CN109714973B - α-葡聚糖 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多糖和低聚糖以及其膳食效果的领域。具体地讲，本发明涉及一种制备包含(α1→3)连接的D‑葡萄糖单元的α‑葡聚糖的方法。本发明还提供一种包含交替的(α1→4)和(α1→3)糖苷键并且具有(α1→3，4)支化点的支化α‑葡聚糖、一种食物组合物、以及α‑葡聚糖转移酶用于减少含淀粉的食物材料的可消化性碳水化合物的用途。本发明的另外方面为细菌、酶和表达载体。

Description

α-葡聚糖
技术领域
本发明涉及多糖和低聚糖及其膳食效果的领域。具体地讲，本发明涉及一种制备包含(α1→3)连接的D-葡萄糖单元的α-葡聚糖的方法。本发明还提供一种包含交替的(α1→4)和(α1→3)糖苷键并且具有(α1→3，4)支化点的支化α-葡聚糖、一种食物组合物、以及α-葡聚糖转移酶用于减少含淀粉的食物材料的可消化性碳水化合物的用途。本发明的另外方面为细菌、酶和表达载体。
背景技术
肥胖症和超重的患病率在全球迅速增加。开发具有高饱腹感和低能量密度的食物可有助于防止体重增加并促进体重减轻。与含糖食物和饮料相比，食用含非消化性碳水化合物来代替糖的食物和饮料引起餐后血糖升高较少。
人类饮食中最常见的碳水化合物是淀粉。这种多糖由大多数绿色植物作为能量存储而产生。在诸如马铃薯、小麦、玉米、稻米和木薯之类的主食中含有大量淀粉。已经提出各种方法来将淀粉和麦芽低聚糖化学改性成非消化性碳水化合物。
EP2427565描述了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)121GTFB的葡聚糖转移酶将淀粉转化为含相对较长异麦芽低聚糖单元的线性葡萄低聚糖的用途。此类材料部分地耐受消化，因此在食用时产生较少葡萄糖产物，从而有助于预防肥胖和Ⅱ型糖尿病。
直链淀粉是具有唯一(α1→4)键和高消化率的α-葡聚糖。引入(α1→3)连接的D-葡萄糖单元降低了消化率。来自石蕊属的地衣产生在线性结构中具有交替的(α1→3)和(α1→4)键的α-葡聚糖[Woranovicz-Barreira et al.，Phytochemistry，52，1069-1074(1999)(Woranovicz-Barreira等人，《植物化学》，第52期，第1069-1074页，1999年)]，但这些α-葡聚糖是水不溶性的，限制了它们的膳食应用。
希望提供另外的方式来酶促改性淀粉、淀粉衍生物和麦芽低聚糖，以改变其功能特性并增强其营养价值。所获得的材料应将低消化率和良好溶解性理想地结合在一起。具体地讲，有利的是提供适用于食物制造并且表现出良好的酶活性和热稳定性的酶来执行此类改性。
不能将本说明书中对现有技术文献中的任何参考视为承认此类现有技术为众所周知的技术或构成本领域普遍常识的一部分。如本说明书中所用，词语“包括”、“包含”和类似词语不应理解为具有排他性或穷举性的含义。换句话讲，这些词语旨在意指“包括但不限于”。
发明内容
本发明的目的是改良现有技术，并且提供用于将淀粉和其它多糖或低聚糖酶促改性成具有降低的消化率的物质的改良解决方案，或者至少提供有用的替代方案。本发明的目的可通过独立权利要求的主题实现。从属权利要求进一步拓展本发明的构想。
因此，在第一方面，本发明提供一种制备包含(α1→3)连接的D-葡萄糖单元的α-葡聚糖的方法，该方法包括使在其非还原端包含至少两个(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的多糖或低聚糖底物与能够裂解(α1→4)糖苷键并引入新(α1→3)糖苷键的α-葡聚糖转移酶接触，以形成具有与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分的葡萄糖聚合物，而不形成连续的(α1→3)糖苷键；其中所述α-葡聚糖转移酶选自GTFB、GTFC和GTFD类型的酶或其具有指定酶活性的功能性同源物。
