JP2020533014A - 可溶性組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(rh−bFGF)を生産する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
槽投入前OD600:約0.5〜4.5
菌体培養温度:約25〜45℃
菌体誘導温度:約20〜50℃
pH範囲:約6.8〜8.5
グルコース濃度:約0.06〜0.46%
誘導剤濃度:約0.0125〜0.0925g/L
誘導前のOD600の範囲:約10〜45
誘導時間:約2〜9時間
タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、天然のヒトbFGFをコードするcDNA配列(SEQ ID NO:4)を変異させ、3種類の変異cDNA配列を設計および合成した(それぞれ、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3に示す、変異cDNA配列1、変異cDNA配列2および変異cDNA配列3)。
atg gct gct ggt tcg att acg acg ctg ccg gct ctg ccg gaa gat ggt ggt tca ggt gca ttt ccg ccg ggt cac ttt aag gat ccg aaa cgt ctg tat tgc aag aac ggc ggc ttt ttc ctg cgc att cat ccg gat ggc cgt gtc gac ggt gtg cgc gaa aaa agc gat ccg cac att aag ctg cag ctg caa gca gaa gaa cgt ggc gtg gtt agc atc aaa ggt gtt tgt gcg aac cgt tac ctg gcc atg aaa gaa gat ggc cgc ctg ctg gct agt aag tgc gtc acc gac gaa tgc ttt ttc ttt gaa cgt ctg gaa tcc aac aat tat aat acc tac cgt agc cgc aaa tat acg tct tgg tat gtg gcc ctg aaa cgc acg ggc cag tat aag ctg ggt tcc aaa acg ggt ccg ggt caa aaa gcc att ctg ttc ctg ccg atg tcc gca aaa tca taa
atg gct gct ggt tct atc acc acc ctg ccg gct ctg ccg gaa gac ggt ggt tct ggt gct ttc ccg ccg ggt cac ttc aaa gac ccg aaa cgt ctg tac tgc aaa aac ggt ggt ttc ttcctg cgt atc cac ccg gac ggt cgt gtt gac ggt gtt cgt gaa aaa tct gac ccg cac atc aaa ctg cag ctg cag gct gaa gaa cgt ggt gtt gtt tct atc aaa ggt gtt tgc gct aac cgt tac ctg gct atg aaa gaa gac ggt cgt ctg ctg gct tct aaa tgc gtt acc gac gaa tgc ttc ttc ttc gaa cgt ctg gaa tct aac aac tac aac acc tac cgt tct cgt aaa tac acc tct tgg tac gtt gct ctg aaa cgt acc ggt cag tac aaa ctg ggt tct aaa acc ggt ccg ggt cag aaa gct atc ctg ttc ctg ccg atg tct gct aaa tct taa
atg gca gcc ggt agc atc acc acc ctg ccg gcc ctg ccg gag gat ggc ggc agc ggc gcc ttc ccg ccg ggc cac ttc aag gac ccg aag cgt ctg tac tgc aaa aac ggt ggc ttc ttc ctg cgc atc cac ccg gac ggc cgt gtt gac ggt gtc cgt gag aag agc gac cct cac atc aag ctg caa ctg caa gca gaa gag cgt ggt gtt gtg tct atc aaa ggt gtg tgt gct aac cgt tac ctg gct atg aag gaa gat ggt cgt ctg ctg gct tct aaa tgt gtt acc gat gag tgt ttc ttt ttt gaa cgt ctg gaa tct aac aac tac aac act tac cgt tct cgt aaa tac acc tct tgg tat gtg gca ctg aaa cgt act ggt cag tat aaa ctg ggt tcc a aa acc ggt cct ggt cag aaa gct atc ctg ttt ctg cca atg tct gct aag agc taa
2.1 発現および精製
使用する発現ベクターは、pET−30a(+)(図1参照)とし、メルク社(Merk KgsA)から購入した(Cat.No.69909−3)。当該ベクターは、T7プロモーター、T7転写開始部位、Hisタグ、コード配列、Sタグコード配列、マルチクローニングサイト(Multiple cloning sites,MCS)、T7ターミネーター、ラクトースコード配列、kan耐性コード配列、ならびに、pBR322レプリコンおよびf1レプリコンを有する。また、当該MCSは、酵素切断部位XhoI、NotI、EagI、HindIII、SalI、SacI、EcoRI、BamHI、EcoRV、NcoI、KpnI、BglII、NspV、NdeIを有する。
槽投入前OD600:0.5〜4.5
菌体培養温度:25〜45℃
菌体誘導温度:20〜50℃
pH範囲:6.8〜8.5
グルコース濃度:0.06〜0.46%
誘導剤濃度:0.0125〜0.0925g/L
誘導前のOD600の範囲:10〜45
誘導時間:2〜9時間
15%のSDS−PAGE電気泳動の結果、取得したヒトbFGFタンパク質は約18.5KDの単一のバンドを示した(図2参照)。また、C8逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる検出結果から、本発明で取得したヒトbFGFの純度は95%を超えることが分かった(図3参照)。
