CN117825552A - 一种盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射检测方法，包括：A)将待测样品、盐酸赖氨酸和磷酸氢钙对照品分别用溶剂溶解，得到待测液和对照品溶液；B)HPLC‑ELSD法测定待测液、对照品溶液，得到色谱图；色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈‑0.01mol/L乙酸铵按照60:40～30:70的体积比混合，pH为3.0～5.0；流动相B为乙腈‑甲醇‑0.2％冰醋酸按照10:5:85～25:20:55的体积比混合，梯度洗脱。本发明采用一种新的蒸发光散射检测方法，对两个成分同时测定，解决了分别测定工作量大且繁琐的问题，专属性强，灵敏度高，操作简便，准确度好，提高了工作效率。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析检测技术领域，尤其是涉及一种盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射检测方法。
背景技术
现有质量标准及可查询到的资料中，盐酸赖氨酸检测方法有紫外-可见分光光度法、蒸发光散射法、柱前衍生-高效液相色谱法，磷酸氢钙有滴定法、原子吸收分光光度法，均为分别单独测定，其中制剂中滴定法易受干扰，颜色难以观察，专属性较差，紫外-可见分光光度法需测定标准曲线，操作较为繁琐，容易带来误差，所有方法均为仅对单一成分进行测定。
蒸发光散射检测器是一种通用型的检测器，可检测挥发性低于流动相的任何样品，而不需要样品含有发色基团，其工作原理是：将色谱柱洗脱液雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发，最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测。相比目前色谱检测中使用最多的紫外检测器，蒸发光散射检测器具有更高的通用性，不受物质本身结构的限制；蒸发光散射检测器的灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适用于绝大多数不挥发和半挥发物质的分析检测，尤其对于天然产物和中药类等复杂物质分析更具优势。
但是现有技术的蒸发光散射检测器仅仅对盐酸赖氨酸一种成分进行检测，复方制剂中，需要进行2次测定，工作量大且相对较为繁琐。因此，提供一种能同时检测两种成分的蒸发光散射检测方法是非常必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射检测方法，本发明提供的检测方法能同时对两种成分进行测定，灵敏度高，专属性强，结果准确。
本发明提供了一种盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射检测方法，包括：
A)将待测样品采用溶剂溶解，得到待测液；
将盐酸赖氨酸和磷酸氢钙对照品采用溶剂溶解，得到对照品溶液；
B)将待测液和对照品溶液分别采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法进行测定，得到待测液的色谱图和对照品溶液的色谱图；
色谱条件为：色谱柱为C18柱；
流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照60:40～30:70的体积比混合，pH为3.0～5.0；
流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照10:5:85～25:20:55的体积比混合，梯度洗脱。
优选的，步骤B)后还包括：根据所述对照品溶液的浓度、对照品在色谱图中的峰面积和待测样品中相对应成分在色谱图中峰面积，基于步骤B)所述的检测条件，以外标法进行定量。
优选的，所述梯度洗脱具体为：
0～30min，A相：100％～75％、B相：0％～25％；
30～31min，A相：75％～100％、B相：25％～0％；
31～35min，A相：100％、B相：0％。
优选的，所述色谱柱为C18柱，规格为5μm，4.6×250mm；柱温30℃～60℃。
优选的，所述流动相流速为0.5～0.8mL/min；进样量为20μL。
优选的，所述蒸发光散射检测器中：
蒸发温度为70～90℃，雾化温度为75～100℃，载气流速为每分钟0.8～2.0L。
优选的，所述盐酸赖氨酸的进样浓度范围是0.0525～0.1575mg/ml；所述磷酸氢钙的进样浓度范围是0.0511～0.1532mg/ml；
盐酸赖氨酸的定量限为1.458ng；磷酸氢钙的定量限为1.474ng。
优选的，所述色谱条件为：
流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照50:50～40:60的体积比混合，pH为4.0～4.5；
流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照15:10:75～20:15:65的体积比混合，梯度洗脱；
流动相流速为0.6～0.8mL/min；柱温40℃～60℃。