在第二方面，本发明涉及一种包含与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分并且具有(α1→3，4)支化点的α-葡聚糖，其中α-葡聚糖具有至少3％的支化比，包含小于1重量％的连续(α1→3)键，并且具有5×102Da至1×107Da的平均分子量。本发明第三方面涉及一种包含α-葡聚糖的食物组合物，其中该α-葡聚糖包含与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分并且具有(α1→3，4)支化点，其中α-葡聚糖具有至少3％的支化比，包含小于1重量％的连续(α1→3)键，并且具有5×102Da和1×107Da的平均分子量。
本发明的另一方面是包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖转移酶用于减少含淀粉的食物材料的可消化性碳水化合物的用途。本发明的另一方面是细菌菌株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CNCM I-5068(NCC 2970)。
乳酸菌具有多种葡聚糖蔗糖酶(GS)，这些酶属于配醣水解酶家族70(GH70)，通过形成(α1→2)-、(α1→3)-、(α1→4)-和/或(α1→6)-糖苷键将蔗糖转化成α-葡聚糖多糖。近年来，已经确定了3个新的GH70酶亚族，其对于蔗糖为非活性的，但使用麦芽糖糊精/淀粉作为底物(例如罗伊氏乳杆菌121的GTFB，在EP2248907中有述)。与通过GS发现的宽泛键特异性相比，所有表征的利用GH70酶的非蔗糖排他地显示出4，6-α-葡聚糖转移酶活性(4，6-α-GTase)。它们裂解(α1→4)-键并合成新的(α1→6)-键，产生具有交替的α(1→4)/(1→6)键的线性(α1→6)α-葡聚糖链或支链聚合物。
本发明人在发酵乳杆菌NCC 2970的基因组中鉴定出针对推定的GTFB样GH70家族酶(1593个氨基酸，180kDa)的单个基因编码。该蛋白质与罗伊氏乳杆菌121GTFB 4，6-α-GTase具有77％的序列同一性，但在GS中形成底物结合残基的一些残基中显示出独特的变异。该发酵乳杆菌GTFB酶的生物化学表征，包括其得自直链淀粉的产物的详细结构分析，显示它作为4，3-α-葡聚糖转移酶(4，3-α-GTase)起作用，裂解(α1→4)-键并在线性或支链取向上形成新的(α1→3)-键。该酶无法合成连续的(α1→3)-键，并且其活性导致形成具有交替的α(1→3)/(1→4)-键并且具有(1→3，4)支化点的新型α-葡聚糖。在GH70家族和GH-H部族中发现这种新的反应特异性扩展了可合成的α-葡聚糖的范围，并且能够鉴定控制GTFB样GH70亚族酶的活性位点内的键特异性的关键位置。
由发酵乳杆菌GTFB酶形成的α-葡聚糖的1D 1H NMR分析显示存在(α1→4)和(α1→3)键。α-葡聚糖的甲基化分析显示存在末端、3-取代、4-取代和3，4-二取代的吡喃葡萄糖残基。3-取代和3，4-二取代的吡喃葡萄糖残基的存在意味着GTFB酶在线性和支链取向上形成(α1→3)键。仅检测到痕量(小于1％)的(α1→6)键。根据2D NMR光谱和Smith降解分析，未观察到两个连续(α1→3)-连接的吡喃葡萄糖残基的证据。因此，通过甲基化分析检测到的所有3-取代的吡喃葡萄糖残基必须是(α1→4)连接的，在结构中形成(α1→3)支化点，或者是与单个(α1→3)键交替的(α1→4)键的线性部分的一部分。
