明から、本発明の精神と範囲内で様々な変更と修正ができることは当業者には明らかであるので、詳細な説明および具体例は好ましい実施形態を示しながら、あくまでも例示するために提供される。さらに実施例は本発明の原理を実証するものであり、先行技術当業者にとってそれが明らかに有用なあらゆる例に対する本発明の応用を具体的に例示することは、期待できない。

詳細な説明
本発明は、操作者により選択されるｐＨで稼働するイオン交換クロマトグラフィー材料を提供する。クロマトグラフィー材料は、それを入れた溶液のｐＨを安定化する、イオン交換樹脂と固体緩衝剤との組み合わせを含む。イオン交換材料は、例えばｐＨ３〜ｐＨ１１の一般にクロマトグラフィーで使用されるｐＨ範囲内で荷電される。

タンパク質は、それぞれ固体緩衝剤およびイオン交換樹脂を含む、本発明の一連のクロマトグラフィー材料を使用して、それらのｐＩに基づいて混合物から分離できる。各固体緩衝剤は、水溶液に所定のｐＨを与える両性高分子を含む。したがって、各クロマトグラフィー材料は特定のｐＨを生じる。クロマトグラフィー材料を通過して、それと異なるｐＩを有するタンパク質は、そのｐＩがそれぞれクロマトグラフィー材料のｐＨ未満であるか、それを上回るか、またはそれと同一であるかどうかにより、正味正電荷または正味負電荷のいずれかを有するか、または中性である。環境ｐＨにおいてその電荷がイオン交換樹脂の反対であるタンパク質はイオン交換体に結合するのに対し、中性または同一電荷のタンパク質は非結合のままクロマトグラフィー材料を通過する。すなわち、例えば固体緩衝剤のｐＨで負に帯電したタンパク質が陰イオン交換樹脂に結合する。次に捕捉されたタンパク質をクロマトグラフィー材料から溶出できる。本発明の一実施形態では、各固体緩衝剤が異なるｐＨを生じる一連のクロマトグラフィー材料（固体緩衝剤とイオン交換樹脂との混合物）が順番に配列される。異なるタンパク質は異なるｐＨレベルで荷電するので、系列内の各クロマトグラフィー材料のイオン交換樹脂は、混合物中のタンパク質の部分集合を捕捉する。このようにして血清、尿、ＣＳＦ、ならびに可溶性組織抽出物などの生体液からのタンパク質をそれらの等電点の関数として分離できる。

１．クロマトグラフィー材料
本発明のクロマトグラフィー材料は、イオン交換樹脂と組み合わさった固体緩衝剤を含む。好ましい実施形態では、これらのそれぞれが固相に付着する。特に、本発明は、イオン交換樹脂と混合された固体緩衝剤ビーズまたは粒子を含む組成物を考察する。別の実施形態では、固体緩衝剤およびイオン交換樹脂は、固相に付着していない。別の実施形態では、緩衝およびイオン交換特性は同一粒子内で結びついている。

１．１ 固体緩衝剤
用語「固体緩衝剤」とは、それぞれが異なるｐＫを有する、イオン化できるモノマーから得られる両性、架橋、不溶性の高分子を意味する。固体緩衝剤は、希釈電解質の水溶液に所定のｐＨを与え、それは酸性またはアルカリ性分子が添加されるとｐＨを維持する。これらの物理化学的特性に加えて、この文献で有用な固体緩衝剤は小孔を含み、材料に例えば５０００Ｄａよりも低い低排除限界を与える。

低排除限界は、小型イオンの完全な拡散を維持しながら、架橋モノマー内部にタンパク質が拡散するのを防止する。このような限定的拡散は、固体緩衝剤の非特異的結合の危険性を最小化する。いくつかの実施形態では、固体緩衝剤は５０００Ｄａ、４０００Ｄａ、または３０００Ｄａよりも低い排除限界を含んでなる。小孔がある両性高分子は、比較的濃縮されたモノマー溶液および／または高度架橋モノマーを使用して発生させることができる。

一の態様では、固体緩衝剤はポリマーであることができる。例えば固体緩衝剤は、ポリアクリルアミドまたはブロックコポリマーであることができる。別の例では、固体緩衝剤は、所定のｐＨ近辺の緩衝力に到達するように異なるｐＫのアクリルアミドモノマーを組み合わせて製造できる。

固体緩衝剤は、ポリマー化学および生化学の技術分野で使用される日常的化学物質および方法を使用して調製できる。一般に、特定ｐＨのための固体緩衝を剤作り出すために、数ｍＭから数百ｍＭの範囲に及ぶことができる濃度において対応するｐＫを有するモノマーが選択され、相補的モノマーによってそのｐＫに近いか、または同一のｐＨに滴定される（例えば、選択されるモノマーが８．０のｐＫを有する場合、それはｐＫが４．５よりも低いモノマーを使用して８．０に近いｐＨに滴定される）。所望のｐＫのモノマーが入手できなければ、モノマー混合物（所望のｐＫを上回るｐＫ、およびそれ未満のｐＫ）を使用でき、２つのｐＫ間のｐＨへの滴定がそれに続く。次にｐＨ調節済みモノマー溶液に、適切な架橋試薬および重合触媒を、重合を引き起すのに十分な比率で添加して、固体緩衝剤粒子を発生させる。