balb/c3T3細胞を使用し、サンプルについてin vitroでの活性検査を行った。また、MTT法で細胞増殖の状況を判断した。その結果、取得したヒトbFGFは、balb/c3T3細胞に対する増殖促進作用がbFGF活性標準品(NISCB)と一致することが分かった(図6参照)。
医薬組成物1:
組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 2500〜10000IU
ヒト血清アルブミン 0.025〜0.375mg/mL
増粘剤 5.0〜15.0mg/mL
塩化ナトリウム 5.0〜12.5mg/mL
ヘパリンナトリウム 0.25〜5.0μg/mL
リン酸二水素ナトリウム 0.25〜1.25mg/mL
リン酸水素二ナトリウム 1.25〜3.75mg/mL
(1)ポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、121℃下において30分間高圧滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
(2)組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト血清アルブミン、ヘパリンナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムを適量の注射用水に溶解し、0.22μmのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
(3)ステップ(1)およびステップ(2)で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、注射用滅菌水で定容した。
(4)吹き込み(ブローイング)、充填(フィリング)、密封(シーリング)を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量0.4mLで一体的に充填し、完成品を取得した。
組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 2500〜10000IU
ヒト血清アルブミン 0.1〜0.375mg/mL
ヘパリンナトリウム 25.0〜75.0μg/mL
カルボマー 1.25〜12.5mg/mL
中和剤 1.25〜12.5mg/mL
グリセリン 12.5〜50mg/mL
(1)カルボマーを適量の注射用水中に分散し、均一に撹拌したあと一晩膨潤させて準備した。
(2)カルボマー分散液にトリエタノールアミンを添加し、透明かつ均一なゲル基質となるまで攪拌した。これを121℃下において30分間高圧滅菌し、滅菌完了後に室温まで冷まして準備した。
(3)室温の注射用水を適量取り、グリセリン、ヒト血清アルブミン、ヘパリンナトリウム、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した。これを均一に攪拌したあと、無菌条件下で0.22μmのろ過膜に通し、ステップ(2)のゲル基質と混合してから定量して、均一に攪拌した。
(4)吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌ゲルを充填量0.4gで一体的に充填し、完成品を取得した。
組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 1000〜9000IU
ヒト血清アルブミン 0.01〜5.0mg/mL
増粘剤 0.1〜20.0mg/mL
リン酸二水素ナトリウム 0.2〜2.5mg/mL
リン酸水素二ナトリウム 0.5〜5.0mg/mL
塩化ナトリウム 1.0〜5.0mg/mL
保湿剤 0.1〜50.0mg/mL
(1)増粘剤、塩化ナトリウムを適量の注射用水に分散・溶解させて、121℃下において30分間高圧滅菌した。
(2)組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト血清アルブミン、保湿剤、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムを適量の注射用水に溶解した。
(3)ステップ(2)の薬液を0.22μmの微孔性ろ過膜でろ過したあと、ステップ(1)で得た薬液と混合し、注射用水を用いて1mLとなるよう定容した。
(4)ステップ(3)で得た薬液を、静菌剤を含有しない包装容器に充填した。容器の容積範囲は0.4g/個とし、完成品を取得した。
(1)1.0gのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
(2)組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子500000IU、ヒト血清アルブミン25mg、ヘパリンナトリウム2.5mg、塩化ナトリウム800mg、リン酸二水素ナトリウム42.5mg、リン酸水素二ナトリウム250mgを適量の注射用水に溶解し、0.22μmのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
(3)ステップ(1)およびステップ(2)で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で100mLとなるよう定容した。
(4)吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量0.4mLで一体的に充填し、完成品を取得した。
(1)0.5gのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
(2)組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子500000IU、ヒト血清アルブミン20mg、ヘパリンナトリウム2.0mg、塩化ナトリウム800mg、リン酸二水素ナトリウム42.5mg、リン酸水素二ナトリウム250mgを適量の注射用水に溶解し、0.22μmのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
(3)ステップ(1)およびステップ(2)で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で100mLとなるよう定容した。
(4)吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量0.4mLで一体的に充填し、完成品を取得した。
(1)1.0gのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