附图说明
图1示出一个系统发育树，其构建依据为CAZy数据库(http：//www.CAZy.org)中注释的一些特征性GH70蛋白质和使用发酵乳杆菌GH70NCC 2970蛋白质作为查询序列(以粗体显示)通过BLAST搜索鉴定的(推定)GH70GTFB样蛋白质的完整氨基酸序列比对。使用基于JTT矩阵模型的最大似然法推断出进化历史。条形表示每个位置0.2个取代的遗传距离(20％氨基酸序列差异)。与主节点相邻的步长值表示基于1000个重复的概率。蛋白质序列通过其Genbank登录号和细菌来源注释。罗伊氏乳杆菌121GTFB 4，6-α-GTase以灰色背景突出显示。
图2示出发酵乳杆菌4，3-α-GT GTFB酶(A)、(推定的)GTFB样4，6-α-GTase酶(B)、光颖芨芨草微小杆菌(E.sibiricum)GTFC 4，6-α-GTase酶(C)、圆褐固氮菌(A.chroococcum)GTFD 4，6-α-GTase酶(D)和葡聚糖蔗糖酶(E)的催化结构域中保守基序I-IV的序列比对。GH70酶中的七个严格保守氨基酸残基(由序列上方的编号1至7表示)在新型发酵乳杆菌4，3-α-GT GTFB蛋白质中也是保守的。构成催化三联体的氨基酸以粗体和浅色阴影显示。符号：NU＝亲核物质，A/B＝一般的酸/碱，TS＝过渡态稳定剂。
图3示出沿发酵乳杆菌GTFB 4，3-α-葡聚糖转移酶、罗伊氏乳杆菌121GTFB-ΔN 4，6-α-葡聚糖转移酶和罗伊氏乳杆菌121GTFA葡聚糖蔗糖酶的多肽链的结构域排列的示意图。使用Clustal W2，通过与罗伊氏乳杆菌121GTFB和GTFA序列进行序列比较，在发酵乳杆菌GTFB一级结构中鉴定结构域A、B、C、IV和V。
图4示出在不同纯化阶段的发酵乳杆菌GTFB GH70蛋白质样品的SDS-PAGE分析。道M，分子量标准品；道1，大肠杆菌无细胞提取物样品；道2，裂解细胞离心之后的不溶性级分样品；道3，Ni-NTA琼脂糖柱层析之后的汇集级分；道4，阴离子交换Hi-trap柱层析之后的纯化的GTFB 4，3-α-葡聚糖转移酶。对应于发酵乳杆菌GTFB蛋白质的条带用箭头标记。
图5是显示纯化的发酵乳杆菌GTFB酶的生物化学特性的各方面的一系列曲线图。(A)pH对GTFB活性的影响。实验在40℃下进行，将相对酶活性与pH 5.5(100％值)下的酶活性进行比较。(B)温度对GTFB活性的影响。测定在pH 5.5下进行，将相对酶活性与50℃(100％值)下的酶活性进行比较。(C)温度对GTFB稳定性的影响。在指定温度下，在含1mMCaCl2的20mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液中温育GTFB酶(0.1mg mL-1)10分钟。在实验部分中描述的标准条件下，使用直链淀粉V作为底物，在40℃下测定残余活性。执行三次重复实验，并且条形表示三次重复的标准误差。
图6示出通过25μg mL-1发酵乳杆菌GTFB酶与25mM麦芽低聚糖(DP2-DP7)、0.6％(wv-1)直链淀粉V、0.6％(w v-1)马铃薯可溶性淀粉和0.6％(w v-1)支链淀粉温育合成的产物混合物的TLC分析。将反应混合物在37℃和pH 5.5下温育24小时。S，标准品；G1，葡萄糖；G2-G7，麦芽糖到麦芽七糖；AMV，直链淀粉V；STR，淀粉；AMP，支链淀粉；Pol，聚合物。