蒸发温度为80～85℃，雾化温度为85～90℃，载气流速为每分钟1～2.0L。
提取方法为超声提取或振摇提取。
优选的，步骤A)所述提取方法为超声提取或振摇提取；
所述溶剂包括稀盐酸、水、0.1～1％甲酸溶液、含0.1％冰醋酸的10～30％的甲醇溶液或乙腈溶液。
优选的，步骤A)所述待测样品为赖氨酸磷酸氢钙片、赖氨酸磷酸氢钙颗粒剂、赖氨酸磷酸氢钙粉剂或赖氨酸磷酸氢钙汤剂与现有技术相比，本发明提供了种盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射检测方法，包括：A)将待测样品采用溶剂溶解，得到待测液；将盐酸赖氨酸和磷酸氢钙对照品采用溶剂溶解，得到对照品溶液；B)将待测液和对照品溶液分别采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法进行测定，得到待测液的色谱图和对照品溶液的色谱图；色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照60:40～30:70的体积比混合，pH为3.0～5.0；流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照10:5:85～25:20:55的体积比混合，梯度洗脱。本发明采用一种新的蒸发光散射检测方法，对两个成分同时测定，解决了分别测定的问题，专属性强，灵敏度高，操作简便，准确度好，减少时间，提高了工作效率。
附图说明
图1为实施例1盐酸赖氨酸线性结果；
图2为实施例1磷酸氢钙线性结果；
图3为实施例2盐酸赖氨酸线性结果；
图4为实施例2磷酸氢钙线性结果；
图5为对比例1附图；
图6为对比例2附图；
图7为对比例3附图；
图8为对比例4附图。
具体实施方式
本发明提供了一种盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射检测方法，包括：
A)将待测样品采用溶剂溶解，得到待测液；
将盐酸赖氨酸和磷酸氢钙对照品采用溶剂溶解，得到对照品溶液；
B)将待测液和对照品溶液分别采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法进行测定，得到待测液的色谱图和对照品溶液的色谱图；
色谱条件为：色谱柱为C18柱；
流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照60:40～30:70的体积比混合，pH为3.0～5.0；
流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照10:5:85～25:20:55的体积比混合，梯度洗脱。
本发明提供的盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射检测方法首先将待测样品采用溶剂溶解，得到待测液。
本发明所述待测样品包括但不限于赖氨酸磷酸氢钙片赖氨酸磷酸氢钙片、赖氨酸磷酸氢钙颗粒剂、赖氨酸磷酸氢钙粉剂或赖氨酸磷酸氢钙汤剂等其余制剂。
本发明上述包括赖氨酸磷酸氢钙的药物制剂都属于本发明的保护客体，都可以采用本发明的方法进行检测
按照本发明，所述溶剂包括稀盐酸、水、0.1～1％甲酸溶液、含0.1％冰醋酸的10～30％的甲醇溶液或乙腈溶液；优选包括水、0.1～1％甲酸溶液、含0.1％冰醋酸的10～30％的甲醇溶液；更优选包括水或含0.1％冰醋酸的10～30％的甲醇溶液。其中甲醇溶液的浓度为10％、20％、30％；或者上述任意二者之间的点值。
本发明所述提取方法为超声提取或振摇提取。本发明对此不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。
将盐酸赖氨酸和磷酸氢钙对照品采用溶剂溶解，得到对照品溶液。
按照本发明，所述溶剂包括稀盐酸、水、0.1～1％甲酸溶液、含0.1％冰醋酸的10～30％的甲醇溶液或乙腈溶液；优选包括水、0.1～1％甲酸溶液、含0.1％冰醋酸的10～30％的甲醇溶液；更优选包括水或含0.1％冰醋酸的10～30％的甲醇溶液。其中甲醇溶液的浓度为10％、20％、30％；或者上述任意二者之间的点值。
一些实施例中，本发明所述盐酸赖氨酸的进样浓度范围是0.0525～0.1575mg/ml；线性方程为y＝381.2118x+0.2374；
所述磷酸氢钙的进样浓度范围是0.0511～0.1532mg/ml；线性方程为y＝320.9531x+0.4183。
一些实施例中，本发明所述盐酸赖氨酸的进样浓度范围是0.0531～0.1593mg/ml；线性方程为y＝466.2137x-0.1477；
所述磷酸氢钙的进样浓度范围是0.0521～0.1562mg/ml；线性方程为y＝445.7104x-0.2482。
将待测液和对照品溶液分别采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法进行测定，得到待测液的色谱图和对照品溶液的色谱图；根据所述对照品溶液的浓度、对照品在色谱图中的峰面积和待测样品中相对应成分在色谱图中峰面积，基于步骤B)所述的检测条件，以外标法进行定量。
色谱条件为：色谱柱为C18柱；所述色谱柱为C18柱，规格为5μm，4.6×250mm；