多様なモノマーは市販される。例示的モノマーとしては、Ｎ−アクリロイルグリシン、４−アクリルアミド酪酸、２−モルホリノエチルアクリルアミド、３−モルホリノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリルアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドが挙げられるが、これに限定されるものではない。

イモビラインもまた使用して、固体緩衝剤を作成できる。イモビラインは、一般式、

（式中、
Ｒは特徴的なｐＩを提供する基を含む）に従うアクリルアミド誘導体である。例えば、米国特許第４，９７１，６７０号明細書を参照されたい。この特性決定は原則として多くの分子を包含するが、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）は、特に等電位ゲルおよびポリマーを作り出すのに適したイモビライン（ＩＭＭＯＢＩＬＩＮＥ）（登録商標）の下に市販される分子を製造する。イモビライン（ＩＭＭＯＢＩＬＩＮＥ）（登録商標）コレクションの分子としては、括弧内に示すｐＩを有する以下が含まれる。Ｎ−アクリロイルグリシン（ｐＫ３．６）、４−アクリルアミド酪酸（ｐＫ４．６）、２−モルホリノエチル−アクリルアミド（ｐＫ６．２）、３−モルホリノプロピルアクリルアミド（ｐＫ７．０）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−エチルアクリルアミド（ｐＫ８．５）、およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（ｐＫ９．３）（ひとまとめにして「イモビライン」）。あらゆるイモビラインをモノマーとして組み合わせることができ、アクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドまたは別の適切な架橋剤と共重合させて、所望のｐＩ特異的ポリマーを生成できる。アクリルアミドは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、メチルアクリルアミド、メチロールアクリルアミドジメチルアクリルアミド、ジエチルアクリルアミド、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアクリルアミドなどのその他の非イオン性アクリルアミド誘導体で置換できる。

モノマーの組み合わせおよび濃度の選択を助けて、特定ｐＨの固体緩衝剤を製造するための多様な資源を利用できる。例えばリゲッティ（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ）、ストヤノフ（Ｓｔｏｙａｎｏｖ）、およびジューコフ（Ｚｈｕｋｏｖ）編、「クロマトグラフィー・ライブラリー・ジャーナル（ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＩＣ ＬＩＢＲＡＲＹ）」、第６３巻、１２章、２００１年、でモノマーの組み合わせの配合表が提供される。アマーシャム・バイオサイエンシズ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）は、その「プロトコルガイド＃１：タンパク質のイソプライム精製のための等電膜配合（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｇｕｉｄｅ ＃１：Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｏｒｍｕｌａｓ ｆｏｒ ＩｓｏＰｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」で、同様の配合表を提供する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ４．ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ａｐｔｒｉｘ／ｕｐｐ００９１９．ｎｓｆ／（ＦｉｌｅＤｏｗｎｌｏａｄ）？ＯｐｅｎＡｇｅｎｔ＆ｄｏｃｉｄ＝ＦＤ３３０２０８８ＢＤ３７ＢＣ６Ｃ１２５６ＥＢ４００４１７Ｅ５Ｃ＆ｆｉｌｅ＝８０６３５０１８．ｐｄｆを参照されたい。

モノマー濃度の選択のためのアルゴリズムもまた利用できる。例えばジャフレーダ（Ｇｉａｆｆｒｅｄａ）ら著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．」６３０：３１３〜３２７頁、１９９３年を参照されたい。さらにポリマーのｐＩを判定する技術については、当該技術分野でよく知られている。このような方法の例としては、リベイロ（Ｒｉｂｅｉｒｏ）ら著、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」２０：２３５〜４２頁、１９９０年、リベイロ（Ｒｉｂｅｉｒｏ）ら著、上記引用文、２１：１３１〜４１頁、１９９１年、およびシレロ（Ｓｉｌｌｅｒｏ）ら著、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７９：３１９〜２５頁、１９８９年、が挙げられる。

一の実施形態では、参照によって本明細書に援用する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００７７６２号明細書で述べられる粒子を固体緩衝剤として使用できる。

別の実施形態では、固体緩衝剤が固体担体腔内で重合される。その他の実施形態では、固体緩衝剤は、粒子中の腔の内部孔容量により形成される内外面などの固体担体の内外面に付着される。付着は、化学結合またはその他の手段によることができる。

アミノ酸およびペプチドは確定等電点を有するので、このような表層を提供できる。したがっていくつかの実施形態では、固体緩衝剤は２つ以上のアミノ酸を含んでなる。アミノ酸は、２０の天然アミノ酸のいずれかであることができ、またはアミノ酸は合成アミノ酸であることができる。有用なアミノ酸としては、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、システイン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンをはじめとする、２０の天然アミノ酸の中でイオン化できる側鎖を有するものが挙げられる。さらに確定ｐＩ値を有し、上述のように粒子内外面に付着できるその他の化合物が、本発明で使用できることも当業者によって理解される。リンカーを使用して、粒子表面に付着部位を提供できる。

一般に固体緩衝剤は、それ自体がタンパク質を吸着できてはならず、イオン交換体と同一濃度を有し、所望のｐＨで良好な緩衝能を有するべきである。

１．２ 固体担体
用語「固体担体」とは、そこにイオン交換ポリマーまたは固体緩衝剤が付着または装入されて、低濃度下でのポリマー崩壊を防止できる固体多孔性材料を意味する。

