CN110988216B

CN110988216B - 白介素-12注射液纯度的检测方法

Info

Publication number: CN110988216B
Application number: CN201911409432.7A
Authority: CN
Inventors: 刘忠凯; 魏文; 王彦娜; 王媛媛
Original assignee: Kanglitai Biomedical Qingdao Co ltd
Current assignee: Kanglitai Biomedical Qingdao Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN110988216A

Abstract

本发明提出一种白介素‑12注射液纯度的检测方法，属于医学检验和药物分析领域。本发明提供的检测方法主要包括了待测样品制备、流动相配制、色谱检测等步骤，通过优化流动相配比、调整待测样品上样方式、调整检测时间、检测波长和柱温等条件，进一步提高了检测的专属性、检测限和耐用性，采用该方法也能得到精确度更高、更为可靠的检测数据。本发明提供的检测方法在医学检验和药物分析领域具有十分广阔的应用前景，具有较大的实际应用价值。

Description

白介素-12注射液纯度的检测方法

技术领域

本发明属于医学检验和药物分析领域，尤其涉及一种白介素-12注射液纯度的检测方法。

背景技术

白介素-12注射液是一种具有广泛生物学活性的细胞生长因子，属于生物药物。生物药物通常有稳定性差等的缺陷，因此其注射液的纯度是需要重点关注的质量指标之一。

反相高效液相色谱的固相载体具有疏水性，可以根据流动相中被分离物质疏水性的不同而发生强弱不同的相互作用，从而使不同分子在反相柱中彼此分离。但采用上述的反相高效液相色谱法测定人白介素-12的纯度时，存在检测的专属性、检测限、精密度等方面仍存在缺陷，尚未取得理想的研究成果，因此研究出一种专属性、检测限、精密度高的人白介素-12注射液纯度的检测方法是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明针对现有技术存在的专属性、检测限、精密度等方面的缺陷，提出一种适用于白介素-12的纯度检测方法，同时该方法还兼具精密度高、数据可靠等特点。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种白介素-12注射液纯度的检测方法，所述方法的流动相及色谱条件为：

流动相条件为：包括流动相A和流动相B，所述流动相A为0.05％的三氟乙酸水溶液，所述流动相B为0.05％的三氟乙酸乙腈溶液；

色谱条件为：色谱柱为YMC C4液相色谱柱，250mm×4.6mm I.D.S-5μm；

洗脱时间及所述洗脱时间内所述流动相B的体积含量如下：

0-5min，20％；5-25min，20～70％；25-26min，70～100％；26-35min，100～100％；35-35.5min，100～20％；35.5-40min，20～20％；

所述流动相A和流动相B的流速为0.9～1.1ml/min；

所述色谱柱的柱温为25-30℃；

检测波长为280-300nm。

作为优选，所述待测样品的浓度为6～20μg/ml，更优选地，所述待测样品的浓度优选为15μg/ml。

作为优选，所述待测样品的上样量为100～1000μl。

作为优选，所述流动相配置的方法具体为：

流动相A：用移液枪吸取三氟乙酸0.5mL至1L容量瓶中，加水定容后，静置处理后，上机检测，所述静置处理时长≥5min；

流动相B：用移液枪吸取三氟乙酸0.5mL至1L容量瓶中，加乙腈定容后，进行超声处理脱气，备用；

所述超声处理脱气时长为≥20min。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明提供的检测方法通过调整流动相配比、待测样品上样方式、检测时间、检测波长和柱温等条件，意料之外地发现提高了检测的专属性、检测限和耐用性，同时采用该检测方法进行纯度分析能取得精确、可靠的检测结果，在药物分析和检测领域具有十分广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的流动相A的色谱图；

图2为本发明实施例所提供的流动相B的色谱图；

图3为本发明实施例所提供的制剂Buffer的色谱图；

图4为本发明实施例所提供的降解杂质的色谱图；

图5为本发明实施例所提供的柱效与分离度的结果图；

图6-11为本发明实施例所提供的六次精密度验证实验的结果图；

图12为本发明实施例所提供的检测限实验的色谱图；

图13为本发明实施例所提供的定量限实验的色谱图；

图14-19为本发明实施例所提供的六次中间精密度验证实验的结果图；

图20-25为本发明实施例所提供的流速实验的色谱图；

图26-31为本发明实施例所提供的柱温实验的色谱图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种白介素-12注射液纯度的检测方法，所述方法的流动相及色谱条件为：