图7是在25μg mL-1的发酵乳杆菌GTFB酶与25mM麦芽七糖(DP7)(A)和0.6％(w v-1)直链淀粉(B)在37℃和pH 5.5下温育24小时后形成的产物混合物的1H NMR光谱(D2O，300K)。表示为Gα/β和Rα/β的异头信号分别对应于游离葡萄糖和还原(1→4)-D-Glcp单元。化学位移相对于内标丙酮的信号(δ2.225)以份每一百万份给出。
图8示出0.6％(wv-1)直链淀粉V与25μg mL-1的发酵乳杆菌GTFB(pH5.5)和罗伊氏乳杆菌121GTFB(pH 5.0)酶在37℃下温育24小时后生成的反应产物的HPSEC分子量分布。虚线对应于直链淀粉V的洗脱曲线。黑色实线和灰色实线分别对应于由发酵乳杆菌和罗伊氏乳杆菌121GTFB酶合成的产物的洗脱曲线。
图9是在D2O中于300K下记录的在0.6％(w v-1)直链淀粉V与发酵乳杆菌GTFB酶(25μg mL-1)温育24小时后获得的Bio-Gel P-2多糖级分F1的500-MHz 1D 1HNMR光谱、2D1H-1H COSY、TOCSY光谱(混合时间150ms)、ROESY和2D13C-1H HSQC光谱。已经指示出(α1→4)和(α1→3)异头信号的峰。指示出结构报告基因信号。
图10是发酵乳杆菌GTFB多糖产物的复合模型，考虑了通过1D和2DNMR光谱分析、甲基化分析和Smith降解分析鉴定的所有结构元素。残基标签与表3中的那些标签相对应。
图11示出麦芽七糖与25μg mL-1的(A)发酵乳杆菌GTFB和(B)罗伊氏乳杆菌121GTFB温育t＝10分钟、1小时和24小时(pH 5.5，37℃)后形成的低聚糖混合物的HPAEC-PAD曲线。确定了低聚糖结构。使用商业低聚糖标准品来分配峰的同一性。
图12示出直链淀粉V与25μg mL-1的(A)发酵乳杆菌GTFB和(B)罗伊氏乳杆菌121GTFB温育t＝10分钟、1小时和24小时(pH 5.5，37℃)后形成的低聚糖混合物的HPAEC-PAD曲线。确定了低聚糖结构。使用商业低聚糖标准品来分配峰的同一性。
图13是用米曲霉(Aspergillus oryzae)α-淀粉酶、无定毛壳菌(Chaetomiumerraticum)右旋糖酐酶和植生克雷伯菌(Klebsiellaplanticola)普鲁兰酶M1处理后的发酵乳杆菌GTFB聚合物的TLC分析。道1，酶促处理前的发酵乳杆菌GTFB聚合物；道2-3，分别通过α-淀粉酶酶促处理发酵乳杆菌GTFB聚合物和淀粉生成的产物混合物。道4-5，分别通过右旋糖苷酶酶促处理发酵乳杆菌GTFB聚合物和IMMP生成的产物混合物。道6-7，分别通过普鲁兰酶酶促处理发酵乳杆菌GTFB聚合物和圆褐固氮菌GTFD聚合物生成的产物混合物。道S，标准品；G1，葡萄糖；G2-G7，麦芽糖到麦芽七糖；Pol，聚合物。
具体实施方式
因此，本发明部分涉及一种制备包含(α1→3)连接的D-葡萄糖单元的α-葡聚糖的方法，该方法包括使在其非还原端包含至少两个(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的多糖或低聚糖底物与能够裂解(α1→4)糖苷键并建立新(α1→3)糖苷键的α-葡聚糖转移酶接触，以形成具有与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分的葡萄糖聚合物，而不形成连续的(α1→3)糖苷键；其中所述α-葡聚糖转移酶选自GTFB、GTFC和GTFD类型的酶(例如GTFB类型的酶)或其具有指定酶活性的功能性同源物。