クロマトグラフィー材料は、多様な固体担体を利用できる。この文脈中での例示的な固体担体は、粒子、膜、およびモノリスである。「モノリス」とは、一般に、多孔性の単一材料片であり、それにクロマトグラフィーのリガンドを付着できる。一般にモノリスは、例えば１ｃｍ^３のモノリスあたり０．５ｍＬを超えるような、ビーズよりも明らかに大きな容積を有する。

一の実施形態では、固体担体は、表面から内側に延びる複数の腔を有する実質的に多孔性の粒子を含む。粒子は、好ましくは分離する生物学的抽出物に適合する大きさ、機械的強度、および浮揚性を有する。一の実施形態では、粒子は、シリカ、チタニア、ジルコニア、ハフニア、アルミナ、ガリア、スカンジア、イットリウム、酸化アクチニドなどの１つ以上のミネラル酸化物、または希土類ミネラル酸化物を含む。

固体緩衝剤のための固体担体として多孔性粒子を用いる場合、比較的大きな粒子を使用して、粒子容積と比べて外面積を最小化でき、それによってタンパク質の非特異結合の危険性を低下できる。いくつかの実施形態では、粒子は約５０μｍを超え、または約１００μｍを超え、または約２００μｍを超える直径を有する。一例では、約１５０μｍの粒子が固体緩衝剤のための固体担体として使用される。粒子の孔容量は、総粒子容積の１０〜７０％の範囲であることができる。

あるいは、多孔性可塑性ビーズが、固体担体の役割を果たすことができる。ポリスチレンは、クロマトグラフィーのための孔を有するビーズに形成できるよく知られているポリマーである。例えば、メチルメタクリル酸などのアクリル樹脂ベースのもの、ならびに多孔性ナイロン、多孔性ポリビニルプラスチック、およびポリカーボネートなどのその他の合成ポリマーもまた使用できる。多孔性粒子体の追加的例は、それぞれ参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，６１３，２３４号明細書、米国特許第５，４７０，４６３号明細書、米国特許第５，３９３，４３０号明細書、および米国特許第５，４４５，７３２号明細書で述べられる

２．イオン交換樹脂
イオン交換クロマトグラフィーは、それらの正味電荷に基づいて化合物を分離する。負にまたは正に帯電した官能基は、固体担体マトリックスに共有結合して、それぞれカチオンまたはアニオン交換体のどちらかを生じる。荷電した化合物が反対に荷電した交換体に適用されると、それは吸着される一方、中性のまたは同一電荷を有する化合物は、カラムのボイド容量内に溶出する。荷電化合物の結合は可逆的であり、吸着された化合物は一般に、塩またはｐＨ勾配により溶出される。

用語「イオン交換樹脂」とは、正または負の符号で、単一群のイオン性基を保有する、固体多孔性網目状組織（ミネラルまたは有機または複合材）を指す。正に帯電したイオン群（アニオン交換体）は、例えば四級、三級、および二級アミンおよびピリジン誘導体である。負に帯電したイオン群（カチオン交換体）は、例えばスルホネート、カルボキシレート、およびホスフェートである。

イオン交換樹脂の選択は、分離する化合物の特性に左右される。両性化合物では、化合物のｐＩと様々なｐＨ値におけるその安定性が分離ストラテジーを決定する。そのｐＩを超えるｐＨでは、関心のある化合物は負に帯電し、そのｐＩ未満のｐＨでは化合物は正に帯電する。したがって化合物がそのｐＩを超えるｐＨで安定している場合、陰イオン交換樹脂が使用される。反対にそのｐＩ未満のｐＨで化合物が安定している場合、カチオン交換樹脂が使用される。稼働ｐＨもまた、使用する交換体タイプを決定する。強イオン交換樹脂は、広範なｐＨ範囲にわたり能力を維持するのに対し、弱イオンのものは、ｐＨがその官能基のｐＫ_ａと一致しなくなると能力を失う。

アニオン交換体は、弱いか、または強いかのどちらかに分類できる。弱アニオン交換体上の荷電群は弱塩基であり、それは高ｐＨで脱プロトン化され、したがってその電荷を失う。ＤＥＡＥ−セルロースが弱アニオン交換体の例であり、アミノ基はｐＨ約９未満で正に帯電でき、より高いｐＨ値ではその電荷を徐々に失う。一方、強アニオン交換体は四級アミンなどの強塩基を含有し、それはイオン交換クロマトグラフィーで通常使用されるｐＨ範囲（ｐＨ２〜１２）全体を通じて、正に帯電したままである。

カチオン交換体もまた、弱いか、または強いかのどちらかに分類できる。強カチオン交換体は強酸（スルホプロピル基など）を含有して、ｐＨ１〜１４で荷電したままであるのに対し、弱カチオン交換体は、弱酸（カルボキシメチル基など）を含有し、ｐＨが４または４．５未満に低下するに従ってその電荷を徐々に失う。

本発明の一の実施形態では、四級アミンまたはスルホン酸などの強イオン交換体が使用される。三級アミンおよびカルボン酸などの弱イオン交換体もまた、例えば５〜８の間のｐＩを有するタンパク質を分離する場合に使用できる。

表１は一般的なイオン交換体の一覧を提供する。

イオン交換樹脂は、当該技術分野でよく知られている。本発明で有用な市販されるイオン交換体としては、ＱハイパーＤ、ＳハイパーＤ、Ｑセファロース、Ｓセファロース、ＱハイパーＺ、およびＣＭハイパーＺが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの樹脂は固体緩衝剤ビーズと混合して、例えば、本発明のクロマトグラフィー材料を製造できる。

