KR101532025B1

KR101532025B1 - 신규의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제를 이용한 아밀로펙틴 클러스터 제조방법

Info

Publication number: KR101532025B1
Application number: KR1020140045788A
Authority: KR
Inventors: 심재훈
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2014-04-17
Filing date: 2014-04-17
Publication date: 2015-06-29

Abstract

본 발명은 신규의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase)를 이용한 아밀로펙틴 클러스터 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 적은 양의 효소를 이용하여 짧은 반응시간으로 아밀로펙틴 클러스터를 제조할 수 있다.

Description

신규의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제를 이용한 아밀로펙틴 클러스터 제조방법{Method for production of amlylopectin cluster with novel cyclodextrin glucanotransferase}

본 발명은 효소적 처리로 아미로펙틴 클러스터를 제조하는 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 아미노산 3개를 돌연변이 시킨 신규의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase)를 이용한 아밀로펙틴 클러스터 제조방법에 관한 것이다.

전분은 일반적으로 고등식물의 세포에 존재하는 결정형의 물질로 일종의 저장성 탄수화물로서, 쌀, 보리, 밀 등의 곡류와 감자, 고구마 등의 서류의 주성분으로 동식물의 주요 에너지원이다.

전분은 다수의 포도당 분자가 α-1,4 또는 α-1,6의 글리코시드 결합 (glycosidic linkage)을 형성하는 천연 고분자 물질로서, α-1,4 결합에 의해 연결된 직쇄의 중간 중간에 다른 포도당 분자가 α-1,6 결합의 가지를 지닌 아밀로펙틴과 α-1,4 결합으로 α-나선형(α-helical form)의 입체구조를 지닌 아밀로오스로 나뉜다. 이중 아밀로펙틴은 24~30개의 포도당마다 α-1,6 결합을 지니며, 이로 인해 아밀로오스에 비하여 물에 비교적 잘 녹으며, 상대적으로 많은 비환원성 말단 부위를 지니게 되어 소화효소의 작용에 유리하다.

전분 입자의 크기는 전분이 유래하는 식물의 종에 따라 다르며, 형태 또한 원형, 타원형, 렌즈형, 다각형 등으로 식물의 종류에 따라 다양하다. 하지만, 대부분의 전분은 결정화 구조에서 결정성 층과 무정형 층을 나타내며, 아밀로펙틴은 클러스터 단위체 형태로 결정성 층에 밀집되어 존재한다 (Myers AM, Morell MK, James MG, Ball SG. 2000. Recent progress toward understanding biosynthesis of the amylopectin crystal. Plant Physiol 122: 989-997).

비록 전분이 생명체의 주 에너지원이며, 인간 역시 탄수화물을 주된 영양원으로 하고 있으나, 과도한 탄수화물 섭취는 비만과 당뇨를 야기한다. 이러한 문제점들은 섭취하는 탄수화물의 구조를 변형함으로써 소화속도를 늦추고, 혈당의 급격한 증가를 억제함으로써 개선될 수 있다.

이에 따라 많은 연구가 전분의 구조를 물리적, 화학적 그리고 효소적 방법을 이용하여 변형시키고자 진행되어 왔으며, 이중 효소적 방법은 물리적, 화학적인 방법에 비하여 공정상 부반응이 적으며, 에너지 소모가 적고 구조를 특이적으로 조절할 수 있는 장점이 있다. 최근까지 전분의 구조를 변형하기 위한 많은 효소적 방법이 시도되었는데, 그 대표적인 예로는 4-α-글루카노트랜스퍼라아제(4-α-glucanotransferase, 4-α-GTase), 말토제닉 아밀라아제(maltogenic amylase, MAase), 가지화 효소 (branching enzyme, BE), 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제 (cyclodextrin glucanotransferase, CGTase) 등이 있다 (Park JH, Kim HJ, Kim YH, Cha H, Kim YW, Kim TJ, Kim YR, Park KH. 2007. The action mode of Thermus aquaticus YT-1 4-a-glucanotransferase and its chimeric enzymes introduced with starch-binding domain on amylose and amylopectin. Carbohydr Polym 67: 164-173; Lee CK, Le QT, Kim YH, Shim JH, Lee SJ, Park JH, Lee KP, Song SH, Auh JH, Park KH. 2008. Enzymatic synthesis and properties of highly branched rice starch amylose and amylopectin cluster. J Agric Food Chem 56: 126-131; Seo NS, Roh SA, Auh JH, Park JH, Kim YR, Park KH. 2007. Structural characterization of rice starch in rice cake modified by Thermus scotoductus 4-alpha-glucanotransferase (TS alpha GTase). J Food Sci 72: C331-336; Shim JH, Seo NS, Roh SA, Kim JW, Cha H, Park KH. 2007. Improved bread-baking process using Saccharomyces cerevisiae displayed with engineered cyclodextrin glucanotransferase. J Agric Food Chem 55: 4735-4740; Shim JH, Kim YW, Kim TJ, Chae HY, Park JH, Cha H, Kim JW, Kim YR, Schaefer T, Spendler T, Moon TW, Park KH. 2004. Improvement of cyclodextrin glucanotransferase as an antistaling enzyme by error-prone PCR. Protein Eng Des Sel 17: 205-211; Lee SH, Kim YW, Lee S, Auh JH, Yoo SS, Kim TJ, Kim JW, Kim ST, Rho HJ, Choi JH, Kim YB, Park KH. 2002. Modulation of cyclizing activity and thermostability of cyclodextrin glucanotransferase and its application as an antistaling enzyme. J Agric Food Chem 50: 1411-1415).