一些实施例中，色谱柱为ACE PFPC18，4.6mm×250mm，5μm；
一些实施例中，色谱柱为AgilentZOBAX C18柱，4.6mm×250mm，5μm。
柱温30℃～60℃。优选为40～50℃。
本发明上述色谱柱均能使得本发明的物质进行良好的分离，同时色谱柱在上述温度条件下色谱峰对称、分离度好。
一些实施例中，流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照60:40～30:70的体积比混合，pH为3.0～5.0；
流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照10:5:85～25:20:55的体积比混合；
一些实施例中，流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照50:50～40:60的体积比混合，pH为4.0～4.5；
流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照15:10:75～20:15:65的体积比混合，梯度洗脱；
一个实施例中，流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照50:50的体积比混合，pH为4.5；
流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照20:15:65的体积比混合；
一个实施例中，流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照40:60的体积比混合，pH为4.0；
流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照15:10:75的体积比混合，梯度洗脱；
按照本发明，所述梯度洗脱具体为：
0～30min，A相：100％～75％、B相：0％～25％；
30～31min，A相：75％～100％、B相：25％～0％；
31～35min，A相：100％、B相：0％。
本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。
按照本发明，所述流动相流速为0.5～0.8mL/min；更优选的，流动相流速为0.6～0.8mL/min；进样量为20μL。
本发明发现上述流速各色谱峰分离较好，峰形较对称，作为最优选方案。
具体的，所述蒸发光散射检测器中：
蒸发温度为70～90℃，雾化温度为75～100℃，载气流速为每分钟0.8～2.0L。
更优选的，蒸发温度为80～85℃，雾化温度为85～90℃，载气流速为每分钟1～2.0L。
所述载气优选为氮气。
按照本发明，盐酸赖氨酸的定量限为1.458ng；磷酸氢钙的定量限为1.474ng。
在其中一些优选实施方式中，所述色谱条件为：
流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照50:50～40:60的体积比混合，pH为4.0～4.5；
流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照15:10:75～25:15:65的体积比混合，梯度洗脱；
流动相流速为0.6～0.8mL/min；柱温40℃～60℃。
蒸发温度为80～85℃，雾化温度为85～90℃，载气流速为每分钟1～2.0L。
本发明提供了种盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射检测方法，包括：A)将待测样品采用溶剂溶解，得到待测液；将盐酸赖氨酸和磷酸氢钙对照品采用溶剂溶解，得到对照品溶液；B)将待测液和对照品溶液分别采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法进行测定，得到待测液的色谱图和对照品溶液的色谱图；色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照60:40～30:70的体积比混合，pH为3.0～5.0；流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照10:5:85～25:20:55的体积比混合，梯度洗脱。本发明采用一种新的蒸发光散射检测方法，对两个成分同时测定，解决了分别测定的问题，专属性强，灵敏度高，操作简便，准确度好，减少时间，提高了工作效率。
本发明中涉及的数值范围与参数已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有数值范围或具体数据在一定范围内皆可存在一定合理的偏差，例如：1％或0.5％之内。
本发明实施例和对比例中记载了一些案例，其中实施例展示了本发明的某些实现方式。然而，这并不意味着只有在这些案例中才能实现本发明的效果。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射进行详细描述。
实施例1
(1)实验条件及试剂试药
仪器：戴安U3000高效液相色谱仪，ELSD检测器