クロマトグラフィー材料は、５％〜９５％の一定容積のイオン交換体を含むことができ、残部は固体緩衝剤である。

３．クロマトグラフィー材料の使用
混合物からタンパク質をそれらのｐＩに基づいて分離するのに有用なクロマトグラフィー材料は、固体緩衝剤とイオン交換樹脂とを組み合わせて製造できる。一の実施形態では、それぞれ異なる固体担体に付着する固体緩衝剤とイオン交換樹脂とを組み合わせて、混合物を形成する。一の態様では混合物は混合粒子床である。

別の実施形態では、クロマトグラフィー材料は、膜またはモノリスなどの単一固体担体に付着する固体緩衝剤とイオン交換樹脂とを含む。別の例では、単一粒子上でイオン交換樹脂と固体緩衝剤とを組み合わせる。この実施形態では、粒子に付着する固体緩衝剤を最初に調製し、次に固体緩衝剤上にイオン交換特性と大型孔を持つポリマーを形成する。

本発明のクロマトグラフィー材料を通過するタンパク質は、それらのｐＩが、それぞれ、固体緩衝剤により発生するｐＨ未満か、それを上回るか、またはそれと同一かどうかにより、正味正電荷または正味負電荷のどちらかを有し、または中性である。環境ｐＨにおいてその電荷がイオン交換樹脂と反対のタンパク質がイオン交換体に結合するのに対し、中性または同一電荷のタンパク質は非結合のままであり、クロマトグラフィー材料を通過する。すなわち、例えば固体緩衝剤のｐＨで負に帯電したタンパク質は、それがアニオン交換体であればイオン交換樹脂に結合する。次に捕捉されたタンパク質が、クロマトグラフィー材料から溶出できる。したがって、本発明のクロマトグラフィー材料は、ｐＩに基づいてタンパク質分離するのに有用である。

別の実施形態では、タンパク質は、一連のクロマトグラフィー材料を使用して、それらの各ｐＩに基づいて混合物から分離される。異なるクロマトグラフィー材料を含む多段階カラム中で、不連続のｐＨ勾配を発生させる。このようなカラムを通過する混合物中のタンパク質は、カラム内のそれらの位置に従って様々にイオン化するようになる。タンパク質がイオン交換樹脂と反対の電荷を得ると、それはそれに結合する。このようにしてカラム内を通過する混合物はそれがカラムの異なるセクションを横切る際に、１つのタンパク質カテゴリーが枯渇する。

したがって、本発明の装置は、それぞれ（最上部から底部へ）ｐＨ９、７、および５の固体緩衝剤を含む一連のクロマトグラフィー材料、およびカチオン交換体を含むことができる。最初に、生物学的抽出物サンプルを、ｐＨ９の固体緩衝剤を保持する容器に適用する。ｐＨ９を上回るｐＩを有するタンパク質はこの環境では正に帯電するので、クロマトグラフィー材料のイオン交換体部分に結合する。ほとんどの生物学的抽出物中では、これはタンパク質種の少数派に相当する。中性または負に帯電したタンパク質は結合せず、容器から溶出する。次にこの溶出液をｐＨ７の固体緩衝剤を保持する容器に装入する。このｐＨでは、７を上回るｐＩを有するタンパク質は正に帯電し、イオン交換体に結合する。中性および正に帯電したタンパク質は結合せず、クロマトグラフィー材料を保持する容器から溶出する。したがってクロマトグラフィー材料のこのセクションは、７〜９の間のｐＩを有する捕捉タンパク質を有し、９を上回るｐＩを有するタンパク質はクロマトグラフィー材料の第１のセクション上に既に捕捉されている。次に、この第２の溶出液を固体緩衝剤がｐＨ５のクロマトグラフィー材料を保持する第３の容器に装入する。上述と同様の機序に従って、ｐＩが５〜７の間のタンパク質はカチオン交換体によって捕捉され、ｐＩが５以下のタンパク質は捕捉されずに溶出液中に見出される。その後、従来の手段に従って、様々な容器から結合タンパク質が溶出できる。したがって、タンパク質は、ｐＩに従って、９を上回るｐＩ、７〜９の間のｐＩ、５〜７の間のｐＩ、５未満のｐＩを有する画分に分画される。同様にして、ｐＨが増大する固体緩衝剤から構成されるクロマトグラフィー材料を使用して、カチオン交換クロマトグラフィーによってタンパク質を分画できる。

一の態様では、系列は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の異なるクロマトグラフィー材料を含むことができる。上述のように、クロマトグラフィー材料は、それぞれ、アニオン交換体またはカチオン交換体が使用されるかどうかによって、ｐＨが増大するか、または低下する順に配列される。

クロマトグラフィー吸着材に装入するための溶液を調製するにあたり、例えば塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどの単純塩のような電解質が使用できる。しかし、生体分子は電解質として機能できるので、純水も使用できる。また、調節剤も混合物に添加してタンパク質凝集を防止できる。このような調節剤の例としては、尿素または非イオン性洗剤などのグリコールおよび非イオン性カオトロピック剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。

結合タンパク質は、イオン交換樹脂からタンパク質を溶出できるあらゆる化学成分を使用して脱離できる。最も一般には、塩溶液を使用してタンパク質を脱離する。しかし、また、ｐＨ変化も使用でき、ならびに置換剤も使用できる。