그런데, 상기 연구의 대부분은 전분관련 식품에 탄수화물 관련 효소를 첨가하여 빵, 떡 등 완제품의 전분노화를 억제하거나 물성을 개선시키는 연구들이었다. 흥미롭게도, 이 중 이 등(Lee CK, Le QT, Kim YH, Shim JH, Lee SJ, Park JH, Lee KP, Song SH, Auh JH, Park KH. 2008. Enzymatic synthesis and properties of highly branched rice starch amylose and amylopectin cluster. J Agric Food Chem 56: 126-131)의 연구는 4-α-GTase를 이용하여 저분자의 아밀로펙틴 클러스터를 생산하고, 이를 지소화성 기능성탄수화물 소재로 개발한바 있다.

한편, CGTase(cyclodextrin glucanotransferase)는 4-α-GTase와는 달리 세포외 분비 효소이며, 전분 결합 도메인(starch binding domain)을 지니고 있어 효소의 발현 및 정제가 용이하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 먹어도 안전한 균주(GRAS, generally regarded as safe)에서 생산되어 산업적 활용도가 높은 효소이다. 일반적으로 CGTase는 고리화 활성(cyclization activity)을 지니므로 전분으로부터 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 생산에 사용되고 있으나, 분자진화적 기술을 활용하여 전분노화억제효소 및 제빵 효모 개발에 활용된바 있다 (Shim JH, Seo NS, Roh SA, Kim JW, Cha H, Park KH. 2007. Improved bread-baking process using Saccharomyces cerevisiae displayed with engineered cyclodextrin glucanotransferase. J Agric Food Chem 55: 4735-4740; Shim JH, Kim YW, Kim TJ, Chae HY, Park JH, Cha H, Kim JW, Kim YR, Schaefer T, Spendler T, Moon TW, Park KH. 2004. Improvement of cyclodextrin glucanotransferase as an antistaling enzyme by error-prone PCR. Protein Eng Des Sel 17: 205-211; Lee SH, Kim YW, Lee S, Auh JH, Yoo SS, Kim TJ, Kim JW, Kim ST, Rho HJ, Choi JH, Kim YB, Park KH. 2002. Modulation of cyclizing activity and thermostability of cyclodextrin glucanotransferase and its application as an antistaling enzyme. J Agric Food Chem 50: 1411-1415).

하지만, 아직까지 CGTase를 이용하여 아밀로펙틴 클러스터를 생산하는 방법에 대한 연구는 전해 개시된 바 없는 실정이다.

대한민국 특허등록번호 제10-0868329호(등록일자 2008년 11월 05일)에는, 효소를 이용한 고분지 아밀로펙틴 클러스터 및 고분지 아밀로오스의 제조방법이 기재되어 있다. 이 문헌에 의하면, 알파글루카노트랜스퍼라아제 또는 브랜칭엔자임이 전분에 존재하는 아밀로펙틴 클러스터간의 연결사들을 가수분해하여 아밀로펙틴 클러스터를 생산하는 동시에 브렌칭엔자임이 아밀로오스에 분지측쇄사슬을 부착시켜 분지 아밀로오스를 제조하고, 여기에 말토제닉 아밀라아제를 처리하여 상기로부터 생성된 아밀로펙틴 클러스터 및 분지 아밀로오스의 긴 측쇄를 절단하여 짧은 측쇄로 만드는 동시에 측쇄에 알파-1,6-결합으로 당을 전이시킴으로써 전분으로부터 고분지 아밀로펙틴 클러스터, 고분지 아밀로오스 또는 분지 올리고당을 효과적으로 제조할 수 있는 방법이 기재되어 있다.

본 발명은 신규의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase)를 이용하여 아밀로펙틴 클러스터를 제조하는 방법을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 아밀로펙틴을 함유하는 전분에, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase)를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 아밀로펙틴 클러스터(amylopection cluster)의 제조방법을 제공하는데, 아밀로펙틴은 전분의 구성 성분으로서, α-1,4 글리코시드 결합 이외에 β-1,6 글리코시드 결합에 의해 24~30개의 포도당마다 가지가 생겨 분지 형태의 구조를 가진다. 이로 인해 아밀로오스에 비하여 물에 비교적 잘 녹으며, 상대적으로 많은 비환원성 말단 부위를 지니게 되어 소화효소의 작용에 유리하다.