天平：XSE 205DU电子天平，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司色谱柱：ACEPFPC18，4.6mm×250mm，5μm
试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，盐酸、冰醋酸、乙酸铵均为分析纯
对照品：
盐酸赖氨酸(140673-202201，100mg，中国食品药品检定研究院)
磷酸氢钙(100410-201802，100mg，中国食品药品检定研究院)
(2)实验方法
溶剂水
供试品溶液取赖氨酸磷酸氢钙片20片，研细，取适量，用水振摇溶解并稀释制成每1ml各约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙0.1mg的混合溶液，即得。
对照品溶液：取盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各适量，精密称定，用水溶解并稀释制成每1ml各约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙0.1mg的混合溶液，即得。
色谱条件采用C18(ACE PFP 4.6mm×250mm，5μm)；以比例为乙腈-0.01mol/L乙酸铵(冰醋酸调节pH值4.0)(40:60)流动相A，乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸(15:10:75)为流动相B，按下表梯度洗脱；流速为每分钟0.6ml；柱温为40℃；蒸发温度为80℃；雾化温度为85℃；进样体积20μl；载气流速为每分钟1.0L。
3)方法学考察与验证
1)专属性
取溶剂、空白辅料溶液(按处方比例和制备工艺制备缺盐酸赖氨酸和磷酸氢钙的空白辅料，按供试品溶液制备方法制备空白辅料溶液)、供试品溶液、对照品溶液实验，按上述色谱条件实验。详见下表
表1专属性结果
溶剂与空白辅料均无干扰，对照品溶液与供试品溶液保留时间一致，本方法有很好的专属性。
2)稳定性
取对照品溶液和供试品溶液，按下表取样测定，结果详见下表
表2稳定性结果
结论：24小时内，供试品溶液与对照品溶液峰面积均无显著变化，本方法有很好的稳定性。
3)定量限
取盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成一定浓度的对照品溶液；取对照品溶液，用溶剂逐级稀释，依次进行分析，至主峰峰高约为基线噪音的10倍(S/N≈10)时溶液作为定量限浓度溶液。测定结果见下表。
表3定量限结果
取定量限浓度供试品，连续进样分析6次，试验结果作为定量限重复性考察结果。盐酸赖氨酸和磷酸氢钙定量限重复性测定保留时间与峰面积的统计结果分别见表4～5。
表4定量限重复性(保留时间-分钟)
表5定量限重复性(峰面积)
结论：
盐酸赖氨酸定量限为1.562ng，相当于供试品溶液浓度的0.08％，磷酸氢钙定量限为1.512ng，相当于供试品溶液浓度的0.07％，盐酸赖氨酸、磷酸氢钙保留时间的RSD均小于2％，峰面积的RSD均小于10％。
本方法有很好的灵敏度，能满足含量测定需求。
4)线性试验
盐酸赖氨酸、磷酸氢钙对照品各适量，精密称定，用溶剂溶解并逐级稀释，照下表配制系列对照品溶液。分别精密量取各系列线性溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(A)对其浓度(C)进行线性回归分析，得线性方程，结果见下表。
表6线性测定结果
图1为实施例1盐酸赖氨酸线性结果；图2为实施例1磷酸氢钙线性结果。
5)精密度
①重复性
按(2)实验方法项下制备供试品溶液与对照品溶液，结果见下表。
表7重复性
结论：含量RSD分别为0.6％和0.7％，小于1.5％。本方法有很好的重复性。
②中间精密度同重复性试验，由不同实验人员、采用不同仪器进行试验，结果见下表。
表8中间精密度
结论：12组数据的RSD分别0.6％、1.1％，小于3％。本方法有很好的精密度。
6)准确度照(2)实验方法项下制备对照品溶液。
对照品母液的制备：取盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成每1ml各约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙0.5mg的混合溶液，即得。
供试品高：精密量对照品母液适量，用空白辅料溶液稀释制成每1ml约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各0.15mg的溶液。
供试品中：精密量对照品母液适量，用空白辅料溶液稀释制成每1ml约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各0.1mg的溶液。
供试品低：精密量对照品母液适量，用空白辅料溶液稀释制成每1ml约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各0.05mg的溶液。
分别精密量取上述溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见下表9～10。