別の実施形態では、一連の容器を含む装置が提供され、系列内の第１の容器は流体入り口を含み、系列内の最後の容器は流体出口を含み、系列内の各容器は系列内の次の容器と流体連通しており、系列内の各容器は異なるクロマトグラフィー材料を含み、容器はクロマトグラフィー材料のｐＨに従って増大するか、または低下する順に配列される。

一の実施形態では、クロマトグラフィー材料は、入り口および出口を有するカートリッジまたは容器セグメントに含有される。セグメントは互いに積み重ね可能であり、脱着可能である。セグメントはそれぞれ異なるクロマトグラフィー材料を含有する。それらはクロマトグラフィー材料を定位置に保持するフィルターまたは膜を含有できる。端と端とを付着すると、セグメントはその中に溶液を注入できるカラムを作り出す。流体が全てのセグメント通過した後、セグメントを互いに脱着して、各セグメントから捕捉されたタンパク質を溶出できる。例えば、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）らに付与された国際公開第０３／０３６３０４号パンフレットを参照されたい。

別の例では、容器は、マルチウェルフロープレートのウェルであり、系列内の各容器は脱着式導管によって連接する（図１）。一の態様では、プレートはドリッププレートまたはフィルタープレートなどのマイクロタイタープレートであることができる。しかし、その他の実施形態では、プレートは、部品のどちらかの側に開口して導管が穿孔開口分に付着する場合にチャンバーを画定する、穿孔などの溝を含んでなる部品を含むことができる。好ましくは、チャンバーは実質的に平面に配列される。例示的な装置については、参照によって本明細書に援用する米国仮特許出願第６０／６８４１７７号明細書で述べられる。

マルチウェルフロープレート中では、チャンバーおよび導管の組み合わせが流体経路を画定し、それによって流体をチャンバーからチャンバーに汲み上げることができる。系列内の各チャンバーは、複雑なサンプル中の分析物の異なる部分集合を捕捉できる、異なるクロマトグラフィー材料を含む。この装置の特有の有用性は、導管が脱着式であるのでクロマトグラフィー材料によって捕捉された分析物が、例えば分析物をチャンバーから溶出することで単離できることである。ひとたび単離されると、分析物はあらゆる利用できる方法によって検出または分析できる。

このような実施形態の一例では、流体は（例えば、縦列または横列）系列内の１つのチャンバーを通じて下向きに、系列内の次のチャンバーを通じて上向きに、系列内の次のチャンバーを通じて下向きに、系列内の次のチャンバーを通じて上向きにと、交互に押し出される。より具体的には、系列内の第１のチャンバー底部開口部（例えば、縦列または横列）は、系列内の第２のチャンバー底部開口部と連接してもよい。第２のチャンバーの最上部開口部は、その横列（または縦列）内の第３のチャンバーの最上部開口部と連接してもよい。連接する底部から底部および最上部から最上部の配列は、第１のチャンバーの最上部から底部、次に第２のチャンバーの底部から最上部、次に第３のチャンバーの最上部から底部などを移動する流路を発生させる。

別の例では、流体は、系列内の各チャンバーを通じて下向きに押し出される。より具体的には、縦列（または横列）内の第１のチャンバーの底部開口部は、その縦列（または横列）内の第２のチャンバーの最上部開口部と連接してもよい。第２のチャンバーの底部開口部は、その横列（または縦列）内の第３のチャンバーの最上部開口部と連接してもよい。連接する底部から最上部の配列は、第１のチャンバーの最上部から底部、第２のチャンバー最上部から底部、第３のチャンバーの最上部から底部などを移動する流路を発生させる。

さらにここで述べられる材料、方法、および装置を追加的材料および装置と組み合わせて使用して、分離タンパク質に関する追加的分析的情報を提供できる。例えば分離タンパク質に、さらなる分離または、例えばＳＥＬＤＩによるゲル電気泳動法または質量分析法による分析のどちらかを実施できる。このようにして分離タンパク質を効果的に同定できる。

ここで述べられる実施例および実施形態はあくまでも例示を目的とし、それを踏まえた様々な修正または変更が当業者に提案されて、本出願の精神と範囲および添付の特許請求の範囲内に含まれるものと理解される。

実施例１．ｐＨ８．５の固体緩衝剤の調製
５０ｍＬの水中にｐＫ８．５を有する１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチル−アミノプロピル−アクリルアミドを溶解して（これは１４２０ｍｇの遊離塩基である）、ｐＨ８．５の固相緩衝剤を調製できる。ｐＫ３．１のモノマーアクリルアミドグリコール酸（遊離酸）の緩慢な添加によって、溶液をｐＨ８．５に滴定する。次に３０ｇのアクリルアミドおよび２ｇのメチレン−ビス−アクリルアミドを溶液に添加する。次に、溶液の容積を１００ｍＬにする。この最終溶液に、例えば過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤなどの重合触媒を添加する。次に、溶液を使用して、例えば多孔性粒子を含浸させる。ひとたびヒドロゲルが重合したら材料粒子の孔を洗浄し、副産物および過剰な試薬を除去する。固相緩衝剤は２０％エタノールの存在下で保存できる。