아밀로펙틴클러스터는 아밀로펙틴 구성의 기본적인 형태로서 α-1,4 글리코시드 결합 이외에 α-1,6 글리코시드 결합을 지니며, 평균 분자량이 10⁴ Da에서 10⁵ Da에 이르는 고분자 물질로, 아밀로펙틴과 유사하나 평균 분자량이 아밀로펙틴(10⁹ Da)보다 현저히 작아 아밀로펙틴에 비하여 상대적으로 물에 잘 녹으므로 다양한 식품소재로 활용가능하다. 또한, 아밀로펙틴 클러스터는 고분자 분지구조를 지니는 물질이므로 포도당, 설탕 등의 일반적인 단당류, 소당류와는 달리 체내에 직접적으로 흡수되지 않고 소화효소의 작용을 거쳐야 한다. 따라서 지소화성을 지니는 식품의 기본적인 소재로 사용하기 위한 연구가 진행되고 있다((Lee CK, Le QT, Kim YH, Shim JH, Lee SJ, Park JH, Lee KP, Song SH, Auh JH, Park KH. 2008. Enzymatic synthesis and properties of highly branched rice starch amylose and amylopectin cluster. J Agric Food Chem 56: 126-131).

한편, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 야생형 CGTase의 아미노산 서열 중, M234T, F259I, V591A의 변이를 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이형 CGTase를 이용함에 특징이 있다.

본 발명의 서열번호 2에 기재된 돌연변이형 CGTase를 이용할 경우, 적은 효소량을 사용하여, 짧은 반응시간에도 10⁴~10⁵Da의 크기를 가지는 아밀로펙틴 클러스터를 효과적으로 수득할 수 있다. 종래 4-α-글루카노트랜스퍼라아제(4-α-glucanotransferase, 4-α-GTase)를 이용한 아밀로펙틴 클러스터 제조는 다량의 효소를 첨가하여 1시간 이상 반응시켜야 함에 비해 본 발명에서는 적은 효소량을 사용하여 짧은 시간에 아밀로펙틴 클러스터를 제조할 수 있다.

한편, 본 발명의 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법에 있어서, 상기 전분은 바람직하게 호화된 전분인 것일 수 있다. 전분의 호화는 전분에 물을 첨가하고 끓임으로써 제조할 수 있다.

한편, 본 발명의 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법에 있어서, 상기 반응은 바람직하게 40~60℃에서 3~15분 동안 수행하는 것이 좋다. 본 발명의 서열번호 2에 기재된 CGTase는 40~60℃에서 최적의 활성을 보이기 때문이다.

한편, 본 발명의 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법에 있어서, 상기 반응은, 바람직하게 온도를 80℃ 이상으로 올려 반응을 종결시키는 것이 좋다. 효소의 반응을 정지시키는 방법으로는 효소를 실활시키기 위하여 산 또는 알칼리를 첨가하는 방법도 있다. 하지만, 이와 같은 방법은 몸에 유해한 산 또는 알칼리를 사용하기 때문에 바람직하지 않은데, 본 발명의 CGTase 효소는 80℃ 이상에서 그 활성이 급격히 낮아지기 때문에 온도 조절에 의해 반응을 종결시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 80~170℃로 올려 반응을 종결시키는 것이 좋다. 170℃ 이상으로 올리면 메일라르 반응 (maillard reaction)이 일어나 색이 변하거나 이취가 발생할 수 있기 때문이다.

본 발명에 의할 경우, 신규의 돌연변이형 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase)를 이용하여 아밀로펙틴 클러스터를 효과적으로 제조할 수 있다.

기존 연구에서는 아밀로펙틴 클러스터 생산을 위하여 4-a-GTase를 사용하였는데, 사용된 효소의 양은 야생형 CGTase를 기준으로 10배 이상이며, 반응시간도 1시간 이상이 소요되었다 (Lee CK, Le QT, Kim YH, Shim JH, Lee SJ, Park JH, Lee KP, Song SH, Auh JH, Park KH. 2008. Enzymatic synthesis and properties of highly branched rice starch amylose and amylopectin cluster. J Agric Food Chem 56: 126-131; Seo NS, Roh SA, Auh JH, Park JH, Kim YR, Park KH. 2007. Structural characterization of rice starch in rice cake modified by Thermus scotoductus 4-alpha-glucanotransferase (TS alpha GTase). J Food Sci 72: C331-336). 하지만, 본 발명에서와 같이 돌연변이형 CGTase를 사용할 경우, 첨가량을 현저히 줄일 수 있는 매우 경제적이다.