(2)組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子420000IU、ヒト血清アルブミン20mg、ヘパリンナトリウム2.0mg、塩化ナトリウム800mg、リン酸二水素ナトリウム42.5mg、リン酸水素二ナトリウム250mgを適量の注射用水に溶解し、0.22μmのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
(3)ステップ(1)およびステップ(2)で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で100mLとなるよう定容した。
(4)吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量0.4mLで一体的に充填し、完成品を取得した。
(1)1.5gのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
(2)組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子420000IU、ヒト血清アルブミン10mg、ヘパリンナトリウム1.0mg、塩化ナトリウム800mg、リン酸二水素ナトリウム42.5mg、リン酸水素二ナトリウム250mgを適量の注射用水に溶解し、0.22μmのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
(3)ステップ(1)およびステップ(2)で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で100mLとなるよう定容した。
(4)吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量0.4mLで一体的に充填し、完成品を取得した。
(1)1.0gのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
(2)組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子420000IU、ヒト血清アルブミン20mg、ヘパリンナトリウム2.0mg、塩化ナトリウム800mg、クエン酸370.6mg、リン酸水素二ナトリウム5.9gを適量の注射用水に溶解し、0.22μmのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
(3)ステップ(1)およびステップ(2)で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で100mLとなるよう定容した。
(4)吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量0.4mLで一体的に充填し、完成品を取得した。
(1)1.0gのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
(2)組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子500000IU、ヒト血清アルブミン25mg、ヘパリンナトリウム2.5mg、塩化ナトリウム800mg、クエン酸370.6mg、リン酸水素二ナトリウム5.9gを適量の注射用水に溶解し、0.22μmのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
(3)ステップ(1)およびステップ(2)で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で100mLとなるよう定容した。
(4)吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量0.4mLで一体的に充填し、完成品を取得した。
(1)0.80gのカルボマー940を計量し、適量の室温の注射用水に分散した。そして、60〜120min攪拌し、一晩膨潤させて準備した。
(2)カルボマー940分散液にトリエタノールアミン0.60gを添加し、透明かつ均一なゲル基質となるまで攪拌した。次に、これを湿熱滅菌(121℃、30分間)し、滅菌完了後に室温まで冷まして準備した。
(3)室温の注射用水を適量取り、グリセリン2.50g、ヒト血清アルブミン30.0mg、ヘパリンナトリウム7.0mg、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子450000IUを添加した。これを均一に攪拌したあと、無菌条件下で0.22μmのろ過膜に通し、ステップ(2)のゲル基質と混合してから定量して、均一に攪拌した。
(4)吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌ゲルを充填量0.4gで一体的に充填し、完成品を取得した。
(1)0.60gのカルボマー940を計量し、適量の室温の注射用水に分散した。そして、60〜120分間攪拌し、一晩膨潤させて準備した。
(2)カルボマー940分散液にトリエタノールアミン0.50gを添加し、透明かつ均一なゲル基質となるまで攪拌した。次に、これを湿熱滅菌(121℃、30分間)し、滅菌完了後に室温まで冷まして準備した。
(3)室温の注射用水を適量取り、グリセリン2.50g、ヒト血清アルブミン30.0mg、ヘパリンナトリウム7.0mg、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子420000IUを添加した。これを均一に攪拌したあと、無菌条件下で0.22μmのろ過膜に通し、ステップ(2)のゲル基質と混合してから定量して、均一に攪拌した。
(4)吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌ゲルを充填量0.4gで一体的に充填し、完成品を取得した。
(1)0.60gのカルボマー974を計量し、適量の室温の注射用水に分散した。そして、60〜120分間攪拌し、一晩膨潤させて準備した。
(2)カルボマー974分散液にトリエタノールアミン0.50gを添加し、透明かつ均一なゲル基質となるまで攪拌した。次に、これを湿熱滅菌(121℃、30分間)し、滅菌完了後に室温まで冷まして準備した。
(3)室温の注射用水を適量取り、グリセリン2.50g、ヒト血清アルブミン30.0mg、ヘパリンナトリウム7.0mg、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子450000IUを添加した。これを均一に攪拌したあと、無菌条件下で0.22μmのろ過膜に通し、ステップ(2)のゲル基質と混合してから定量して、均一に攪拌した。
(4)吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌ゲルを充填量0.4gで一体的に充填し、完成品を取得した。