実施例２．ｐＨ４．６の固体緩衝剤の調製
１Ｌの蒸留水に１００ｍＭのＮ−アクリロイルグリシン（ｐＫ４．６）を溶解して、ｐＨ４．６の固相緩衝剤を調製できる。次に、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアミノエチルアクリルアミドの濃縮溶液（５０％水溶液）を添加して、溶液をｐＨ４．６に滴定する。得られた溶液に２００ｇのアクリルアミドおよび１０ｇのＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドを添加する。混合物を撹拌して完全に可溶化する。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムから構成される触媒作用系を使用直前に溶液に添加する。３８ｍＬの最終溶液を１００ｍＬの約７５μＭの多孔性ジルコニアビーズ（１００ｇあたり３８ｍＬの孔容量）に添加して混合し、溶液をミネラルビーズの孔容量内に完全に吸収させる。次に窒素導入を交互に繰り返して、含浸ビーズを真空下で３回脱気する。次に、モノマーの重合まで、混合物を室温において窒素存在下で保存する。得られた固体緩衝剤を水、同一ｐＨの緩衝剤（例えばｐＨ４．６の酢酸緩衝剤）、最後に水で徹底的に洗浄する。次に、固体緩衝剤は、イオン交換体の存在下で使用する準備ができる。

実施例３．ｐＨ９．３の固体緩衝剤の調製
１Ｌの蒸留水に１００ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（ｐＫ９．３）を溶解して、ｐＨ９．３の固体緩衝剤を調製できる。次に、アクリル酸の濃縮溶液（５０％水溶液）を添加して、溶液をｐＨ９．３に滴定する。得られた溶液に２００ｇのジメチルアクリルアミドおよび１０ｇのＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドを添加する。得られた混合物を撹拌して完全に可溶化する。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムから構成される触媒作用系を使用直前に添加する。３８ｍＬの最終溶液を１００ｍＬの約７５μＭの多孔性ジルコニアビーズ（１００ｇあたり３８ｍＬの孔容量）に添加して混合し、溶液をビーズの孔容量内に完全に吸収させる。次に窒素導入を交互に繰り返して、含浸ビーズを真空下で３回脱気する。次にモノマーの重合まで、混合物を室温において窒素存在下で保存する。得られた物質を水で、同一ｐＨの緩衝剤（例えばｐＨ９．のトリス−ＨＣｌ緩衝剤）で、そして再度水で徹底的に洗浄する。次に固体緩衝剤は、イオン交換体の存在下で使用する準備ができる。

実施例４．ｐＨ７．７の固体緩衝剤の調製
１Ｌの蒸留水に５０ｍＭの３−モルホリノプロピルアクリルアミド（ｐＫ７．０）および５０ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリルアミド（ｐＫ８．５）を溶解して、ｐＨ９．３の固体緩衝剤を調製できる。次に、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の濃縮溶液（５０％水溶液）を添加して、溶液をｐＨ７．７に滴定する。得られた溶液に２００ｇのアクリルアミドおよび１０ｇのＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドを添加して、得られた混合物を撹拌して完全に可溶化する。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムから構成される触媒作用系を使用直前に添加する。３８ｍＬの最終溶液を１００ｍＬの約７５μＭの多孔性ジルコニアビーズ（１００ｇあたり３８ｍＬの孔容量）に添加して混合し、溶液をビーズの孔容量内に完全に吸収させる。次に、窒素導入を交互に繰り返して、含浸ビーズを真空下で３回脱気する。次に、モノマーの重合まで、混合物を室温において窒素存在下で保存する。得られた物質を水で、同一ｐＨの緩衝剤（例えばｐＨ７．７のモルホリン−ＨＣｌ緩衝剤）で、そして再度水で徹底的に洗浄する。次に、固体緩衝剤は、イオン交換体の存在下で使用する準備ができる。

実施例５．混合モードクロマトグラフィー材料（ｐＨ４．６の固体緩衝剤と、カチオン交換体）の調製
１Ｌの蒸留水に１５０ｍＭのＮ−アクリロイルグリシン（ｐＫ４．６）および１０ｍＭのＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドを溶解して、ｐＨ４．６の固体緩衝剤を調製できる。次にＮ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアミノエチルアクリルアミドの濃縮溶液（５０％水溶液）を添加して、溶液をｐＨ４．６に滴定する。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムから構成される触媒作用系を使用直前に添加する。

別に、５％の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム塩、５％のジメチルアクリルアミド、および１％の ｍＭＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドから構成される第２の水溶液を調製する。次に塩基または酸の添加によって、この溶液のｐＨを４．６に調節する。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムから構成される触媒作用系を使用直前に添加する。

１００ｍＬの約７５μＭの多孔性ジルコニアビーズ（１００ｇあたりの孔容量４０ｍＬ）を２０ｍＬの第１のモノマー溶液と混合し、次に重合まで先の例で述べるように処理する。この中間生成物を水、同一ｐＨの緩衝剤（例えば、ｐＨ４．６の酢酸緩衝剤）、最後に水で徹底的に洗浄する。次に例えば乾燥エタノールおよびアセトンでの反復洗浄を使用して、洗浄した生成物を乾燥させる。

次に、中間乾燥生成物を２０ｍＬの第２のモノマー溶液と混合する（ミネラルビーズの全孔容量を満たす）。次に上記のように第２の重合工程を開始させる。最終クロマトグラフィー材料を水、ｐＨ４．６の酢酸緩衝剤、および蒸留水で徹底的に洗浄する。

