CN114410541B

CN114410541B - 一种产细菌素的芽胞杆菌xin-tl12、其产物及其应用

Info

Publication number: CN114410541B
Application number: CN202210122032.3A
Authority: CN
Inventors: 信丙越; 王梦琪; 王俊; 王晨曦; 孙凤勤; 王倩
Original assignee: Huaibei Normal University
Current assignee: Huaibei Normal University
Priority date: 2022-02-09
Filing date: 2022-02-09
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2042-02-09
Also published as: CN114410541A

Abstract

本发明属于医药应用领域，具体涉及一种产细菌素的芽胞杆菌XIN‑TL12、其产物及其应用。该菌的分类命名为：Bacillus sp.XIN‑TL12，保藏编号：CCTCC NO：M 2021718；产自所述芽胞杆菌XIN‑TL12的细菌素，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，且该氨基酸序列的N末端修饰有甲酰基。本发明结果证明，Bacin A2对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)具有高效的抑菌活性，可以用于药物、饲料添加剂、食品抑菌剂等，具有进一步开发利用的前景。

Description

一种产细菌素的芽胞杆菌XIN-TL12、其产物及其应用

技术领域

本发明属于医药应用领域，具体涉及一种产细菌素的芽胞杆菌XIN-TL12、其产物及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌是全球院内感染的首要病原菌，可引起皮肤和软组织感染、菌血症、骨髓炎、脓毒性关节炎、肺炎、心内膜炎等疾病。临床分离的80%以上金葡菌对为耐甲氧西林金葡菌（MRSA），因其多重耐药性，抗MRSA感染日益成为抗感染治疗的热点和难点，因此迫切需要新的抗MRSA药物。细菌素是由细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或多肽类物质。目前，一些芽胞杆菌产生的细菌素，如在蜡样芽胞杆菌As1.1846中报道的羊毛硫细菌素cerecin对耐甲氧西林金葡菌（MRSA）具有显著的抑菌活性。研究表明芽胞杆菌中依然存在大量未鉴定的新颖细菌素，这些新颖细菌素可被鉴定、开发做新型抗MRSA药物，具有重要开发应用前景。

发明内容

本发明的第一个目的，提供一种产细菌素的芽胞杆菌XIN-TL12，该菌的分类命名为：Bacillus sp.XIN-TL12，保藏编号：CCTCC NO：M 2021718。

本发明的第二个目的，提供一种产所述芽胞杆菌XIN-TL12的细菌素，所述细菌素具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，且该氨基酸序列的N末端修饰有甲酰基。

本发明的第三个目的，提供所述的细菌素的提取方法，包括如下步骤：

S1、挑取XIN-TL12单个菌落接种于培养基内，30 ℃，220 r/min培养8h，将发酵液离心并用大孔吸附树脂过柱吸附，吸附后的柱料依次用ddH₂O和质量百分比浓度30 %的乙醇溶液冲洗，最后用质量百分比浓度80 %的乙醇将活性物质洗脱下来，洗脱液经浓缩、冻干处理得到干粉，获得的干粉溶于质量百分比浓度50 %的乙腈溶液，离心，所获得的上清即为粗提液；

S2、采用高效液相色谱对粗提液分离，自动进样，跑样，收集主要色谱峰，经旋干、冻干处理得到SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列N末端修饰甲酰基的细菌素。

进一步的，S2中，色谱条件为：

色谱柱：Agilent C18反相柱，250 mm×4.6 mm，5 μL；

流动相：A相为含0.1% TFA 的ddH₂O ，B相为乙腈；

流动相条件：0-60 min，10%-90%乙腈梯度洗脱；

检测波长：220 nm；

流速：1 mL/min。

本发明的第四个目的，提供所述的细菌素在制备抑菌剂中的应用，该抑菌剂抑制金黄色葡萄球菌。

本发明的第五个目的，提供所述的细菌素在制备用于治疗金黄色葡萄球菌染性疾病的药物中的应用。

本发明的第六个目的，提供一种用于治疗金黄色葡萄球菌染性疾病的药物，包含所述的细菌素，还包含一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。

本发明的有益效果为：

本发明通过抑菌活性筛选确定芽胞杆菌XIN-TL12菌株可产生对耐甲氧西林金葡菌（MRSA）具有高效抗菌活性的物质。经提取、鉴定芽胞杆菌XIN-TL12菌株产生的抑菌活性物质为1种新型的细菌素，被命名为Bacin A2。Bacin A2对耐甲氧西林金葡菌（MRSA）具有高效的抑菌活性，可以用于药物、饲料添加剂、食品抑菌剂等，具有进一步开发利用的前景。

生物材料保藏信息说明：

芽胞杆菌XIN-TL12，分类命名为：Bacillus sp. XIN-TL12，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2021年6月15日，保藏编号：CCTCC NO：M 2021718。

附图说明

图1：（A）芽胞杆菌XIN-TL12菌落形态图；（B）芽胞杆菌XIN-TL12不同生长时期的发酵上清对耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的抑菌活性检测结果；

