CN110840752A - 一种油包水体系祛皱多肽组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种油包水体系祛皱多肽组合物，属于美容多肽技术领域，所述祛皱多肽组合物包含具有类肉毒作用的多肽，所述具有类肉毒作用的多肽存在于水相当中，各多肽质量百分浓度为0.0001％‑5％，所述水相与油相形成油包水体系。所述油相包含表面活性剂、油性润肤剂。与水基体系相比，本发明所述祛皱多肽组合物采用油包水体系，多肽成分溶于少量水相，使得油包水体系中局部多肽浓度更高，更易于透皮吸收，在皮肤的蓄积量更高，同样的投料量可以达到更优异的祛皱效果，而且稳定性好、安全性高、制备工艺简单、成本低廉、适于工业化大生产。

Description

一种油包水体系祛皱多肽组合物

技术领域

本发明属于美容多肽技术领域，涉及一种油包水体系祛皱多肽组合物。

背景技术

皱纹是皮肤衰老的结果，皮肤衰老不仅直接影响着皮肤组织的正常结构和生理机能，而且也间接地影响着机体内外环境的稳定，导致新陈代谢不同程度的失衡，甚至有可能促进和加快机体的衰老和死亡。正常情况下肌肉收缩过程是：神经冲动——乙酰胆碱(Ach)——终板电位——肌肉动作电位——肌肉收缩。过度的肌肉紧张和收缩，是形成皱纹的原因之一。

A型肉毒毒素(Botox)通过专一阻断乙酰胆碱在神经-肌肉接头处的释放而引起肌肉瘫痪。研究开发小分子多肽模拟A型肉毒毒素的作用，可以达到改善皱纹的效果。祛皱多肽组合物可以通过调整神经递质的释放而达到调节肌肉收缩的效果，从而祛除皱纹。这些活性多肽都是水溶性的，因此组合物产品也是水基的，多肽溶解其中。

然而，多肽在水溶液中容易发生降解，将多肽成分直接添加至水基产品中，由此带来的问题是多肽在产品中稳定性较差，使得原本具有高效活性的祛皱多肽无法充分发挥其应有的效果，而且多肽在产品中降解而产生的降解产物有可能对人体产生潜在的危害。此外，水溶性的物质难以透过皮肤屏障被吸收，也就难以充分发挥其祛皱功效。为了增加透皮吸收，达到预期的效果，需要增加投料量，由此会带来成本的上升。

因此，本领域急需一种稳定性好、安全性高、易于透皮吸收、成本低廉、制备工艺简单、适于工业化大生产、效果优异，能够弥补现有技术缺陷的祛皱产品。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种稳定性好、安全性高、易于透皮吸收、成本低廉、制备工艺简单、适于工业化大生产、效果优异的祛皱多肽组合物。

经过试验研究，本发明人发现将多肽成分分散于油相当中，形成油包水体系，体系中少量的水相可以减少多肽与水的接触，使其在水相中浓缩，有利于提高多肽的稳定性，并且局部更大浓度的多肽有利于发挥更好的祛皱功效；外部油相可以使多肽成分更好地透过皮肤屏障，促进吸收，从而赋予产品更优异的祛皱效果，由此形成了本发明。

本发明提供了一种油包水体系祛皱多肽组合物，包含具有类肉毒作用的多肽，选自一种或几种以下多肽，包括但不限于乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、五肽-18、五肽-3、二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酰苄基酰胺、芋螺肽，所述具有类肉毒作用的多肽存在于水相当中，各多肽质量百分浓度为0.0001％-5％，所述水相与油相形成油包水体系。

本发明所述油相包含表面活性剂、油性润肤剂。

所述表面活性剂是PEG-20三异硬脂酸甘油酯、PEG-7甘油椰油酸酯、PEG-6辛酸/癸酸甘油酯类、聚甘油-2异硬脂酸酯、聚甘油-4月桂酸酯中的一种或几种组合，各成分质量百分浓度为1％-10％。