洗脱时间及所述洗脱时间内所述流动相B的体积含量如下：

所述流动相A和流动相B的流速为0.9～1.1ml/min；

所述色谱柱的柱温为25-30℃；

检测波长为280-300nm。

基于上述的检测方法，需要进一步说明的是，首先，选择反相色谱法进行白介素-12注射液纯度检测的原因在于：白介素-12是由α和β亚基通过链间二硫键组成的异二聚体，前期研究结果表明白介素-12与各亚基的极性大小顺序为β亚基＞白介素-12＞α亚基。利用其极性不同的特点，使用反相色谱进行分离，以检测白介素-12注射液的纯度。

其次，选择上述物质作为流动相的原因在于：乙腈是一种优良的非质子溶剂，能与水无限互溶，对柱压影响小，短波紫外吸收低，对本品干扰小且有良好的洗脱能力；加入浓度为0.05％三氟乙酸可以优化色谱峰峰型。在白介素-12蛋白分子的分离中，初始洗脱条件下洗脱液中有机成分浓度较低，分子与固定相疏水作用强，几乎完全被固定相吸附；一旦洗脱液中有机成分达到特定浓度，使得白介素-12与固定相的作用小于它与流动相间的相互作用时，分子完全从固定相上洗脱。

再次，选择上述洗脱条件是为了使得白介素-12蛋白能与杂质较快分离且峰型良好，需要先根据经验将B流动相梯度从20％线性变化至100％，然后再根据出峰情况选出最佳洗脱梯度。

最后，选择上述流速、柱温等条件的目的在于：为保证目的蛋白与杂质良好分离的前提下，快速高效的得到实验结果。具体可调范围在本发明实施例6中有详细说明。本发明提供的检测方法中由各个条件构成一个整体的系统，改变任何条件都可能导致其无法达到目的效果；其中，上述流动相A和流动相B的流速可选取0.9、1.0、1.1ml/min或上述限定范围内的任一数值，色谱柱的柱温可选取25、26、27、28、29、30℃或上述限定范围内的任一数值，检测波长可选取280、290、300nm或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内。

在一优选实施例中，所述待测样品的浓度为6～20μg/ml。

在上述优选实施例中，所述待测样品的浓度可选取6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/ml或上述范围内的任一数值，均落在本发明的保护范围之内。

在一优选实施例中，所述待测样品的浓度优选为15μg/ml。

在一优选实施例中，所述待测样品的上样量为100～1000μl。

在上述优选实施例中，将待测样品的上样量限定在100～1000μl的原因是为了保证最终检测结果的准确性，若上样量高于上述限定范围不仅造成待测样品、实验耗材的浪费，还会浪费大量的时间成本，反之，若上样量低于上述限定范围则会导致上样量过低，杂质的量也相对较低，无法有效分离，最终影响实验结果的准确性；其中待测样品的上样量可选取100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μl或上述范围内的任一数值，均落在本发明的保护范围之内。

在一优选实施例中，所述流动相配置的方法具体为：

所述超声处理脱气时长为≥20min。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的人白介素-12注射液纯度的检测方法，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1

(1)试剂：三氟乙酸(TEDIA,色谱纯)、乙腈(Fisher，色谱纯)；

(2)仪器：Agilent 1260液相色谱仪(Agilent公司，美国)、Agilent 1260DAD检测器和OpenLAB处理软件(Agilent公司，美国)、AUW220电子天平(SHIMADZU，日本)。

(3)待测样品制备

白介素-12注射液浓度为15μg/ml。

(4)流动相的配制

流动相A：用移液枪吸取三氟乙酸0.5mL至1L容量瓶中，加水定容后，静置5min后上机检测；

流动相B：用移液枪吸取三氟乙酸0.5mL至1L容量瓶中，加乙腈定容后，放入超声处理脱气20min，备用。

(5)色谱条件

色谱柱：YMC C4液相色谱柱(250mm×4.6mm I.D.S-5μm)；

柱温：25℃；

检测波长：300nm；

进样量：1000μL。

洗脱条件：洗脱时间及所述洗脱时间内所述流动相B的体积含量如下：

0-5min，20％；5-25min，20～70％；25-26min，70～100％；26-35min，100～100％；35-35.5min，100～20％；35.5-40min，20～20％。