多糖为聚合的碳水化合物分子，由通过糖苷键结合在一起的单糖单元的长链组成。低聚糖是含有少量(通常三至九份)单糖的糖类聚合物。葡萄糖聚合物是糖类聚合物，其中单糖为葡萄糖。α-葡聚糖为与α形式的糖苷键连接的D-葡萄糖单体的多糖。在其非还原端包含至少两个(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的底物的示例为直链淀粉。
线性部分是聚合物的结构的未支化的部分，例如单取代的吡喃葡萄糖残基链。在本发明的上下文中，术语“交替”指出现在其间。在与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分中，键的序列具有一个或多个(α1→4)键，然后是(α1→3)键，然后是一个或多个(α1→4)键。在线性部分中，(α1→3)键出现在(α1→4)键之间。这种构型中的(α1→3)糖苷键有时被称为“桥接”键。
本发明的方法可包括使在其非还原端包含至少两个(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的多糖或低聚糖底物与能够裂解(α1→4)糖苷键并建立新(α1→3)糖苷键的α-葡聚糖转移酶接触，以形成具有与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分的葡萄糖聚合物，而不形成连续的(α1→3)糖苷键；其中所述α-葡聚糖转移酶能够形成(α1→3，4)支化点并且选自GTFB、GTFC和GTFD类型的酶(例如GTFB类型的酶)或其具有指定酶活性的功能性同源物。
通过本发明的方法制备的α-葡聚糖可具有至少3％、例如至少5％、还例如至少7％的支化率。在本发明的上下文中，支化比被定义为相对于分子的脱水葡萄糖单元(AGU)总数的支化AGU(即与三个其它单元结合的AGU)总数。支化比可通过本领域已知的方法测定，诸如甲基化后执行气相色谱法。α-葡聚糖中存在的支化越多，对消化性酶的接触就越少，因此α-葡聚糖可呈现更低的消化率。此外，支化点的存在可增大α-葡聚糖的溶解度。有利的是，本发明的方法可提供将低消化率与良好溶解度结合的α-葡聚糖。
通过本发明的方法制备的α-葡聚糖可包含与(α1→3)糖苷键相邻的至少一个(α1→4)糖苷键以及至少一个(α1→3，4)支化点。通过本发明的方法制备的α-葡聚糖可包含50％至70％的(α1→4)糖苷键，8％至30％的单(α1→3)糖苷键以及3％至20％的(α1→3，4)支化点，例如5％至15％的(α1→3，4)支化点。通过本发明的方法制备的α-葡聚糖可具有小于1％的连续(α1→3)糖苷键，例如它可具有小于0.5％的连续(α1→3)糖苷键，还例如它可不具有连续的(α1→3)糖苷键。通过本发明的方法制备的α-葡聚糖可具有小于1％的(α1→6)糖苷键，例如它可具有小于0.5％的(α1→6)糖苷键，还例如它可不具有(α1→6)糖苷键。键的百分比是指键的数量占键总数的百分比。
在GTF酶的催化结构域中鉴定出四个保守区域。先前的蛋白质工程研究证实，位于保守序列区域III和IV的氨基酸残基(参见图2查看序列比对)控制就所形成的糖苷键类型而言GTF酶的产物特异性。另外，区域I和区域II包含有助于酶活性和反应特异性的氨基酸残基。本发明的方法中的α-葡聚糖转移酶可在GTFB蛋白质的保守区域内包含以下突变中的至少一者(参见图2)。
A)(保守区域Ⅱ)：D991处的Asp(不是罗伊氏乳杆菌GTFB 4，6-α-葡聚糖转移酶中N1019处的Asn)
B)(保守区域IV)：I1098处的Ile(不是罗伊氏乳杆菌GTFB 4，6-α-葡聚糖转移酶中Q1126处的Gln。)
C)(保守区域IV)：N1100处的Asn(不是罗伊氏乳杆菌GTFB 4，6-α-葡聚糖转移酶中K1128处的Lys。)