所述油性润肤剂是氢化聚异丁烯、辛酸/癸酸甘油三酯、异壬酸异壬酯中的一种或几种组合，所述油性润肤剂的质量百分浓度为70％-90％。

所述油性润肤剂还可以包含植物油，所述植物油是山茶籽油、霍霍巴籽油、坚果油、太阳花籽油。

本发明所述油包水体系祛皱多肽组合物主要是制备皮肤外用的护肤产品或医用产品。

为了更有利于理解本发明，将皱纹的形成及祛皱机理、上述祛皱多肽的作用机制说明如下：

1、皱纹的形成及祛皱机理

过度的肌肉紧张和收缩，是形成皱纹的原因之一。通过调整肌肉收缩可减少皱纹产生。肌肉收缩是由于神经-肌肉接头突触前膜囊泡中的神经递质乙酰胆碱释放，作用于突触后膜而引起的。囊泡需先与突触前膜融合才能完成胞吐过程。膜融合由SNARE复合物介导，它是一种由突触小泡缔合性膜蛋白(VAMP)、突触融合蛋白(Syntaxin)和突触小体相关蛋白25(SNAP-25)形成的三元络合物，其中VAMP位于囊泡膜上，Syntaxin和SNAP-25位于突触前膜。通过它们之间的特异性识别，相互作用，从而促进囊泡与突触前膜融合，释放乙酰胆碱，导致肌肉收缩。VAMP、Syntaxin和SNAP-25三元络合物的形成依赖于突触间隙的钙离子内流，钙离子进入突触前膜可以启动三元络合物的形成过程，促进囊泡与突触前膜融合，释放乙酰胆碱。乙酰胆碱释放后，需要与突触后膜的肌肉型烟碱型乙酰胆碱受体(m-nAchR)结合，钠离子内流，产生动作电位，才能最终发生肌肉收缩。

因此，从肌肉收缩的机制出发，通过干扰SNARE三元络合物的形成，抑制突触间隙的钙离子内流，竞争性拮抗突触后膜的肌肉型烟碱型乙酰胆碱受体(m-nAchR)，阻止钠离子内流，均可以阻断神经信号传导，从而抑制肌肉收缩，淡化皱纹。

2、祛皱多肽的作用机制

乙酰基六肽-8(Acetyl Hexapeptide-8，CAS号：616204-22-9)，是一种神经递质抑制类多肽，参与竞争突触小体相关蛋白25(SyNaptosomal Associated Protein 25，SNAP-25)在囊泡的结合位点，从而影响三元络合物的形成，使囊泡不能有效释放神经递质乙酰胆碱，从而使肌肉收缩减弱，防止皱纹的形成，可以显著祛除鱼尾纹、抬头纹、法令纹等动态纹路。

乙酰基八肽-3(Acetyl Octapeptide-3，CAS号：868844-74-0)，通过模拟SNAP-25的肽链N端末端序列而设计得到，是乙酰基六肽-8的延长类似物，通过与囊泡的相关位点结合，从而阻止SNAP-25与位点的结合，进而影响三元络合物的形成，干扰乙酰胆碱的释放，阻断神经信号传导，使肌肉收缩减弱，从而发挥祛皱的作用。

五肽-18(Pentapeptide-18，CAS号：64963-01-5)，一种修饰过的脑啡肽，可以在神经细胞外和脑啡肽受体结合，并通过G蛋白调节钙离子通道，使钙离子通道关闭，囊泡不能与突触前膜融合，进而抑制神经递质乙酰胆碱的释放，从而抑制肌肉收缩，防止细纹和皱纹生成。

五肽-3(Pentapeptide-3，CAS号：135679-88-8)，具有类肉毒作用，可以发挥抗皱和光滑皮肤的功效。

二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐(Dipeptide Diaminobutyroyl BenzylamideDiacetate，CAS号：823202-99-9)，具有类肉毒作用，作用于突触后膜，是肌肉型烟碱型乙酰胆碱受体(m-nAchR)拮抗剂，通过可逆地与肌肉型烟碱型乙酰胆碱受体(m-nAchR)结合，从而阻滞乙酰胆碱与受体结合，导致受体封闭，在封闭状态下钠离子不能摄入，无法去极化，神经兴奋传递因此被阻断，使得肌肉不能收缩而松弛，从而达到祛除皱纹的目的。

β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酰苄基酰胺(Beta-AlanylHydroxyprolyldiaminobutyroyl Benzylamide)，发明人自主研发的新型多肽原料，类肉毒作用，是肌肉型烟碱型乙酰胆碱受体(m-nAchR)拮抗剂，通过与m-nAchR的牢固结合，从而阻断神经递质乙酰胆碱与受体结合，使兴奋传递减弱，肌肉松弛而具有显著的祛皱效果。