実施例６．ｐＨ６．５の固体緩衝剤の調製
１Ｌの蒸留水に１５０ｍＭの３−モルホリノプロピルアクリルアミド（ｐＫ７．０）を溶解して、ｐＨ６．５の固体緩衝剤を調製できる。次に、Ｎ−アクリロイルグリシン（ｐＫ３．６）の濃縮溶液（５０％水溶液）を添加して、溶液をｐＨ６．５に滴定する。得られた溶液に４００ｇのアクリルアミドおよび３０ｇのＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドを添加して、得られた混合物を撹拌して完全に可溶化する。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムから構成される触媒作用系を使用直前に添加する。この溶液１００ｍＬを３％のアラセルＣ（油溶性乳化剤）を含有する５００ｍＬのパラフィン油に分散する。懸濁液を撹拌しながら６５℃で３時間保持して、モノマーを共重合させる。重合中に形成されたヒドロゲルビーズを濾過して収集し、非極性溶剤で徹底的に洗浄して痕跡量のパラフィン油を排除する。次に、ビーズを水、同一ｐＨの緩衝剤、最後に水で徹底的に洗浄する。次に、固体緩衝剤は、イオン交換体の存在下で使用する準備ができる。

実施例７．ｐＨ９．０の固体緩衝剤の調製
１Ｌの蒸留水に１５０ｍＭのＮ，Ｎ，Ｎ−トリエチル−アミノエチル−アクリルアミド（ｐＫ１２）を溶解して、ｐＨ６．５の固体緩衝剤を調製できる。次に、アクリルアミドグリコール酸（ｐＫ３．１）の濃縮溶液（５０％水溶液）を添加して、溶液をｐＨ９．０に滴定する。得られた溶液に３００ｇのジメチル−アクリルアミドおよび２０ｇのＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドを添加して、得られた混合物を撹拌して完全に可溶化する。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムから構成される触媒作用系を使用直前に添加する。次に、溶液を窒素下で６５℃の温浴に入れる。５時間後、完全なヒドロゲルブロック下で重合が完結する。ヒドロゲルを小片に切断し、磨砕して約１００μｍの粒子を得る。次に、微粒子生成物を水、次に同一ｐＨの緩衝剤、最後に水で徹底的に洗浄する。次に、固体緩衝剤は、イオン交換体の存在下で使用する準備ができる。

実施例８．３つの異なる固体緩衝剤と混合されたアニオン交換体を使用したｐＩに基づくタンパク質の分離
一連の３つのクロマトグラフィー材料を一連の（前のカラム出口から続くカラム入り口に）相互連接する区分カラムにアセンブルする。各クロマトグラフィー材料は同一アニオン交換体（ＱハイパーＺ吸着剤）を含むが、それぞれ異なるｐＨ、特に５．４、７．７、および９．５の異なる固体緩衝剤を含む。クロマトグラフィーの区分カラムはｐＨが増大する順に配列され、すなわち第１の区分カラムはｐＨ５．４を有し、最後の吸着材はｐＨ９．５を有する。

Ｑアニオン性吸着剤は、固相緩衝剤によって誘発される全てのｐＨ範囲（５．４〜９．５）で正に帯電する。

１０ｍＭ塩化カリウム中で、５つのタンパク質（リゾチーム（ｐＩ１１）、チトクロームｃ（ｐＩ９．０）、ミオグロビン（ｐＩ７．０）、ヒトアルブミン（ｐＩ６．０）、およびフェチュイン（ｐＩ≦５．０））を含有するサンプルを調製する。タンパク質とタンパク質との相互作用を避けるために、２Ｍの尿素を添加する。次にサンプルをカラムに装入する。

第１のクロマトグラフィー材料では、ｐＨ５．４で負に帯電する唯一のタンパク質であることから、フェチュインのみが吸着される。残る４つのタンパク質は、第２のクロマトグラフィー材料に進む。

第２のクロマトグラフィー材料では、ｐＨ５．４．でアルブミンおよびミオグロビンの双方が負に帯電する。したがってそれらはアニオン交換体によって捕捉される。

第３のクロマトグラフィー材料では、サンプル中に残るｐＨ９．５で負に帯電する唯一のタンパク質であることから、チトクロームＣのみが吸着される。

リゾチームはｐＨ９．５で正味正電荷を有する。したがってそれは通過物と共にカラムを出る。

ひとたび吸着段階が終了すると、クロマトグラフィー材料を分離して別々に処理し、タンパク質を脱離する。１Ｍ塩化カリウムを使用して、結合タンパク質を脱離する。

実施例９．３つの異なる固体緩衝剤と混合されたカチオン交換体を使用したｐＩに基づくタンパク質の分離
一連の３つのクロマトグラフィー材料を一連の（前のカラム出口から続くカラム入り口に）相互連接する区分カラムにアセンブルする。各クロマトグラフィー材料は同一カチオン交換体を含むが、それぞれ異なるｐＨ、具体的には５．４、７．７、および９．５の異なる固体緩衝剤を含む。クロマトグラフィーの区分カラムはｐＨが減少する順に配列され、すなわち第１の区分カラムはｐＨ９．５を有し、最後の吸着材はｐＨ５．４を有する。