하기 본 발명의 실험에서 야생형 CGTase 효소가 본 발명의 돌연변이형 CGTase 효소에 비해 다소 높은 반응 속도를 보이는 것처럼 나타났으나, 사용된 효소량을 살펴보자면, 본 발명의 돌연변이형 CGTase가 야생형 CGTase에 비해 15배가량 적은 양을 사용하여 비슷한 수준의 실험 결과를 보였으므로, 본 발명의 돌연변이형 CGTase가 야생형 CGTase에 비해 경쟁력이 있고, 더 나아가 4-a-GTase에 비해 훨씬 더 경쟁력이 있는 것이다.

본 발명에서는 분자량별로 다양한 식품 소재가 될 수 있는 아밀로펙틴 클러스터의 효율적인 생산법을 제시하였고, 이 결과들은 식품 및 전분 소재 산업에서 효과적으로 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase의 SDS-PAGE(sodium-dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 분석결과이다. 레인 M은 사이즈 마커(size marker), 레인 1은 야생형 CGTase, 레인 2는 돌연변이형 CGTase를 의미한다.
도 2는 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase의 반응 온도 프로파일 결과이다.
도 3은 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase 처리에 따른 찹쌀 전분 평균분자량 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase가 처리된 찹쌀 전분의 SEC-MALLS-RI 크로마토그램 결과이다.
도 5는 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase가 처리된 찹쌀 전분의 MALDI-TOF MS 분석 결과이다. (A)는 야생형 CGTase에 대한 그래프이고, (B)는 돌연변이형 CGTase에 대한 그래프이다. 'CA'는 사이클로아미로즈, 'MD'는 말토덱스트린을 의미하며, '*'는 중합 정도를 의미한다.
도 6은 아밀로펙틴에 처리된 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase의 가수분해 패턴을 모식화하여 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것이 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 제조예 1: 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase 효소의 생산 및 정제]

서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 야생형 CGTase(wild-type)과 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 돌연변이형 CGTase(mutant-type)은 선행연구에서 얻은 벡터(pR₂CGTI-5, pR₂CGT3-18)를 각각 이용하여 생산하였다(Shim JH, Kim YW, Kim TJ, Chae HY, Park JH, Cha H, Kim JW, Kim YR, Schaefer T, Spendler T, Moon TW, Park KH. 2004. Improvement of cyclodextrin glucanotransferase as an antistaling enzyme by error-prone PCR. Protein Eng Des Sel 17: 205-211.).

각각의 벡터는 CaCl₂ 처리된 이 콜라이(E. coli) MC1061 competent cell[F, araD139, recA13, D(araABCleu) 7696, galU, galK, DlacX74, rpsL, thi, hsdR2, mcrB]에 형질전환 하였다.

형질전환된 균주는 카나마이신(kanamycin)이 선택 마커(selection marker)가 들어있는 2 L의 LB 배지[1%(w/v) 박토-트립톤(Bacto-trpytone), 0.5%(w/v) 효모 추출물(yeast extract), 1%(w/v) NaCl]에서, 진탕배양기를 이용하여 37℃에서 200 rpm으로 각각 24시간 배양하였고, 7,000×g로 4℃에서 10분 동안 원심분리 한 후, 균체를 회수하였다.

회수된 균체는 50 mM의 소디움 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH 6.0)에 재현탁(resuspension)한 뒤 초음파분쇄기(VC-600, Sonics & Materials Inc., USA; output 4~5 min×3 times, 60% duty)를 이용하여 파쇄하였다.

세포 파쇄 후, 9,000×g, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 가용성 조효소를 얻었고, 이를 다시 β-CD 컬럼 크로마토그래피(β-CD column chromatography)를 이용하여 정제하였다.

그 후, 정제된 효소는 10%의 SDS-PAGE(sodium-dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 통하여 그 존재를 확인하였다(도 1). 도 1은 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase의 SDS-PAGE(sodium-dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 분석결과이다. 레인 M은 사이즈 마커(size marker), 레인 1은 야생형 CGTase, 레인 2는 돌연변이형 CGTase를 의미한다.

[ 실험예 1: 효소 역가 측정 및 단백질 정량]

상기 제조예 1에서 제조된 야생형 CGTase와 돌연변이형 CGTase의 역가 측정을 위하여 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 환원당 정량법을 사용하였다.

1% 가용성 전분(Soluble starch, Showa, Tokyo, Japan)을 소디움 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, 50 mM, pH 6.0)에 녹여, 각각의 효소액과 1:1(v/v) 비율로 반응시켰다.

효소가 들어가지 않은 용액을 대조구로 하여 반응을 비교하였고, 10분간 반응 후, 3배의 DNS 용액[3.5-디니트로살리실산(3.5-dinitrosalicylic acid) 10.6 g, NaOH 19.8 g, 나트륨-칼륨-주석산염(Na-K-tartrate) 306 g, 페놀(phenol) 7.6 mL, 메타중아황산나트륨(Na-metabisulfite) 8.3 g, 증류수 1,416 mL]을 넣어 반응을 정지시킨 후, 5분간 끓여 발색하였다.