本发明的方法中的α-葡聚糖转移酶可包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列(例如与SEQ ID NO：1具有至少92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。
本发明的方法中的α-葡聚糖转移酶可为发酵乳杆菌GTFB酶，例如本发明的方法中的α-葡聚糖转移酶可为发酵乳杆菌CNCM I-5068GTFB酶。在一个方面，本发明提供一种用于制备包含(α1→3)连接的D-葡萄糖单元的α-葡聚糖的方法，该方法包括使在其非还原端包含至少两个(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的多糖或低聚糖底物与α-葡聚糖转移酶接触，该α-葡聚糖转移酶包含(例如，由其组成)与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列(例如，发酵乳杆菌CNCM I-5068GTFB酶)。
本发明的方法中的底物可具有至少五的聚合度，例如它可包含至少五个D-葡萄糖单元。聚合度是聚合物或低聚物分子中单体单元的数目。例如，本发明的方法中的底物可具有至少六的聚合度，例如它可包含至少六个D-葡萄糖单元。本发明的方法中的底物可选自淀粉(例如蜡质淀粉或高直链淀粉)、淀粉衍生物、麦芽低聚糖、葡萄低聚糖、直链淀粉、支链淀粉、麦芽糖糊精、(α1→4)葡聚糖以及它们的组合。通过物理方法、酶促方法或化学方法处理原生淀粉来改变其特性，制得淀粉衍生物。
本发明的方法中的底物可包含在另一种材料中，例如底物可为以面粉形式提供的淀粉。有利的是能够将包含在食物成分内的多糖或低聚糖转化成具有较低消化率的α-葡聚糖，例如支化的α-葡聚糖。这种转化可增加成分的纤维含量和/或可有助于降低成分的卡路里含量。本发明的方法可作为食物加工操作的一部分执行，例如可在生产食物产品的过程中将α-葡聚糖转移酶施加于食物成分。底物可包含在已经具有积极营养特征的材料内，例如底物可包含在全麦粉中。
多糖或低聚糖底物可通过本发明的方法中的α-葡聚糖转移酶转化的程度可通过限制反应时间进行调节。经部分转化的底物将提供不同的物理特性。在底物和α-葡聚糖转移酶之间的反应达到完成之前，可停止本发明的方法中的α-葡聚糖的制备，例如可通过变性(例如通过加热)或去除酶来停止。
本发明的方法中的α-葡聚糖转移酶可被固定，例如在接触多糖或低聚糖底物之前被固定。这种固定技术在本领域中是众所周知的。通过酶的固定可有利于酶的去除(如上所述)。固定技术可选自共价结合、包埋、物理吸附、交联以及这些的组合。对于通过共价结合进行的固定，酶通过酶中的对于催化活性不是必需的官能团共价地连接到载体。对于酶的共价结合，可使用氧化物材料，诸如氧化铝、二氧化硅和硅酸化氧化铝。对于通过包埋进行的固定，酶被定位在聚合物基质或膜的晶格内。包埋方法分为五种主要类型：晶格、微胶囊、脂质体、膜和反胶束。酶被包埋在各种合成或天然聚合物的基质中。藻酸盐是通过离子移变凝胶作用形成凝胶的天然存在的多糖，其就是一种此类固定基质。通过物理吸附进行的固定是将酶固定到载体的最简单最古老的方法。通过吸附进行的固定是基于酶和载体之间的物理相互作用，诸如氢键合、疏水相互作用、范德华力以及它们的组合。与化学连接方式相比，吸附通常对酶的破坏性更小。通过交联进行的固定利用用作酶的分子间交联的试剂的双官能化合物或多官能化合物。交联可与其它固定方法诸如吸附或包埋结合使用。