表9盐酸赖氨酸准确度测定
表10磷酸氢钙准确度测定
结论：
盐酸赖氨酸平均回收率为97.95％，RSD为1.0％，磷酸氢钙平均回收率为99.01％，RSD为1.3％，均符合要求。
7)3批样品检测
采用本实施例项下(2)实验方法对本公司3批自制样品进行检测，结果如下
表11 3批样品测定结果
结论：3批样品均符合规定。
实施例2
(1)实验条件及试剂试药
仪器：戴安U3000高效液相色谱仪，ELSD检测器
天平：XSE 205DU电子天平，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司色谱柱：AgilentZOBAX C18柱，4.6mm×250mm，5μm
试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，冰醋酸、乙酸铵均为分析纯
对照品：
盐酸赖氨酸(140673-202201，100mg，中国食品药品检定研究院)
磷酸氢钙(100410-201802，100mg，中国食品药品检定研究院)
(2)实验方法
溶剂0.1％冰醋酸的10％甲醇溶液
供试品溶液取赖氨酸磷酸氢钙片20片，研细，取适量，用溶剂振摇溶解并稀释制成每1ml各约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙0.1mg的混合溶液，即得。
对照品溶液：取盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成每1ml各约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙0.1mg的混合溶液，即得。
色谱条件采用C18(AgilentZOBAX 4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈-0.01mol/L乙酸铵(冰醋酸调节pH值4.5)(50:50)流动相A，乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸(20:15:65)为流动相B，按下表梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml；柱温为60℃；蒸发温度为85℃；雾化温度为90℃；进样体积20μl；N2流速为2.0L/分钟。
(3)方法学考察与验证
1)专属性
取溶剂、空白辅料溶液(按处方比例和制备工艺制备缺盐酸赖氨酸和磷酸氢钙的空白辅料，按供试品溶液制备方法制备空白辅料溶液)、供试品溶液、对照品溶液实验，按上述色谱条件实验。详见下表。
表12专属性结果
溶剂与空白辅料溶液均无干扰，对照品溶液与供试品溶液保留时间一致，本方法有很好的专属性。
2)稳定性
取对照品溶液和供试品溶液，按下表取样测定，结果详见下表。
表13稳定性结果
结论：24小时内，供试品溶液与对照品溶液峰面积均无显著变化，本方法有很好的稳定性。
3)定量限
取盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成一定浓度的对照品溶液；取对照品溶液，用溶剂逐级稀释，依次进行分析，至主峰峰高约为基线噪音的10倍(S/N≈10)时溶液作为定量限浓度溶液。测定结果见下表。
表14定量限结果
取定量限浓度供试品，连续进样分析6次，试验结果作为定量限重复性考察结果。盐酸赖氨酸和磷酸氢钙定量限重复性测定保留时间与峰面积的统计结果分别见表15～16。
表15定量限重复性(保留时间-分钟)
表16定量限重复性(峰面积)
结论：
盐酸赖氨酸定量限为1.458ng，相当于供试品溶液浓度的0.07％，磷酸氢钙定量限为1.474ng，相当于供试品溶液浓度的0.07％，盐酸赖氨酸、磷酸氢钙保留时间的RSD均小于2％，峰面积的RSD均小于10％。
本方法有很好的灵敏度，能满足含量测定需求。
4)线性试验
取盐酸赖氨酸、磷酸氢钙对照品各适量，精密称定，用溶剂溶解并逐级稀释，照下表配制系列对照品溶液。分别精密量取各系列线性溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(A)对其浓度(C)进行线性回归分析，得线性方程，结果见下表。
表17线性测定结果
图3为实施例2盐酸赖氨酸线性结果；图4为实施例2磷酸氢钙线性结果。
5)精密度
①重复性
按(2)实验方法项下制备供试品溶液与对照品溶液，结果见下表。
表18重复性
结论：盐酸赖氨酸和磷酸氢钙含量RSD分别为0.5％和0.6％，小于1.5％。本方法有很好的重复性。
②中间精密度同重复性试验，由不同实验人员、采用不同仪器进行试验，结果见下表。
表19中间精密度
结论：盐酸赖氨酸和磷酸氢钙12组数据的RSD分别0.8％、0.6％，小于3％。本方法有很好的精密度。
6)准确度
照(2)实验方法项下制备对照品溶液。
对照品母液的制备：取盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成每1ml各约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙0.5mg的混合溶液，即得。