570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 포도당 용액을 이용하여 표준곡선을 잡았다. 또한, 1 unit(U)은 1분간 1 mol의 글리코시드 결합(glycosidic bond)을 가수분해하는 효소의 양으로 정의하였다. 또한, Bradford법을 이용하여 단백질 정량을 하고, 각각의 효소의 비역가(specific activity)와 정제수율을 확인하였다. 실험 결과 값을 하기 표 1에 나타내었다.

효소	정제 단계 (Purification step)	총 부피 (Total volume, mL)	총 역가 (Total activity, U)	총 단백질 (Total protein, mg)	비역가 (Specific activity , U/mg)	수율 (Yield , %)	정제배수 (Purification, fold)
야생형 CGTase	세포 추출물 (cell extract)	190	232.6	290.8	0.8	100	1
야생형 CGTase	β-CD affinity column	16	61.9	15.1	4.1	26.6	5.1
돌연변이형 CGTase	세포 추출물 (cell extract)	190	4396	472	9.3	100	1
돌연변이형 CGTase	β-CD affinity column	12	800.3	12.7	62.9	18.2	6.8

실험결과, 2 L 배양에서 정상형 CGTase의 경우, 15.1 mg의 효소를 얻었으며, 돌연벼니형 CGTase는 이보다 다소 적은 양인 12.7 mg의 효소를 얻었다. 그러나, 돌연변이형 CGTase는 총 역가(total activity)가 800.3 U로, 야생형보다 적은 효소의 양임에도 불구하고 현저히 높은 활성을 보였다. 이는 돌연변이형 CGTase가 3개의 돌연변이 위치(M234T, F259I, V591A)를 지니며, 이로 인하여 가수분해능이 현저히 높아졌기 때문인 것으로 판단되었다. 또한, 두 효소의 mg당 역가를 나타내는 비역가(specific activity)는 야생형 CGTase와 돌연변이형 CGTase 각각 4.1 U/mg 과 62.9 U/mg이었다.

상기와 같은 결과로부터, 돌연변이형 CGTase가 동일한 조건의 실험에서 야생형 CGTase에 비하여 15배가량 적은 양을 사용하여도 유사한 가수분해능을 지님을 확인할 수 있었다.

[ 실험예 2: 효소의 반응 온도 프로파일( temperature profile ) 확인]

본 실험예에서는 상기 제조예 1에서 얻은 야생형 CGTase와 돌연변이형 CGTase 효소의 반응 온도 프로파일(temperature profile)을 확인하고자 하였다.

상기 두 효소의 최적 온도를 확인하고자, 30~80℃의 온도에서 효소들의 가수분해능을 측정하였다. 온도 조건 외에 다른 실험방법 및 조건은 상기 실험예 1의 가수분해능 측정 방법과 동일하게 하였다.

실험 결과, 야생형 CGTase의 최적 반응 온도는 60℃, 돌연변이형 CGTase의 최적 반응 온도는 50℃로 나타났다. 또한, 상기 두 효소 모두 40~60℃에서 80%의 역가를 나타내었다.

한편, 돌연변이형 CGTase가 야생형 CGTase에 비하여 다소 낮은 최적온도를 나타냈는데, 이는 돌연변이에 의하여 효소의 열안정성이 다소 낮아졌기 때문인 것으로 사료되었다.

또한, 돌연변이형 CGTase의 경우, 80℃에서 역가를 거의 상실하였는데, 이로부터 돌연변이형 CGTase는 아밀로펙틴 클러스터 생산시 발생할 수 있는 과도한 가수분해 반응을, 산 또는 염기의 첨가 없이 열처리로 제어할 수 있음을 의미하는 것이라 확인할 수 있었다(도 2). 도 2는 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase의 반응 온도 프로파일 결과이다.

[ 실시예 1: 아밀로펙틴 클러스터 제조]

본 실시예에서는 상기 제조예 1에서 얻은 야생형 CGTase와 돌연변이형 CGTase 효소를 이용하여 아밀로펙틴 클러스터를 제조하고자 하였다.

200 mL의 5% 찹쌀 전분(waxy rice starch)을 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 6.0)에 넣고, 100℃에서 1시간 동안 호화시켰다. 그 후, 호화 전분을 냉각하고 100 U(1g 기질당 10 unit)의 효소를 각각 넣어 각각의 효소의 최적온도에서 반응시켰다.

반응 후, 생산된 아밀로펙틴 클러스터를 회수하기 위하여, 반응액 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 침전시킨 후, 침전된 물질을 7000×g, 20 분, 4℃에서 원심분리하여 회수한 후, 건조하여 아밀로펙틴 클러스터를 제조하였다.

[ 실험예 3: 아밀로펙틴 클러스터의 평균분자량 측정]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 아밀로펙틴 클러스터의 평균분자량을 측정하고자 하였다.

