JP6475620B2 - グルカンポリマー生成のためのグルコシルトランスフェラーゼ酵素 - Google Patents
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Description
1.以下の小型脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基は、互いに置換され得る:Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Pro(P)、Gly(G);
2.以下の極性の負に帯電した残基およびそれらのアミドは、互いに置換され得る:Asp(D)、Asn(N)、Glu(E)、Gln(Q);
3.以下の極性の正に帯電した残基は、互いに置換され得る:His(H)、Arg(R)、Lys(K);
4.以下の脂肪族の非極性残基は、互いに置換され得る:Ala(A)、Leu(L)、lle(I)、Val(V)、Cys(C)、Met(M);および
5.以下の大型芳香族残基は、互いに置換され得る:Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)。
本明細書中で使用される略語のいくつかの意味は、次のとおりである:「g」はグラムを意味し、「h」は時間を意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「psi」は平方インチあたりポンドを意味し、「wt%」は重量百分率を意味し、「μm」はマイクロメートルを意味し、「℃」は摂氏度を意味し、「mg」はミリグラムを意味し、「mm」はミリメートルを意味し、「μL」はマイクロリットルを意味し、「mmol」はミリモルを意味し、「min」は分を意味し、「mol%」はモルパーセントを意味し、「M」はモル濃度を意味し、「rpm」は毎分回転数を意味し、「MPa」はメガパスカルを意味する。
グルコシルトランスフェラーゼ(gtf)酵素の粗抽出物の調製
gtf酵素は、次のようにして調製した。特定のgtfをコードするDNA配列を含有するpJexpress404(登録商標)ベースのコンストラクトで、大腸菌(E.coli)TOP10(登録商標)細胞(Invitrogen,Carlsbad California)を形質転換した。各配列は、大腸菌(E.coli)中でgtf酵素を発現するように、コドン最適化した。特定のgtf酵素を発現する個々の大腸菌(E.coli)株は、アンピシリン(100μg/mL)添加LB(ルリアブロス)培地(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ)中で37℃で振盪しながら、OD600=0.4〜0.5まで培養し、その時点でIPTG(イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド、カタログ番号I6758、Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を0.5mMの最終濃度に添加した。IPTG誘導に続いて、培養物を37℃で2〜4時間培養した。細胞を5,000×gで15分間の遠心分離によって収集し、ジチオスレイトール(DTT、1.0mM)添加50mMリン酸緩衝液pH7.0に再懸濁した(20%w/v)。再懸濁した細胞をフレンチ圧力セル(SLM Instruments,Rochester,NY)に2回通過させて、>95%の細胞溶解を確実にした。溶解した細胞を4℃、12,000×gで30分間遠心分離した。得られた上清をBCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイ(Sigma−Aldrich)およびSDS−PAGEによって分析し、gtf酵素の発現を確認して、上清を−20℃で保存した。
gtf酵素活性は、gtf反応溶液中の還元糖(フルクトースおよびグルコース)の生成を測定することで確認した。スクロース(50または150g/L)、カリウムリン酸緩衝液(pH6.5、50mM)、および任意選択的にデキストラン(1mg/mL、デキストランT10、カタログ番号D9260、Sigma−Aldrich)を含有する混合物に、gtf抽出物(上記のように調製された)を添加して反応溶液を調製し、gtf抽出物は容量基準で2.5%〜5%に添加した。次に反応溶液を22〜25℃で24〜30時間培養し、その後、遠心分離した。1NのNaOHおよび0.1%塩化トリフェニルテトラゾリウム(Sigma−Aldrich)を含有する混合物に、上清(0.01mL)を添加した。混合物を5分間インキュベートして、その後、ULTROSPEC分光光度計(Pharmacia LKB,New York,NY)を使用してそのOD480nmを測定し、還元糖フルクトースおよびグルコースの存在を判断した。
gtf酵素によって合成されたグルカン産物のグリコシド結合は、13CNMR(核磁気共鳴)によって判定した。3重量%のLiClを含有する1mlの重水素化ジメチルスルホキシド(DMSO)に、乾燥グルカンポリマー(25〜30mg)を50℃で撹拌して溶解した。ガラスピペットを使用して、0.8mLの溶液を5mmのNMR管に移し入れた。26041.7Hzのスペクトルウィンドウを使用して、125.76MHzのスペクトル周波数で、CPDULクライオプローブを装着したBruker Avance 500−MHz NMR分光計(Billerica,MA)を使用して、定量的13CNMRスペクトルを得た。waltzデカップリングを使用する逆ゲート付きデカップリングパルス配列を、0.629秒間の捕捉時間時間、5秒間のパルス間遅延、および6000パルスで使用した。2.0Hzの指数関数的増幅を使用して、時間ドメインデータを転換した。
gtf酵素によって合成されたグルカン産物のDPnは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって判定した。乾燥グルカンポリマーは、Ν,Ν−ジメチル−アセトアミド(DMAc)および5%LiCl中に、100℃で一晩振盪して5mg/mLに溶解した。使用したSECシステムは、Watersからの示差屈折計2410、Wyatt Technologies(Santa Barbara,CA)からのマルチアングル光散乱光度計Heleos(商標)8+、およびWyattからの示差細管粘度計ViscoStar(商標)の3つの直結検出器が連動する、Waters Corporation(Milford,MA)からのAlliance(商標)2695分離モジュールであった。SECのために使用したカラムは、Shodex(日本)からの4本のスチレン−ジビニルベンゼンカラム、およびポリマー分布の低分子量領域の分解能を改善するための2本のリニアKD−806M、KD−802、およびKD−801カラムであった。移動相は、0.11%のLiClを添加したDMAcであった。使用したクロマトグラフィー条件は、カラムおよび検出器コンパートメント内で50℃、サンプルおよび注入器コンパートメントで40℃、0.5mL/分の流速、および100μLの注入容積であった。データ処理のために使用したソフトウェアパッケージは、WatersからのEmpower(商標)バージョン3(ブロードグルカンポリマー標準物質により較正)、およびWyattからのAstra(登録商標)バージョン6であった(カラム較正を伴う三重検出法)。