芋螺肽(Conopeptide)，模拟天然的μ-芋螺毒素，由22个氨基酸构成，具有μ-芋螺毒素二硫键骨架，分子中三对二硫键链接方式为C3-C15，C4-C21，C10-C22，其结构通过高度折叠，穿透能力强。当动作信号传达到运动神经末梢后，经过一系列生理活动，突触前膜释放乙酰胆碱，乙酰胆碱与突触后膜的受体m-nAchR结合，钠离子内流，从而产生动作电位，肌肉发生收缩。芋螺肽可以特异性地阻断电压门控钠离子通道，使钠离子内流受阻，肌肉动作电位不能形成，表情肌得以放松，从而有效地预防和减少皱纹。被誉为可以涂抹的类肉毒杆菌毒素，可即时快速祛皱。

本发明从皱纹的形成及祛皱机理出发，利用多肽的不同作用靶点，通过将多肽分散于油相体系，得到一种油包水体系祛皱多肽组合物。本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括：

(1)将多肽溶于少量水相，分散于油相，形成油包水体系，提高了多肽的稳定性及使用安全性。

(2)多肽在水相中浓缩，使得局部活性成分浓度增加，有利于达到更优的祛皱效果。

(3)体系中的油相可以促进水溶性多肽的透皮吸收，同样的投料量可以达到更好的祛皱效果。

(4)本发明可以用更低的成本达到更优的祛皱功效，而且制备工艺简单，适于工业化大生产。

附图说明

图1多肽组合物油包水体系的显微图像(40*10倍)

图2多肽的体外累积透皮量和累积皮肤滞留量(24h)

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对发明作详细的说明，但并不只限于以下的实施例。

实施例制备实施例1-5和对比例1-5的组合物

实施例1-5和对比例1-5组合物的处方配比(百分含量)如下：

实施例1-5和对比例1-5组合物的制备方法：

1、准确称量原料5、6、7、8、9，加入处方量的原料1，充分溶解；

2、准确称量原料2、3、4，将其与步骤1所得溶液混合均匀，即得。采用生物数码显微镜观察实施例3的显微图像，结果见图1，在显微镜40*10倍下观察到许多大小均一的小液滴，均匀分布于油相，形成油包水体系。

测试例1稳定性试验

1.1仪器

恒温恒湿箱、高效液相色谱仪(HPLC)

1.2试验样品

实施例1-5、对比例1-5

1.3试验依据

《中国药典》2015年版四部通则9001原料药与制剂稳定性试验指导原则

1.4试验条件与检验项目

加速试验：恒温恒湿箱40℃±2℃，RH75％±5％，分别于第1、2、3、6个月通过HPLC检测各样品中多肽的含量，以评价其稳定性。

长期试验：恒温恒湿箱25℃±2℃，RH60％±10％，分别于第3、6、9、12、18、24、36个月通过HPLC检测各样品中多肽的含量，以评价其稳定性。

1.5稳定性试验结果

实施例1-5、对比例1-5的样品在加速试验条件下放置6个月后，稳定性数据见下表1：

表1加速6个月的稳定性试验数据(含量应为标示量的95％-105％)

实施例1-5、对比例1-5的样品在长期试验条件下放置6个月后，稳定性数据见下表2：

表2长期6个月的稳定性试验数据(含量应为标示量的95％-105％)

由表1及表2的结果可知，在加速试验及长期试验6个月后，实施例1的多肽含量没有出现显著变化，仍在质量标准范围之内，而对比例1的多肽含量出现明显下降，说明多肽在油包水体系中具有更好的稳定性。同理，通过实施例2与对比例2、实施例3与对比例3、实施例4与对比例4、实施例5与对比例5不同试验结果之间的比较可知，不同种类的多肽在油包水体系的稳定性均比处于水基体系的稳定性好，水基体系中多肽含量在加速试验及长期试验6个月后出现了不同程度的下降，多肽含量的降低必然导致其功效的下降，甚至可能产生有害的降解产物，对人体具有潜在危害。因此，活性多肽分散于油包水体系可以提高其稳定性和安全性，在相同投料量的情况下可以取得更优异的祛皱效果。

测试例2体外累积透皮量及累积皮肤滞留量试验

2.1仪器

智能药物透皮扩散试验仪、高效液相色谱仪(HPLC)

2.2试验样品

实施例1、对比例1

2.3试验方法

采用垂直式Franz扩散池法评价样品的透皮性能。将SD大鼠腹部的离体皮肤固定于扩散池接受室和供给室之间，取1g样品于供给室的皮肤表面，有效扩散面积3.14cm²，接收池中加入生理盐水作为接收液，排净气泡使真皮一侧与接收液完全接触，32℃、300r/min搅拌扩散。分别于4h、8h、12h、16h、20h、24h取接收液0.5mL，并及时补充等量恒温空白接收液。经HPLC测定接收液中多肽的浓度，按以下公式计算不同时间的多肽单位面积累积透皮量：