カチオン交換体は、固相緩衝剤によって誘発される全てのｐＨ範囲（５．４〜９．５）で負に帯電する。

１０ｍＭ塩化カリウム中で、５つのタンパク質（リゾチーム（ｐＩ１１）、チトクロームｃ（ｐＩ９．０）、ミオグロビン（ｐＩ７．０）、ヒトアルブミン（ｐＩ６．０）、およびフェチュイン（ｐＩ≦５．０））を含有するサンプルを調製する。タンパク質とタンパク質との相互作用を防止するために、２Ｍの尿素を添加する。次にサンプルをカラムに装入する。

第１のクロマトグラフィー材料では、ｐＨ９．５で負に帯電する唯一のタンパク質であることから、リゾチームのみが吸着される。残る４つのタンパク質は、第２のクロマトグラフィー材料に進む。

第２のクロマトグラフィー材料では、サンプル中に残るｐＨ７．７で負に帯電する唯一のタンパク質であることから、チトクロームＣのみが吸着される。残るタンパク質は、第３のクロマトグラフィー材料に進む。

第３のクロマトグラフィー材料では、アルブミンおよびミオグロビンの双方がｐＨ５．４で負に帯電する。したがってこれらのタンパク質はアニオン交換体によって捕捉される。

フェチュインは、ｐＨ５．４で正味正電荷を有する。したがってフェチュインは、通過物と共にカラムを出る。

ひとたび吸着段階が終了すると、クロマトグラフィー材料を分離して別々に処理し、タンパク質を脱離する。１Ｍ塩化カリウムを使用して結合タンパク質を脱離する。

ここで述べられる実施例および実施形態はあくまでも例示を目的とし、それを踏まえた様々な修正または変更が当業者に提案されて、本出願の精神と範囲および添付の特許請求の範囲内に含まれるものと理解される。ここで引用する全ての公報、特許、および特許出願は、あらゆる目的のためにその全体を参照によって本明細書に援用する。

図面の簡単な説明
タンパク質を分離するためのマルチウェル装置の概略図を提供する。

Claims (19)

1. （Ａ）固体緩衝剤と、（Ｂ）イオン交換樹脂と、を含むクロマトグラフィー材料。
2. 前記固体緩衝剤および前記イオン交換樹脂が、異なる固体担体に付着する、請求項１に記載のクロマトグラフィー材料。
3. 前記固体緩衝剤および前記イオン交換樹脂が、固体担体に付着していない、請求項１に記載のクロマトグラフィー材料。
4. 前記固体緩衝剤および前記イオン交換樹脂が、単一固体担体に付着する、請求項１に記載のクロマトグラフィー材料。
5. 前記固体担体が粒子である、請求項２に記載のクロマトグラフィー材料。
6. 前記固体緩衝剤が５，０００Ｄａよりも低い排除限界を有して、約５０μｍを超える粒子に付着する、請求項２に記載のクロマトグラフィー材料。
7. 前記固体緩衝剤が、３，０００Ｄａの排除限界を有して、約１５０μｍの粒子に付着する、請求項２に記載のクロマトグラフィー材料。
8. 前記固体担体が、粒子、膜またはモノリスである、請求項２に記載のクロマトグラフィー材料。
9. 前記固体緩衝剤が、異なるｐＫのモノマーから得られた架橋ポリマーを含む、請求項１に記載のクロマトグラフィー材料。
10. 前記固相緩衝剤の前記固体担体が、表面から内側に延びる複数の空孔を有する実質的に多孔性の粒子を含む、請求項１に記載のクロマトグラフィー材料。
11. 前記イオン交換樹脂がアニオン交換体である、請求項１に記載のクロマトグラフィー材料。
12. 前記イオン交換樹脂がカチオン交換体である、請求項１に記載のクロマトグラフィー材料。
13. 一連の容器を含み装置であって、系列内の第１の容器が流体入り口を含み、系列内の最後の容器が流体出口を含み、系列内の各容器が系列内の次の容器と流体連通し、系列内の各容器が請求項１に記載の異なるクロマトグラフィー材料を含み、容器がクロマトグラフィー材料のｐＨに従って増大するか、または低下する順に配列される、装置。
14. 前記容器が複数ウェルフロープレートのウェルであり、系列内の各容器が脱着式導管によって連接する、請求項１３に記載の装置。
15. 前記容器が、積み重ねるとフローカラムを形成する積み重ね可能なカートリッジを含む、請求項１３に記載の装置。
16. 前記固体緩衝剤がｐＨ約１１以下の最高ｐＨを有し、前記固体緩衝剤がｐＨ約３以上の最低ｐＨを有する、請求項１３に記載の装置。
17. 前記イオン交換樹脂がアニオン交換体であり、前記容器がクロマトグラフィー材料のｐＨに従って増大する順に配列される、請求項１３に記載の装置。
18. 延期イオン交換樹脂がカチオン交換体であり、前記容器がクロマトグラフィー材料のｐＨに従って低下する順に配列される、請求項１３に記載の装置。
19. （Ａ）２つ以上のタンパク質の混合物を一連のクロマトグラフィー材料に適用するステップであって、各クロマトグラフィー材料が固体緩衝剤およびイオン交換樹脂を含み、クロマトグラフィー材料がクロマトグラフィー材料のｐＨに従って増大または低下する順に配列され、
    （Ｂ）系列内の最後のクロマトグラフィー材料から通過物を収集するステップと、次に
    （Ｃ）各クロマトグラフィー材料からタンパク質を別々に脱離させるステップと、を含む、等電点に基づいてタンパク質を分離する方法。

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