gtf酵素0874(配列番号2)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号450874の下に同定される、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号2;配列番号1によってコードされる;本明細書で「0874」と称される)。
gtf酵素6855(配列番号4)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号228476855の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号4;配列番号3によってコードされる;本明細書で「6855」と称される)。
gtf酵素2379(配列番号6)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号662379の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号6;配列番号5によってコードされる;本明細書で「2379」と称される)。
Gtf酵素7527(GtfJ、配列番号8)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号47527の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号8;配列番号7によってコードされる;本明細書で「7527」または「GtfJ」と称される)。
gtf酵素1724(配列番号10)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号121724の下に同定される、ストレプトコッカス・ダウネイ(Streptococcus downei)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号10;配列番号9によってコードされる;本明細書で「1724」と称される)。
gtf酵素0544(配列番号12)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号290580544の下に同定される、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号12;配列番号11によってコードされる;本明細書で「0544」と称される)。
gtf酵素5926(配列番号14)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号167735926の下に同定される、ストレプトコッカス・デンティロセッチ(Streptococcus dentirousetti)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号14;配列番号13によってコードされる;本明細書で「5926」と称される)。
gtf酵素4297(配列番号16)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号7684297の下に同定される、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号16;配列番号15によってコードされる;本明細書で「4297」と称される)。
gtf酵素5618(配列番号18)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号328945618の下に同定される、ストレプトコッカス・サングイニス(Streptococcus sanguinis)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号18;配列番号17によってコードされる;本明細書で「5618」と称される)。
gtf酵素2765(配列番号20)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号322372765の下に同定される、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号20;配列番号19によってコードされる;本明細書で「2765」と称される)。
gtf酵素4700(配列番号22)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号21654700の下に同定される、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号22;配列番号21によってコードされる;本明細書で「4700」と称される)。
gtf酵素1366(配列番号24)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号146741366の下に同定される、ストレプトコッカス・クリセティ(Streptococcus criceti)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号24;配列番号23によってコードされる;本明細書で「1366」と称される)。
gtf酵素0427(配列番号26)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号940427の下に同定される、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号26;配列番号25によってコードされる;本明細書で「0427」と称される)。
gtf酵素2919(配列番号28)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号383282919の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号28;配列番号27によってコードされる;本明細書で「2919」と称される)。
gtf酵素2678(配列番号30)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号400182678の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号30;配列番号29によってコードされる;本明細書で「2678」と称される)。
gtf酵素2381(配列番号32)の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号662381の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号32;配列番号31によってコードされる;本明細書で「2381」と称される)。
gtf酵素3929(配列番号34)および追加的なgtf酵素の生成
本実施例は、GENBANKでGl番号387783929の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)gtf酵素のN末端切断型の調製を記載する(配列番号34;配列番号33によってコードされる;本明細書で「3929」と称される)。
gtf酵素を用いた不溶性グルカンポリマーの生成
本実施例は、上の実施例で調製されたgtf酵素を使用した、グルカンポリマーの合成を説明する。