其中：Q_n为累积透皮量；C_n为该次取样时接收液中多肽浓度；V为接收池中生理盐水体积；C_i为第1次至上次取样时接收液中多肽浓度；V_i为每次取样体积；A为有效扩散面积。

24h后，取下皮肤，超纯水洗去样品残液后剪碎，加入超纯水匀浆处理，超声5min，10000r/min离心10min，取上清液经HPLC法检测，按以下公式计算多肽单位面积皮肤滞留量：

Q_s＝C_s×V/A

其中，Q_s为累积滞留量；C_s为取样时间点测得的皮肤样品液中多肽质量浓度；V为上清液体积；A为有效扩散面积。

2.4试验结果

实施例1、对比例1在24h透皮扩散试验之后，样品中多肽的体外累积透皮量及累积皮肤滞留量如图2所示。

图2结果显示，实施例1的多肽成分经24h的累积透皮量为60.74μg/cm²，累积皮肤滞留量为28.51μg/cm²，对比例1的多肽成分经24h的累积透皮量为22.93μg/cm²，累积皮肤滞留量为3.16μg/cm²。由此可知，多肽直接溶于水基体系中，由于皮肤屏障的限制，水溶性的多肽难以透过皮肤屏障，其透皮量及皮肤滞留量均较低，而经分散在油相当中，借助油相与皮肤屏障的相似相溶原理，多肽更易于透皮吸收，而且多肽成分溶于少量水相，使得油包水体系中局部多肽浓度更高，浓度梯度增大也有利于促进透皮吸收。对比试验结果表明，多肽分散在油包水体系，其透皮量及皮肤滞留量均显著提高，尤其是皮肤滞留量提高更加明显，可以在皮肤中蓄积，形成活性成分储库，从而可以更加有效且持久地发挥祛皱作用。

测试例3肌肉收缩试验

3.1建立肌肉收缩模型

第三次传代的正常成肌细胞置于含2/3MEM和1/3M199、2mmol/L L-谷氨酰胺、50UI/mL青霉素、50μg/mL链霉素、5％胎牛血清培养基中，于37℃，5％CO₂，且明胶包被的平板中培养，直到形成单层的肌原纤维。然后将具有背根神经节、出生10天的小鼠胚胎脊髓外植体置于所述肌细胞单层上，共培养48h后，观察到从外植体生长出的神经突与肌细胞接触，100h后开始发生收缩。共培养4周后，神经和肌肉已经充分连接，形成具有完全成熟的神经肌肉接头、充分分化的横纹肌纤维模型。在这一阶段，肌原纤维可以进行规律的收缩。

3.2测试方法

①样品

实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5，以纯化水作为空白对照。

②加入样品前观察

用与录像机连接的显微镜观察模型的肌肉收缩频率30s，观察5次，计数，取平均值。

③加入样品后测试

将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5及空白对照组分别加入模型当中，在1min、2h、48h时观察肌肉收缩频率各30s，并计数，取5次测量平均值，记录结果。

3.3测试结果

经实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5及空白对照组处理后，在不同时间记录的肌肉收缩次数结果见下表3。

表3各组多肽组合物在不同时间的肌肉收缩次数

样品名称	0min	1min	2h	48h
					空白对照组	106	105	107	103
实施例1	107	66	39	17
					实施例2	109	48	26	11
实施例3	108	26	15	0
					实施例4	109	21	10	0
实施例5	107	14	0	0

由表3结果可知，相对于空白对照组，经实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5处理后，不同时间点的肌肉收缩次数均发生了不同程度的较少。对结果采用t检验分析，P＜0.05，表明各实施例与空白对照组的肌肉收缩次数差异具有统计学意义，各实施例可以减少肌肉收缩次数，降低肌肉收缩频率，从而改善皱纹。此外，在活性成分浓度保持一致的条件下，随着多肽种类的增多，降低肌肉收缩频率的效果更加明显，说明不同多肽可以从不同的作用靶点抑制肌肉收缩，不同多肽之间具有协同作用，从而达到更优的祛皱效果。