(1)0.50gのカルボマー974を計量し、適量の室温の注射用水に分散した。そして、60〜120min攪拌し、一晩膨潤させて準備した。
(2)カルボマー974分散液にトリエタノールアミン0.50gを添加し、透明かつ均一なゲル基質となるまで攪拌した。次に、これを湿熱滅菌(121℃、30min)し、滅菌完了後に室温まで冷まして準備した。
(3)室温の注射用水を適量取り、グリセリン2.50g、ヒト血清アルブミン20.0mg、ヘパリンナトリウム5.0mg、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子420000IUを添加した。これを均一に攪拌したあと、無菌条件下で0.22μmのろ過膜に通し、ステップ(2)のゲル基質と混合してから定量して、均一に攪拌した。
(4)吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌ゲルを充填量0.4gで一体的に充填し、完成品を取得した。
1)rh−bFGF原液の安定性に対するアミノ酸の影響研究
rh−bFGF原液自体は性質が不安定なため、室温下で重合および沈殿が発生しやすい。そこで、異なる安定剤を用い、原液の安定性につきスクリーニングを行った。5%および2%のマンニトール、5%および2%のグリシン、ならびに2%のデキストランを用い、25℃環境下で17日間放置した。そして、0日目、7日目および17日目にそれぞれタンパク質濃度を検査した。結果を表3に示す。
さらに、異なるアミノ酸(グリシン、ヒスチジン、アルギニン)とツイーン20を用い、原液の安定性について更なるスクリーニングを行った。25℃環境下で18時間放置した結果を図7に示す。
HSAはタンパク質含有量の測定に干渉するため、HSA含有または非含有の原液を25℃環境下で18時間放置し、熱破壊されたタンパク質の純度変化を高分解能クロマトグラフィーで検出した。結果を図8に示す。
本研究では、ニュージーランドラビットの眼球乾燥症モデルを用い、モデルの臨床指標(涙液分泌、涙膜破壊時間)を観察して、眼球乾燥症に対する薬物の臨床治療効果を評価した。ニュージーランドラビットを、陰性対照群(Negative control,未処置)、モデル対照群(Model,アルカリ熱傷処置を施すが点眼液は一切投与しない)、ヒアルロン酸ナトリウム点眼液治療群(HA group)、および、使用する調製実施例3におけるrh−bFGF点眼液の濃度に基づき分類した群D(4.0μg/mL)、E(8.0μg/mL)、F(16.0μg/mL)、G(32.0μg/mL)に分けた。陰性対照群は1群あたり72羽とし、残りの群はいずれも1群あたり8羽とした。また、投与量は300μl/目(片目)/日とした。
シルマーIテスト(Schirmer I test)によって、ニュージーランドラビットの涙液分泌を測定した。即ち、眼科用ピンセットでフェノールレッド綿糸を固定し、ニュージーランドラビットの外眼角部に置いた。そして、60秒後に取り出して、フェノールレッド綿糸の湿潤長さを測定した。フェノールレッド綿糸は湿潤することで赤色に変化するため、湿潤長さに基づいて目の湿潤状況を判定した。実験結果を図9に示す。
調節可能ピペットを用い、ニュージーランドラビットの目の下の結膜嚢に2μlの0.5%フルオレセインナトリウム溶液を滴下した。次に、手を用いて一定の力で数回まばたきさせたあと、一定の力で目を開かせ、細隙灯顕微鏡を用いてコバルトブルー光により角膜を観察した。そして、角膜の緑色の膜に黒い部分が現れたとき、涙膜が破壊されたとみなした。連続3回測定し、平均値を取った。涙膜破壊時間が10秒未満の場合には、涙膜が不安定であることを意味した。即ち、このことは涙液中のムチン不足に起因するKCSの明らかな特徴であり、結膜の杯細胞が深刻な損傷を受けたか喪失しており、眼球乾燥症が生じやすいことを意味した。図10に実験結果を示す。
Claims (11)
- 可溶性組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(rh−bFGF)を生産する方法であって、変異核酸分子を含む宿主細胞を培養すること、rh−bFGFの発現に適した条件で宿主細胞中にrh−bFGFを発現させること、および、精製によりrh−bFGFを回収することを含む方法。
- 前記変異核酸分子は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:3から選択される配列、または、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:3と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有する配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記変異核酸分子の配列が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:3である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記宿主細胞が大腸菌である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法で得られる、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(rh−bFGF)。
- 組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子をコードする変異核酸分子であって、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:3から選択される配列、または、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:3と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有する配列を含む、変異核酸分子。
- 配列が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:3である、請求項6に記載の変異核酸分子。
- 請求項6または7に記載の変異核酸分子を含むベクター。
- 前記ベクターがpET−30a(+)である、請求項8に記載のベクター。
- 請求項5に記載のヒト塩基性線維芽細胞増殖因子と、少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含有する、医薬組成物。
- 請求項10に記載の医薬組成物の治療上の有効量を治療を必要とする患者に対して投与することを含む、眼球乾燥症の治療方法。
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