图2：芽胞杆菌XIN-TL12菌株基因组中的假定细菌素Bacin A2的氨基酸序列及其分子量分析；

图3：（A）芽胞杆菌XIN-TL12产生的抗菌物质的HPLC分析；(B) 芽胞杆菌XIN-TL12产生的抗菌物质的一级质谱分析；（C）芽胞杆菌XIN-TL12产生的抗菌物质的二级质谱分析；该活性物质断裂后产生的多肽片段与氨基端发生甲酰化修饰的细菌素Bacin A2相吻合，fM为甲酰甲硫氨酸；

图4：Bacin A2对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300的抑菌结果，图中A-E依次为浓度8，4，2 ，1，0.5μM的实验样品的抑菌结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：芽胞杆菌XIN-TL12的分离及分类鉴定

采集安徽省淮北市相山山脉土壤样品；取10 g土样样品至250 mL灭菌三角瓶中，加入30 mL无菌水，充分混匀；将三角瓶至80℃水浴锅水浴3 min，随后静置10 min；在超净工作台中取50微升上清液涂布LB固体培养基；将涂布后平板置于30℃ 培养18 h；挑取单菌落并划线于新的LB固体培养基；菌株XIN-TL12是分离、获得的菌株之一（附图1A），用于下一步抗MRSA活性筛选。

另外，使用细菌菌种鉴定16S rDNA序列引物：27F（SEQ ID NO.2所示）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R（SEQ ID NO.3所示）：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，获得XIN-TL12的16S rDNA序列如SEQ ID NO.4所示。BlastN分析显示XIN-TL12的16S rDNA序列与菌株Bacillus mycoides S20704、Bacillus cereus SCU1、Bacillus thuringiensis FDAARGOS_792、Bacillus paranthracis MN1F的16S rDNA序列一致性均大于99.8 %，因此XIN-TL12暂未判定到种，只到芽胞杆菌属，因此将其命名为Bacillus sp.XIN-TL12。

实施例2：芽胞杆菌XIN-TL12菌株抑菌活性的检测

挑取芽胞杆菌XIN-TL12的单菌落（附图1A）接种于5 ml LB液体培养基（配方：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌30 min）中于30℃过夜活化。将1 mL的培养物转移至100 mL的LB液体培养基中，在200 rpm/min，30℃下培养30 h。从接种起每隔2 h在超净台中取1 mL培养液，连续取样12次。培养液经12000 rpm/min，5 min离心后将上清液转移至新的离心管，并测定发酵上清对指示菌的抑菌活性。利用琼脂扩散法检测发酵上清的抑菌活性。在未凝固的琼脂培养基中加入适量的指示菌（细菌个数约为5×10⁵ cfu/mL），混匀，倒平板。选取耐甲氧西林金葡菌ATCC43300为指示菌。待其凝固后用孔径为6 mm的打孔器打孔。每孔中加入约50 μL样品后将平板先放置于4 ℃，2 h左右，让待测样品充分扩散，而后放置于30 ℃下培养12 h，观察抑菌效果（观察有无透明的抑菌圈出现）。如附图1B所示，芽胞杆菌XIN-TL12在6-14h的发酵上清对指示菌耐甲氧西林金葡菌ATCC43300具有明显的抑菌活性。

实施例3：芽胞杆菌XIN-TL12菌株的基因组测序及抗菌活性物质分析

将芽胞杆菌XIN-TL12菌株送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组测序（通过Illuminate Hiseq2500测序仪完成）。测序使用双端测序，测序读长为125bp，测序数量为1G。最终测序数据经基因组拼接软件PGCGAP完成XIN-TL12的基因组拼接、注释工作。

通过在线软件antiSMATH对XIN-TL12菌株基因组进行抗菌活性物质分析发现，其基因组中含有1个未鉴定、报到的无前导肽细菌素合成基因簇，该细菌素合成基因簇编码1种细菌素产物，我们将其命名为Bacin A2，其氨基酸序列（SEQ ID NO.1所示）如下：MITFLRIVAQLGARAARWAWANKDRILNWIKNGMAIDWIIDKINDMVN。

通过计算获得Bacin A2的分子量为5623.9998 Da（单一同位素）（图2）。

实施例4：芽胞杆菌XIN-TL12分泌的抗菌物质的的鉴定

（1）芽胞杆菌XIN-TL12分泌的活性物质的粗提取

挑取XIN-TL12菌株的单菌落于5 mL LB液体培养基过夜活化。按1%(V/V)接种量转接至10瓶200 mL LB培养液中，30 ℃，220 r/min培养8h；将发酵液离心(12000 r/min, 10min)，并将获得的2 L上清用200 g的大孔吸附树脂（Amberlite）XAD-7HP过柱吸附；吸附后的柱料首先用1 L ddH₂O冲洗，再用0.5 L 30 %的乙醇溶液冲洗，最后用0.5 L、80 %的乙醇(pH 2.0)将活性物质洗脱下来；洗脱液于45 ℃下通过旋转蒸发仪浓缩，旋干至5 mL左右后收集并做冻干处理；获得的干粉溶于50 %乙腈(pH 5.0)，离心（12000 r/min，10 min），所获得的上清即为抗菌物质粗提液；