测试例4祛皱功效试验

4.1受试者

330名35-55岁的健康女性，随机分为11组，平均每组30人。

4.2试验样品

实施例1-5、对比例1-5，以安慰剂作为空白对照。

4.3测试仪器

C-Cube多功能皮肤成像分析系统(Pixience，法国)

4.4试验操作

给药前，先测量眼周区域的皱纹深度空白值，然后将试样均匀涂布于测试区域，30min后再次测量皱纹深度值，与给药前的空白值比较，计算30min皱纹深度变化百分比，以此评价样品的即时祛皱效果。测试期间不得使用其他化妆品，连续使用4周，分别测量记录各组样品测试区域的皱纹深度，与给药前的空白值比较，计算使用4周的皱纹深度变化百分比，以此评价样品的持久祛皱效果。同一个受试者的测试由同一个测量人员完成。

4.5测试结果

安慰剂组、实施例1-5、对比例1-5的组合物在给药前、给药30min、给药4周的皱纹深度变化百分比见下表4。

表4各组多肽组合物在不同时间的皱纹深度变化百分比(％)

样品名称	0min	30min	4周
				安慰剂组	0	-3.75	-3.14
实施例1	0	-21.83	-39.46
				对比例1	0	-16.71	-24.38
实施例2	0	-33.54	-52.42
				对比例2	0	-25.96	-38.65
实施例3	0	-41.27	-58.91
				对比例3	0	-34.05	-45.36
实施例4	0	-43.82	-61.52
				对比例4	0	-35.47	-49.49
实施例5	0	-54.96	-73.84
				对比例5	0	-40.63	-56.47

由表中数据可知，相对于安慰剂组，在活性多肽存在的条件下，实施例1-5及对比例1-5在使用后测得的皱纹深度均出现不同程度的减小。比较实施例1与对比例1的检测结果，在多肽种类及用量均相同的情况下，使用30min后，实施例1的皱纹深度减小了21.83％，表明实施例1具有良好的即时祛皱效果，而且祛皱效果优于对比例1，多肽分散于油相体系，可以发挥更好的祛皱功效。使用4周后，实施例1的皱纹深度减少了39.46％，优于使用30min所测得的祛皱效果，表明实施例1具有良好的持久祛皱功效。同理，通过实施例2与对比例2、实施例3与对比例3、实施例4与对比例4、实施例5与对比例5不同试验结果之间的比较可知，不同种类的多肽在油包水体系的祛皱效果均比处于水基体系的祛皱效果好，而且具有良好的即时及持久祛皱作用。此外，在活性成分浓度保持一致的条件下，随着多肽种类的增多，皱纹深度减小的幅度更大，相对于实施例1-4，实施例5在给药30min后皱纹深度减小了54.96％，给药4周后皱纹深度减小了73.84％，说明不同多肽可以从不同的作用靶点抑制肌肉收缩，不同多肽之间具有显著的协同作用，从而达到更优的祛皱效果。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明，但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或是替换，都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种油包水体系祛皱多肽组合物，其特征在于，包含具有类肉毒作用的多肽，选自一种或几种以下多肽，包括但不限于：乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、五肽-18、五肽-3、二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酰苄基酰胺、芋螺肽，所述具有类肉毒作用的多肽存在于水相当中，各多肽质量百分浓度为0.0001％-5％，所述水相与油相形成油包水体系。

2.按权利要求1所述油包水体系祛皱多肽组合物，其特征在于，所述油相包含表面活性剂、油性润肤剂。

3.按权利要求2所述油包水体系祛皱多肽组合物，其特征在于，所述表面活性剂是PEG-20三异硬脂酸甘油酯、PEG-7甘油椰油酸酯、PEG-6辛酸/癸酸甘油酯类、聚甘油-2异硬脂酸酯、聚甘油-4月桂酸酯中的一种或几种组合，各成分质量百分浓度为1％-10％。

4.按权利要求2所述油包水体系祛皱多肽组合物，其特征在于，所述油性润肤剂是氢化聚异丁烯、辛酸/癸酸甘油三酯、异壬酸异壬酯中的一种或几种组合，所述油性润肤剂的质量百分浓度为70％-90％。

5.按权利要求4所述油包水体系祛皱多肽组合物，其特征在于，所述油性润肤剂还可以包含植物油，所述植物油是山茶籽油、霍霍巴籽油、坚果油、太阳花籽油。

6.按权利要求1所述油包水体系祛皱多肽组合物，其特征在于，所述油包水体系祛皱多肽组合物主要是制备皮肤外用的护肤产品或医用产品。

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