供试品高：精密量对照品母液适量，用空白辅料溶液稀释制成每1ml约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各0.15mg的溶液。
供试品中：精密量对照品母液适量，用空白辅料溶液稀释制成每1ml约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各0.1mg的溶液。
供试品低：精密量对照品母液适量，用空白辅料溶液稀释制成每1ml约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙各0.05mg的溶液。
分别精密量取上述溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见下表9～10。
表20盐酸赖氨酸准确度测定
表21磷酸氢钙准确度测定
结论：
盐酸赖氨酸平均回收率为98.60％，RSD为0.8％，磷酸氢钙平均回收率为98.42％，RSD为0.6％，均符合要求。
7)3批样品检测
采用本实施例项下(2)实验方法对本公司3批自制样品进行检测，结果如下
表22 3批样品测定结果
结论：3批样品均符合规定。
对比例1
1)仪器：戴安U3000高效液相色谱仪，ELSD检测器
天平：XSE 205DU电子天平，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司色谱柱：Diomonsil C18，250mm×4.6mm，5μm
试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，三氟醋酸为分析纯
对照品：
盐酸赖氨酸(140673-202201，100mg，中国食品药品检定研究院)
磷酸氢钙(100410-201802，100mg，中国食品药品检定研究院)
2)按下记载方法试验
色谱条件：应用高效液相色谱-蒸发光散射检测仪，Diomonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以乙腈-甲醇-0.1％三氟醋酸溶液(2：1：97)为流动相，流速为0.2ml/min。漂移管温度为100℃，气体流速为3L/min，柱温为室温，进样量10μl。
对照品溶液：分别取盐酸赖氨酸、磷酸氢钙对照品各适量，精密称定，分别加水溶解并稀释制成每1ml中各约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙0.1mg的溶液。
3)试验结果
记录色谱图至80分钟，盐酸赖氨酸18.027分钟出峰，磷酸氢钙未出峰。结果见图5。
对比例2
1)仪器及试剂试药
戴安U3000高效液相色谱仪，ELSD检测器
天平：XSE 205DU电子天平，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司色谱柱：Diomonsil C18，250mm×4.6mm，5μm
试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，乙酸铵为分析纯
对照品：
盐酸赖氨酸(140673-202201，100mg，中国食品药品检定研究院)
磷酸氢钙(100410-201802，100mg，中国食品药品检定研究院)
2)按下记载方法实验
色谱条件：采用Covasil–C18柱(250mm×4.6mm,5μm)。以0.05mol/L乙酸铵-甲醇-乙腈(1:1:1)为流动相，流速为每分钟0.5ml，蒸发光散射检测器(ELSD)，漂移管温度为40℃，气体流速为1.5L/min，进样量20μl。
对照品溶液：分别取盐酸赖氨酸、磷酸氢钙对照品各适量，精密称定，分别加流动相溶解并稀释制成每1ml中各约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙0.1mg的溶液。
3)试验结果
记录色谱图至80分钟，盐酸赖氨酸9.852分钟出峰，磷酸氢钙未出峰。结果见图6。
对比例3
1)仪器及试剂试药：
戴安U3000高效液相色谱仪，ELSD检测器
天平：XSE 205DU电子天平，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司色谱柱：Diomonsil C18，150mm×4.6mm，5μm
试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，乙酸铵为分析纯
对照品：
盐酸赖氨酸(140673-202201，100mg，中国食品药品检定研究院)
磷酸氢钙(100410-201802，100mg，中国食品药品检定研究院)
2)按下记载方法实验
色谱条件：应用高效液相色谱-蒸发光散射检测仪，Diamonsil C18色谱柱以0.1％三氟醋酸溶液为流动相，流速为每分钟0.5ml，蒸发光散射检测器(ELSD)，漂移管温度为100℃，气体流速为3L/min，柱温为室温，进样量20μl。
对照品溶液：分别取盐酸赖氨酸、磷酸氢钙对照品各适量，精密称定，分别加水溶解并稀释制成每1ml中各约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙0.1mg的溶液。