상기 실시예 1의 조건과 같이, 호화된 찹쌀 전분에 상기 효소들(야생형 CGTase, 돌연변이형 CGTase)을 각각 반응시켜, 반응시간 동안 시료의 평균분자량의 변화를 육안으로 확인하였다.

그 후, 더욱 구체적인 관찰을 위하여, 상기 효소 처리된 전분(시료)을 시간대별로 샘플링하여, 100℃에서 5분간 열처리하여 효소반응을 정지시켰고, 각각의 시료를 SEC-MALLS-RI 분석법으로 평균 분자량을 확인하였다. 여기서 사용한 'SEC-MALLS-RI 분석법'이란 다각도 레이저 빛 산란(multiangle laser light scattering, MALLS, Dawn DSP, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA)을 이용하고, 사이즈 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography, SEC)와 굴절률(refractive index, RI) 검출기(detector, Waters 410, Waters Co., Milford, MA, USA)를 활용하는 방법을 말한다.

또한, SUGAR KS-804 와 KS-806 columns(8×300 mm; Shodex, Kawasaki, Japan)을 연결하여 상온에서 샘플을 분석하였으며, 이동상(0.15 M NaNO₃, 0.02% NaN₃)은 0.4 mL/min의 속도로 이동시켰다. 분석시료를 이동상에 녹인 후, 오토클레이브(121℃, 20 분)를 이용하여 호화시켰다.

시료의 평균분자량은 ASTRA(ver. 4.90.07, Wyatt Technology) 프로그램에서 베리 외삽법(Berry extrapolation)법으로 계산하였고, dn/dc 값은 0.146 mL/g으로 하였다 (Lee CK, Le QT, Kim YH, Shim JH, Lee SJ, Park JH, Lee KP, Song SH, Auh JH, Park KH. 2008. Enzymatic synthesis and properties of highly branched rice starch amylose and amylopectin cluster. J Agric Food Chem 56: 126-131; Seo NS, Roh SA, Auh JH, Park JH, Kim YR, Park KH. 2007. Structural characterization of rice starch in rice cake modified by Thermus scotoductus 4-alpha-glucanotransferase (TS alpha GTase). J Food Sci 72: C331-336).

반응시간에 따른 시료의 육안 관찰결과, 불투명하던 시료는 2분 이후 투명하게 변하는 것을 육안으로 관찰할 수 있었으며, 점도도 낮아짐을 확인하였다(결과값 미도시).

시료의 평균분자량 측정 결과, 반응 5분쯤에 효소들을 처리한 각각의 시료의 평균분자량이 10⁴~10⁵ Da으로, 효소 반응 전 찹쌀 전분의 평균분자량(약 10⁸ Da)에 비해 매우 감소하였음을 확인할 수 있었고, 반응 5분 이후부터는 분자량의 감소 진행이 현저히 줄어들었음을 확인할 수 있었다(도 3). 도 3은 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase 처리에 따른 찹쌀 전분 평균 분자량 변화를 측정한 결과이다.

한편, 급격한 분자량의 감소에도 불구하고 DNS법을 이용한 시료의 환원성말단의 생성량도 낮았으며(100 mol 미만), MALLS 그래프상에서도 거대분자의 피크 이동은 확인되었으나, 소당류의 증가는 미비하였다(도 4). 도 4는 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase가 처리된 찹쌀 전분의 SEC-MALLS-RI 크로마토그램 결과이다.

상기와 같은 결과는, 효소의 가수분해 반응이 아밀로펙틴의 클러스터 단위로 작용하였으며, 클러스터 가수분해 후, 반응이 매우 더디게 일어났음을 의미한다.

[ 실험예 4: 효소 반응 후 생성된 저분자 물질의 분석]

상기 실시예 1 제조 샘플 경우, 동일한 unit의 효소를 사용하였음에도 불구하고 야생형 CGTase와 돌연변이형 CGTase 효소의 찹쌀 전분(waxy rice starch)에 대한 반응을 양상에는 차이가 있었다.

야생형의 경우 돌연변이형에 비하여 시료의 평균 분자량 감소가 상대적으로 빠르게 진행되었음을 알 수 있었다 (표 2).

반응 시간 (min)	아밀로펙틴의 분자량 (Molecular weight of amylopectin, g/mol)
반응 시간 (min)	야생형 CGTase	돌연변이형 CGTase
0.0	7.6e+7	7.6e+7
0.5	1.0e+5	4.2e+6
1.0	7.5e+4	1.9e+6
2.0	4.3e+4	1.2e+6
2.5	3.8e+4	7.8e+5
5.0	2.1e+4	3.4e+5
9.0	1.8e+4	9.5e+4
11.0	1.7e+4	5.8e+4

따라서, 본 실험에서는 보다 명확한 설명과 반응액의 정확한 분석을 위하여, 효소 반응 후 생성된 저분자 물질들에 대하여 MALDI-TOF/MS 분석을 수행하였다

실시예 1의 효소 반응 산물의 분자량 측정을 위하여 MALDI-TOF MS(Voyager TM-DE Perceptive Biosystems, Framingham, MA, USA)을 사용하였고, 분석은 라이너 모드(linear mode)에서 수행하였다.