（2）抗菌活性物质纯品的制备

获得抗菌物质粗提液采用高压液相色谱仪Dionex Ultimate 3000 system分析：

主要技术参数：

色谱柱：Agilent C18反相柱 (250 mm×4.6 mm，5 μL)；

流动相：ddH₂O (0.1% TFA)和乙腈；

流动相条件：0-60 min，10%-90%乙腈梯度洗脱；

检测波长：220 nm；

流速：1 mL/min；

将60 min内出现的色谱峰全部收集，用琼脂扩散法检测收集液对金葡菌ATCC43300的抗菌活性，判断出抗菌物质保留时间。如图3A所示，色谱峰A对金葡菌ATCC43300具有抗菌活性。我们重复上述液相流程并多次收集色谱峰A，再经旋干、冻干处理，获得的粉末称重，并溶于20%乙腈(pH 5.0)。

（3）抗菌活性物质的一级质谱分析

将以上制备的色谱峰A中活性物质于质谱仪Agilent Technologies 6540 UDHAccurate-Mass Q-TOF LC/MS测定它们的分子量。

一级质谱分析条件：

毛细管电压：3500 V；

喷雾压力：35 lb/in2 gauge；

干燥气流速：9 liters/min；

温度：350℃；

Q-TOF 扫描范围：100-3000 m/z；

数据采集速率：1 spectrum/s。

如图3B所示，色谱峰A中包含1种物质，分子量为5652.0688 Da(monoisotopic)。该活性物质与上述XIN-TL12菌株基因组中假定细菌素Bacin A2（5623.9998 Da）（monoisotopic）分子量大28 Da，这暗示XIN-TL12产生的抗菌活性产物是细菌素Bacin A2经甲酰化修饰后产物（分子量增加28 Da）。

为验证该推测，我们对XIN-TL12产生的抗菌活性产物进行了二级质谱分析及N端测序分析。使用PPSQ-33A 蛋白N端测序仪测定 (Shimadzu Co., Ltd, Kyoto, Japan) 对XIN-TL12菌株的抗菌活性产物进行N端氨基酸序列测定。该活性物质并未获得测序结果，这说明XIN-TL12的抗菌活性产物的N端的氨基发生了修饰反应。另外，二级质谱分析显示XIN-TL12的抗菌活性产物断裂后产生的一系列多肽与预测的细菌素Bacin A2的相应位置断裂后多肽的分子量相差28 Da (b2、b3、b35-b47)，这进一步证明了XIN-TL12产生的抗菌活性产物即发生过甲酰化的细菌素Bacin A2，其第一个氨基酸为甲酰甲硫氨酸（fMet）（图3C）。另外，该活性产物的氨基酸序列通过BlastP分析，其与已鉴定、报道的细菌素的氨基酸序列均无同源性，说明它是一种新颖细菌素，属发明人首次鉴定报道。

实施例5：细菌素Bacin A2对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300的最低抑菌浓度（MIC）的测定

将上述获得的Bacin A2纯品制成终浓度为（0.5，1，2，4，8 μM）的试验样品。利用上述介绍的琼脂扩散法检测不同浓度下的Bacin A2对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300的最低抑菌浓度（MIC）。经测定Bacin A2对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300的最低抑菌浓度为1 μM（图4）。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种产细菌素的芽胞杆菌(Bacillus sp.)XIN-TL12，其特征在于，保藏编号：CCTCCNO：M 2021718。

2.一种产自权利要求1所述芽胞杆菌XIN-TL12的细菌素，其特征在于，所述细菌素具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，且该氨基酸序列的N末端修饰有甲酰基。

3.权利要求2所述的细菌素的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、挑取XIN-TL12单个菌落接种于培养基内，30℃，220r/min培养8h，将发酵液离心并用大孔吸附树脂过柱吸附，吸附后的柱料依次用ddH₂O和质量百分比浓度30％的乙醇溶液冲洗，最后用质量百分比浓度80％的乙醇溶液将活性物质洗脱下来，洗脱液经浓缩、冻干处理得到干粉，获得的干粉溶于质量百分比浓度50％的乙腈溶液，离心，所获得的上清即为粗提液；

S2、采用高效液相色谱对粗提液分离，自动进样，跑样，收集主要色谱峰经旋干、冻干处理得到SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列N末端修饰甲酰基的细菌素。

4.根据权利要求3所述的细菌素的提取方法，其特征在于，S2中，色谱条件为：

色谱柱：Agilent C18反相柱，250mm×4.6mm，5μL；

流动相：A相为含0.1％TFA的ddH₂O，B相为乙腈；

流动相条件：0-60min，10％-90％乙腈梯度洗脱；

检测波长：220nm；

流速：1mL/min。

5.权利要求2所述的细菌素在制备抑菌剂中的应用，其特征在于，该抑菌剂抑制金黄色葡萄球菌。

6.权利要求2所述的细菌素在制备用于治疗金黄色葡萄球菌染性疾病的药物中的应用。

7.一种用于治疗金黄色葡萄球菌染性疾病的药物，其特征在于，包含权利要求2所述的细菌素，还包含一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。