3)试验结果
记录色谱图至60分钟，盐酸赖氨酸4.413分钟出峰，磷酸氢钙未出峰。结果见图7。
对比例4
1)仪器及试剂试药：
安捷伦1260高效液相色谱仪，ELSD检测器
天平：XSE 205DU电子天平，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司色谱柱：PrevailC18柱，250mm×4.6mm，5μm
试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，乙酸铵为分析纯
对照品：
盐酸赖氨酸(140673-202201，100mg，中国食品药品检定研究院)
磷酸氢钙(100410-201802，100mg，中国食品药品检定研究院)
2)按下记载方法实验
色谱条件：Prevail C18柱(250mm×4.6mm,5μm)等度洗脱，流动相为乙腈-0.7％三氟乙酸溶液(含5.0mmol/L七氟丁酸)(2：98)，流速为每分钟0.5ml。ELSD漂移管温度115℃，氮气流速2.5L/min。
对照品溶液：分别取盐酸赖氨酸、磷酸氢钙对照品各适量，精密称定，分别加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中各约含盐酸赖氨酸和磷酸氢钙0.1mg的溶液。
3)试验结果
记录色谱图至60分钟，磷酸氢钙分别在5.626分钟、8.592分钟出2个峰，盐酸赖氨酸未出峰。结果见图8。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种盐酸赖氨酸及磷酸氢钙的蒸发光散射检测方法，其特征在于，包括：
A)将待测样品采用溶剂溶解，得到待测液；
将盐酸赖氨酸和磷酸氢钙对照品采用溶剂溶解，得到对照品溶液；
B)将待测液和对照品溶液分别采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法进行测定，得到待测液的色谱图和对照品溶液的色谱图；
色谱条件为：色谱柱为C18柱；
流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照60:40～30:70的体积比混合，pH为3.0～5.0，流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照10:5:85～25:20:55的体积比混合；梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B)后还包括：根据所述对照品溶液的浓度、对照品在色谱图中的峰面积和待测样品中相对应成分在色谱图中峰面积，基于步骤B)所述的检测条件，以外标法进行定量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
0～30min，A相：100％～75％、B相：0％～25％；
30～31min，A相：75％～100％、B相：25％～0％；
31～35min，A相：100％、B相：0％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为C18柱，规格为5μm，4.6×250mm；柱温30℃～60℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.5～0.8mL/min；进样量为20μL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蒸发光散射检测器中：
蒸发温度为70～90℃，雾化温度为75～100℃，载气流速为每分钟0.8～2.0L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐酸赖氨酸的进样浓度范围是0.0525～0.1575mg/ml；所述磷酸氢钙的进样浓度范围是0.0511～0.1532mg/ml；
盐酸赖氨酸的定量限为1.458ng；磷酸氢钙的定量限为1.474ng。
8.根据权利要求1～6任意一项所述的方法，其特征在于，所述色谱条件为：
流动相A为乙腈-0.01mol/L乙酸铵按照50:50～40:60的体积比混合，pH为4.0～4.5；
流动相B为乙腈-甲醇-0.2％冰醋酸的按照15:10:75～20:15:65的体积比混合，梯度洗脱；
流动相流速为0.6～0.8mL/min；柱温40℃～60℃；
蒸发温度为80～85℃，雾化温度为85～90℃，载气流速为每分钟1～2.0L；
提取方法为超声提取或振摇提取。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述提取方法为超声提取或振摇提取；
所述溶剂包括稀盐酸、水、0.1～1％甲酸溶液、含0.1％冰醋酸的10～30％的甲醇溶液或乙腈溶液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述待测样品为赖氨酸磷酸氢钙片、赖氨酸磷酸氢钙颗粒剂、赖氨酸磷酸氢钙粉剂或赖氨酸磷酸氢钙汤剂。
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