7 mg/mL 시료를 2,5-디하이드로벤조산(2,5-dihydroxybenzoic acid) 1 mg/mL가 포함된 아세톤니트릴(acetonitril) 용액과 동일한 비율로 혼합하여 2 L 가량 스텐레스 스틸 플레이트(stainless still plate)에 로딩(loading) 후, 건조시켜 분석을 수행하였다.

실험 결과, 야생형 CGTase 처리 시료에서는 m/z 1158(M+Na⁺), 1319, 1643 등 다양한 종류의 사이클릭(cyclic) 형태의 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 및 사이클로아밀로즈(cycloamylose)들의 이온형에 대응하는 피크들이 검출되었다. 하지만, 돌연변이형 CGTase 처리 시료에서는 환원성 말단을 지닌 선형(linear) 형태의 말토덱스트린(maltodextrin)이 검출되었다(도 5, 도 6). 도 5는 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase가 처리된 찹쌀 전분의 MALDI-TOF MS 분석 결과이다. (A)는 야생형 CGTase에 대한 그래프이고, (B)는 돌연변이형 CGTase에 대한 그래프이다. 'CA'는 사이클로아미로즈, 'MD'는 말토덱스트린을 의미하며, '*'는 중합 정도를 의미한다. 도 6은 아밀로펙틴에 처리된 야생형 CGTase 및 돌연변이형 CGTase의 가수분해 패턴을 모식화하여 나타낸 도이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Method for production of amlylopectin cluster with novel cyclodextrin glucanotransferase <130> AP-2014-0058 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 685 <212> PRT <213> alkaliphilic Bacillus sp. I-5 <400> 1 Ala Pro Asp Thr Ser Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp Val 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Ile Phe Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Ala Asn 20 25 30 Asn Pro Thr Gly Ala Ala Phe Asp Gly Ser Cys Thr Asn Leu Arg Leu 35 40 45 Tyr Cys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly 50 55 60 Tyr Leu Thr Gly Met Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val 65 70 75 80 Glu Asn Ile Tyr Ser Val Ile Asn Tyr Ser Gly Val His Asn Thr Ala 85 90 95 Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Ala Tyr 100 105 110 Gly Thr Met Gln Asp Phe Lys Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His 115 120 125 Asn Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala 130 135 140 Ser Ser Asp Asp Pro Ser Phe Ala Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn 145 150 155 160 Gly Asn Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Gln Asn Leu Phe His 165 170 175 His Tyr Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asn Gly Ile Tyr Lys 180 185 190 Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Ser Val Asp 195 200 205 Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ile Lys Met Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp 210 215 220 Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys 225 230 235 240 Ser Phe Met Ser Thr Ile Asn Asn Tyr Lys Pro Val Phe Thr Ile Gly 245 250 255 Glu Trp Phe Leu Gly Val Asn Glu Ile Ser Pro Glu Tyr His Gln Phe 260 265 270 Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln Lys 275 280 285 Ala Arg Gln Val Phe Arg Asp Asn Thr Asp Asn Met Tyr Gly Leu Lys 290 295 300 Ala Met Leu Glu Gly Ser Glu Val Asp Tyr Ala Gln Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Glu Arg Phe His Thr Ser Asn 325 330 335 Gly Asp Arg Arg Lys Leu Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser 340 345 350 Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Tyr Met Ser Gly 355 360 365 Gly Asn Asp Pro Asp Asn Arg Ala Arg Ile Pro Ser Phe Ser Thr Thr 370 375 380 Thr Thr Ala Tyr Gln Val Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser 385 390 395 400 Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Ser Thr Gln Glu Arg Trp Ile Asn Asn 405 410 415 Asp Val Ile Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Asn Asn Val Ala Val Val 420 425 430 Ala Ile Asn Arg Asn Met Asn Thr Pro Ala Ser Ile Thr Gly Leu Val 435 440 445 Thr Ser Leu Pro Gln Gly Ser Tyr Asn Asp Val Leu Gly Gly Ile Leu 450 455 460 Asn Gly Asn Thr Leu Thr Val Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ser Asn Phe 465 470 475 480 Thr Leu Ala Pro Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Thr Asp Ala 485 490 495 Thr Ala Pro Ile Ile Gly Asn Val Gly Pro Met Met Ala Lys Pro Gly 500 505 510 Val Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Ala Ser Ala Arg Gln Gly Thr Val 515 520 525 Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ala Asp Ile Val Ala Trp Glu 530 535 540 Asp Thr Gln Ile Gln Val Lys Ile Leu Arg Val Pro Gly Gly Ile Tyr 545 550 555 560 Asp Ile Arg Val Ala Asn Ala Ala Gly Ala Ala Ser Asn Ile Tyr Asp 565 570 575 Asn Phe Glu Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Val Ile 580 585 590 Asn Asn Ala Thr Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Phe Leu Thr Gly Asn 595 600 605 Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Asp Pro Asn Asn Ala Ile Gly Pro Met 610 615 620 Tyr Asn Gln Val Val Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Val Ser 625 630 