したがって100%のα−1,3結合と少なくとも100のDPnを含んでなるグルカンポリマーを生成できるgtf酵素が、同定された。これらの酵素を使用して、繊維の生産に適するグルカンを生成し得る。
1.水、スクロース、およびポリα−1,3−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応溶液であって、前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号4、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号20、配列番号26、配列番号28、配列番号30、または配列番号34と、少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、反応溶液。
2.前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、少なくとも50%のα−1,3グリコシド結合と少なくとも100の数平均重合度とを有する、ポリα−1,3−グルカンを合成する、上記1に記載の反応溶液。
3.前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、100%のα−1,3グリコシド結合と少なくとも100の数平均重合度とを有する、ポリα−1,3−グルカンを合成する、上
記2に記載の反応溶液。
4.前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、100%のα−1,3グリコシド結合と少なくとも250の数平均重合度とを有する、ポリα−1,3−グルカンを合成する、上記3に記載の反応溶液。
5.プライマーをさらに含む、上記1に記載の反応溶液。
6.前記プライマーがデキストランである、上記5に記載の反応溶液。
7.前記プライマーが加水分解グルカンである、上記5に記載の反応溶液。
8.a)少なくとも水、スクロース、およびポリα−1,3−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させるステップと、
b)任意選択的に、ステップ(a)で生成されるポリα−1,3−グルカンを単離するステップと
を含んでなり、前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号4、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号20、配列番号26、配列番号28、配列番号30、または配列番号34と、少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み;それによってポリα−1,3−グルカンが生成される、ポリα−1,3−グルカンを生成する方法。
9.前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、少なくとも50%のα−1,3グリコシド結合と少なくとも100の数平均重合度とを有する、ポリα−1,3−グルカンを合成する、上記8に記載の方法。
10.前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、100%のα−1,3グリコシド結合と少なくとも100の数平均重合度とを有する、ポリα−1,3−グルカンを合成する、上記9に記載の方法。
11.前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、100%のα−1,3グリコシド結合と少なくとも250の数平均重合度とを有する、ポリα−1,3−グルカンを合成する、上記10に記載の方法。
12.ステップ(a)が、プライマーと、前記水、スクロース、およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素とを接触させるステップをさらに含む、上記8に記載の方法。
13.前記プライマーが、デキストランである、上記12に記載の方法。
14.前記プライマーが、加水分解グルカンである、上記12に記載の方法。
Claims (13)
- 水、スクロース、および少なくとも100の数平均重合度を有するポリα−1,3−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応溶液であって、前記ポリα−1,3−グルカンの少なくとも95%のグリコシド結合がα−1,3グリコシド結合であり、そして前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号4と、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む、反応溶液。
- 前記ポリα−1,3−グルカンの少なくとも98%のグリコシド結合がα−1,3グリコシド結合である、請求項1に記載の反応溶液。
- 前記ポリα−1,3−グルカンの100%のグリコシド結合がα−1,3グリコシド結合である、請求項2に記載の反応溶液。
- 前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、少なくとも250の数平均重合度を有する、ポリα−1,3−グルカンを合成する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の反応溶液。
- プライマーをさらに含む、請求項1に記載の反応溶液。
- 前記プライマーがデキストランである、請求項5に記載の反応溶液。
- 前記プライマーが加水分解グルカンである、請求項5に記載の反応溶液。
- 前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の反応溶液。
- a)少なくとも水、スクロース、および少なくとも100の数平均重合度を有するポリα−1,3−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させ;それによってポリα−1,3−グルカンが生成されるステップと、
b)任意選択的に、ステップ(a)で生成されるポリα−1,3−グルカンを単離する
ステップと
を含んでなり、前記ポリα−1,3−グルカンの少なくとも95%のグリコシド結合がα−1,3グリコシド結合であり、そして前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号4と、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む、ポリα−1,3−グルカンを生成する方法。 - 前記ポリα−1,3−グルカンの少なくとも98%のグリコシド結合がα−1,3グリコシド結合である、請求項9に記載の方法。
- 前記ポリα−1,3−グルカンの100%のグリコシド結合がα−1,3グリコシド結合である、請求項10に記載の方法。
- 前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)で生成されたポリα−1,3−グルカンを単離することを含む、請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。
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