实施例2

(1)试剂：三氟乙酸(TEDIA,色谱纯)、乙腈(Fisher，色谱纯)；

(3)待测样品制备

人白介素-12注射液浓度为15μg/ml。

(4)流动相的配制

(5)色谱条件

色谱柱：YMC C4液相色谱柱(250mm×4.6mm I.D.S-5μm)；

柱温：25℃；

检测波长：300nm；

进样量：500μl。

实施例3：专属性、柱效、分离度、精密度验证实验

S1：专属性验证实验：

(S1-1)溶剂空白干扰实验

实验方法：用移液器吸取流动相A、流动相B各1000μl，并分别注入液相色谱仪中，色谱条件同实施例1，并记录色谱图，考察空白流动相对色谱测定结果有无干扰作用，实验以流动相A为上样样品，得到色谱图1；以流动相B为上样样品，得到色谱图2。

(S1-2)制剂Buffer干扰实验

实验方法：用移液器吸取制剂Buffer 1000μl，并注入液相色谱仪中，色谱条件同实施例1，并记录色谱图，考察制剂Buffer对色谱测定结果有无干扰作用，实验以制剂Buffer为上样样品，得到色谱图3。

(S1-3)降解杂质分离实验

实验方法：对白介素-12注射液进行加热处理，然后注入液相色谱仪中，色谱条件同实施例1，并记录色谱图，检测相同的色谱条件可能的降解产物，以及杂质与白介素-12注射液的目的峰是否能够达到有效分离，实验以加热后的白介素-12注射液为上样样品，得到色谱图4。

S2、柱效和分离度实验

实验方法：基于上述实验(S1-3)进一步检测白介素-12注射液与杂质的分离度，要求分离度大于1.5，理论塔板数不低于1500，实验得到色谱图5。

S3、精密度实验

实验方法：

按照本发明实施例1中的色谱条件进行精密度实验分析，共进行6次试验并记录色谱图，要求主峰保留时间及主峰面积、面积比均CV≤2.0％，并该精密度实验得到色谱图6-11。

表1精密度实验汇总表

实验结果分析：

本实施例分别验证了本发明提供的纯度测定方法的专属性、柱效、分离度和精密度。首先，从专属性角度分析，实验分别进行了溶剂空白干扰实验、制剂Buffer干扰实验、降解杂质分离实验，实验结果表明(图1-5)流动相A、流动相B、制剂Buffer对本实验测定白介素-12注射液的主峰无干扰现象，然后从可能降解的杂质检测发现，降解杂质对本实验测定白介素-12注射液主峰分离情况良好；其次，对本实验测定白介素-12注射液时的分离度和理论塔板数进行测定，最终实验得到分离度为2.58、理论塔板数为17666；再次，从精密度角度分析，利用本发明提供的检测方法进行了6次精密度测定实验，最终在这6次精密度实验中，主峰保留时间、主峰面积及面积CV均<2.0％，符合实验规定。上述实验结果均表明本发明提供的测定方法在检测白介素-12注射液时，在专属性、柱效、分离度、精密度方面均符合要求。

实施例4：检测限与定量限检测实验

实验方法：

在仪器系统性实验符合检测要求的条件下，将白介素-12成品注射液浓度逐级稀释(其中，白介素-12成品注射液浓度为15μg/ml，将其稀释2¹⁶倍即得0.0586μg/ml样品)，进样并记录色谱图，同时测定三次空白样品，洗脱时间需要覆盖整个样品中所有组分流出。配制梯度浓度的检测样品，单针进样。检测限定义为信噪比≥3(±1):1时的进样浓度。定量限定义为信噪比≥10(±1):1时的进样浓度。

(1)检测限测定结果：

检测限测定结果如图12所述，检测样品经梯度稀释样品至0.06μg/ml，进样量在1000μl时，检测限信噪比符合要求，在样品浓度为0.06μg/ml，进样体积为1000μl时，满足信噪比≥3(±1):1的要求，本方法的检测限为0.06μg。

(2)定量限测定结果：

定量限测定结果如图13所述，检测样品经梯度稀释样品至0.58μg/ml，进样量在1000μl时，定量限信噪比符合要求，在样品浓度为0.58μg/ml，进样体积为1000μl时，满足信噪比≥10(±1):1的要求，本方法的定量限为0.58μg。