635 640 Val Pro Ala Gly Gln Thr Ile Glu Phe Lys Phe Leu Lys Lys Gln Gly 645 650 655 Ser Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Ala Asn Arg Thr Phe Thr Thr Pro 660 665 670 Thr Ser Gly Thr Ala Thr Val Asn Val Asn Trp Gln Pro 675 680 685 <210> 2 <211> 685 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant CGTase <400> 2 Ala Pro Asp Thr Ser Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp Val 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Ile Phe Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Ala Asn 20 25 30 Asn Pro Thr Gly Ala Ala Phe Asp Gly Ser Cys Thr Asn Leu Arg Leu 35 40 45 Tyr Cys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly 50 55 60 Tyr Leu Thr Gly Met Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val 65 70 75 80 Glu Asn Ile Tyr Ser Val Ile Asn Tyr Ser Gly Val His Asn Thr Ala 85 90 95 Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Ala Tyr 100 105 110 Gly Thr Met Gln Asp Phe Lys Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His 115 120 125 Asn Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala 130 135 140 Ser Ser Asp Asp Pro Ser Phe Ala Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn 145 150 155 160 Gly Asn Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Gln Asn Leu Phe His 165 170 175 His Tyr Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asn Gly Ile Tyr Lys 180 185 190 Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Ser Val Asp 195 200 205 Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ile Lys Met Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp 210 215 220 Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Thr Pro Phe Gly Trp Gln Lys 225 230 235 240 Ser Phe Met Ser Thr Ile Asn Asn Tyr Lys Pro Val Phe Thr Ile Gly 245 250 255 Glu Trp Ile Leu Gly Val Asn Glu Ile Ser Pro Glu Tyr His Gln Phe 260 265 270 Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln Lys 275 280 285 Ala Arg Gln Val Phe Arg Asp Asn Thr Asp Asn Met Tyr Gly Leu Lys 290 295 300 Ala Met Leu Glu Gly Ser Glu Val Asp Tyr Ala Gln Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Glu Arg Phe His Thr Ser Asn 325 330 335 Gly Asp Arg Arg Lys Leu Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser 340 345 350 Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Tyr Met Ser Gly 355 360 365 Gly Asn Asp Pro Asp Asn Arg Ala Arg Ile Pro Ser Phe Ser Thr Thr 370 375 380 Thr Thr Ala Tyr Gln Val Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser 385 390 395 400 Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Ser Thr Gln Glu Arg Trp Ile Asn Asn 405 410 415 Asp Val Ile Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Asn Asn Val Ala Val Val 420 425 430 Ala Ile Asn Arg Asn Met Asn Thr Pro Ala Ser Ile Thr Gly Leu Val 435 440 445 Thr Ser Leu Pro Gln Gly Ser Tyr Asn Asp Val Leu Gly Gly Ile Leu 450 455 460 Asn Gly Asn Thr Leu Thr Val Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ser Asn Phe 465 470 475 480 Thr Leu Ala Pro Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Thr Asp Ala 485 490 495 Thr Ala Pro Ile Ile Gly Asn Val Gly Pro Met Met Ala Lys Pro Gly 500 505 510 Val Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Ala Ser Ala Arg Gln Gly Thr Val 515 520 525 Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ala Asp Ile Val Ala Trp Glu 530 535 540 Asp Thr Gln Ile Gln Val Lys Ile Leu Arg Val Pro Gly Gly Ile Tyr 545 550 555 560 Asp Ile Arg Val Ala Asn Ala Ala Gly Ala Ala Ser Asn Ile Tyr Asp 565 570 575 Asn Phe Glu Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Ala Ile 580 585 590 Asn Asn Ala Thr Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Phe Leu Thr Gly Asn 595 600 605 Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Asp Pro Asn Asn Ala Ile Gly Pro Met 610 615 620 Tyr Asn Gln Val Val Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Val Ser 625 630 635 640 Val Pro Ala Gly Gln Thr Ile Glu Phe Lys Phe Leu Lys Lys Gln Gly 645 650 655 Ser Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Ala Asn Arg Thr Phe Thr Thr Pro 660 665 670 Thr Ser Gly Thr Ala Thr Val Asn Val Asn Trp Gln Pro 675 680 685

Claims

아밀로펙틴을 함유하는 전분에,
서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase)를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 전분은,
호화된 전분인 것을 특징으로 하는 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 반응은,
40~60℃에서 3~15분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 반응은,
온도를 80~170℃으로 올려 반응을 종결시키는 것을 특징으로 하는 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법.