实施例5：中间精密度检测实验

实验方法：

本实验取与实施例4一致的同批次样品，安排另一位实验员按照实施例1中色谱条件进行分析，共进行6次试验并记录色谱图，要求主峰保留时间及主峰面积、面积比均CV≤2.0％。

实验结果：中间精密度检测实验如图14-19所示，经过6次中间精密度实验，主峰保留时间及主峰面积、面积比CV均<2.0％，符合规定。

表2中间精密度实验汇总表

实施例6：耐用性检测实验

P6-1、微调流速实验：

实验方法：

本实验按照实施例1提供的色谱条件进行微调流速实验，其中流速分别设定为0.9ml/min、1.0ml/min和1.1ml/min。

表3不同流速条件下实验汇总表

结论：通过微调流速实验，对三种流速下白介素-12注射液的纯度统计结果(表3、图20-25)显示：主峰百分比CV为0.05％，小于5.0％，说明微调流速对纯度检测结果无影响。

P6-2、改变柱温实验：

实验方法：

本实验按照实施例1提供的色谱条件进行改变柱温实验，其中柱温分别设定为28、30、32℃。

表4不同柱温条件下实验汇总表

结论：通过改变柱温实验，对三种温度条件下白介素-12注射液的纯度统计结果(表4、图26-31)显示：主峰百分比CV为0.05％，小于5.0％，说明该实验设定的温度对纯度检测结果无影响，符合规定。

对比例1

(1)检测对象：rhPTH蛋白或rhPTH蛋白制剂

(2)检测方法：

(2-1)将待检rhPTH蛋白或rhPTH蛋白制剂配制成测试母液，测试母液的浓度为2mg/ml；

(2-2)将测试母液稀释成rhPTH蛋白或rhPTH蛋白制剂的待测溶液，待测溶液的浓度为0.2mg/ml；

(2-3)流动相配制：流动相包括流动相A和流动相B，其中流动相A由由乙睛溶液和硫酸钠溶液按照8:92的体积比混合制得，流动相A的pH值为1.9；流动相B由由乙睛溶液和硫酸钠溶液按照45:55的体积比混合制得，流动相B的pH值为2.5；

(2-4)选择C18柱作为反相色谱柱，将45μl待测溶液加入到色谱柱中在210nm的检测波长、38℃的柱温下进行检测；

(2-5)流动相的流速为0.8ml/min；

洗脱条件:洗脱时间及所述洗脱时间内所述流动相B的体积含量如下：0-5min，0-25％；5-15min，25％-35％；15-65min，35％-50％；65-70min，50％-100％；70-72min，100％；72-73min，100％-0；73-85min，0％。

对比例2

(1)检测对象：重组人源胶原蛋白液体制剂

(2)检测方法：

使用HPLC检测方法，该方法色谱柱以适合分离分子量为5-1250KD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂(如SEC300凝胶色谱柱或其他适宜的色谱柱)，流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(含0.06mol/L磷酸氢二溶液和0.04mol/L磷酸二氢钠溶液)-乙腈(90:10)；上样量应不低于20μg，在波长220nm处检测，以重组人源胶原蛋白(RHC)色谱峰计算的理轮板数应不低于1500，按面积归一化法计算。

通过与对比例1-2比较发现，对比例1中供试品的上样浓度在0.2mg/mL-0.3mg/mL，而重组人白介素-12注射液的浓度在15μg/mL，因此此法的上样条件无法进行检测。洗脱梯度和检测波长也不适用于本品的检测。

对比例2中的流动相由磷酸盐和乙腈混合制成，无机盐和有机相长时间在一起容易析出生成沉淀，一方面影响了供试品的检测，一方面产生的沉淀可能堵塞管路，影响仪器的使用寿命。

Claims

1.白介素-12注射液纯度的检测方法，其特征在于，所述方法的流动相及色谱条件为：

洗脱时间及所述洗脱时间内所述流动相B的体积含量如下：

0-5min，20％；5-25min，20→70％；25-26min，70→100％；26-35min，100→100％；35-35.5min，100→20％；35.5-40min，20→20％；

所述流动相A和流动相B的流速为0.9～1.1ml/min；

所述色谱柱的柱温为25-30℃；

检测波长为280-300nm；

待测样品的浓度为6～20μg/ml，待测样品的上样量为100～1000μl。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品的浓度为15μg/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相配置的方法具体为：

所述超声处理脱气时长为≥20min。