多糖或低聚糖底物可在20℃至60℃(例如40℃至55℃)的温度和3.5至8.0(例如5.5至7.5)的pH下与α-葡聚糖转移酶接触。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分并且具有(α1→3，4)支化点的α-葡聚糖，其中α-葡聚糖具有至少3％(例如至少5％，还例如至少7％)的支化比，包含小于1％的连续(α1→3)键(例如没有连续的(α1→3)键)，并且具有5×102Da和1×107Da(例如1×104Da至1×106Da)的平均分子量。本发明的α-葡聚糖可具有小于50％的(α1→3)键。
本发明的α-葡聚糖可具有小于1％的(α1→4，6)支化点，例如它可具有小于0.5％的(α1→4，6)支化点，还例如它可不具有(α1→4，6)支化点。本发明的α-葡聚糖在O2、O4或O6位置处可不具有支链。本发明的α-葡聚糖可具有小于1％的(α1→6)糖苷键，例如它可具有小于0.5％的(α1→6)糖苷键，还例如它可不具有(α1→6)糖苷键。
本发明的α-葡聚糖可包含与(α1→3)糖苷键相邻的至少一个(α1→4)糖苷键和至少一个(α1→3，4)支化点。本发明的α-葡聚糖可包含50％至70％的(α1→4)糖苷键，8％至30％的单(α1→3)糖苷键以及3％至20％的(α1→3，4)支化点，例如5％至15％的(α1→3，4)支化点。本发明的α-葡聚糖可具有小于1％的连续(α1→3)糖苷键，例如它可具有小于0.5％的连续(α1→3)糖苷键，还例如它可不具有连续的(α1→3)糖苷键。本发明的α-葡聚糖可具有小于1％的(α1→6)糖苷键，例如它可具有小于0.5％的(α1→6)糖苷键，还例如它可不具有(α1→6)糖苷键。
本发明的α-葡聚糖可被视为膳食纤维。由于其高度支化结构，α-葡聚糖将抵抗上胃肠道中的酶促降解，最终进入大肠并在其中被结肠微生物区系充分发酵。此外，此类膳食纤维可增强人或动物的饱腹感。血糖水平在餐后升高。由于本发明的α-葡聚糖与诸如淀粉的材料相比显示出降低的消化率，因此与含淀粉的等同膳食相比，所制备的包含本发明的α-葡聚糖的膳食将导致降低的血糖反应，并且将引起较低的胰岛素反应。包含本发明的α-葡聚糖的组合物可用于控制个体的餐后血糖和胰岛素水平。个体可为人或宠物。包含本发明的α-葡聚糖的组合物可用于治疗或预防与个体的餐后血糖和胰岛素水平升高相关的疾病。该疾病可选自糖尿病(例如妊娠糖尿病)、葡萄糖代谢受损、高胰岛素血症或胰岛素抗性。个体可为患有糖尿病或前驱糖尿病的人类或宠物。
通常，餐后高胰岛素血可促进胰岛素抗性、代谢综合征、葡萄糖耐受不良和2型糖尿病的发展[Kopp W.，Metabolism.2003，Jul；52(7)：840-844(Kopp W.，《代谢》，2003年7月，第52卷，第7期，第840-844页)]。然而，降低餐后的胰岛素需求可一方面降低对2型糖尿病的血糖控制的恶化，另一方面降低易患病个体发展为2型糖尿病的风险。
“前驱糖尿病患者”是显示胰岛素抗性或葡萄糖代谢受损的个体，并且例如由于家族史、生活方式或遗传学因素而易于在以后生活中发展为糖尿病。减少胰岛素分泌降低了胰腺长时间内耗尽的风险，并且因此有利于在前驱糖尿病中管理胰腺或对代谢障碍患者有利。因此，使用包含本发明的α-葡聚糖的组合物将降低那些个体中糖尿病、葡萄糖代谢受损、高胰岛素血症或胰岛素抗性的风险和/或发展。
主要在成年人中观察到糖尿病、胰岛素抗性或葡萄糖耐受不良的发病率。然而，越来越多的儿童在以后生活中受到这种疾病的影响，或易患这种疾病，或有发展为这种疾病的风险。因此，有利地，这些疾病的预防和/或治疗在幼年时就已开始。或者，类似于对人类所观察到的，糖尿病、高胰岛素血症或胰岛素抗性在动物中，特别是在作为宠物动物饲养的动物中越来越普遍。因此，本发明还涉及猫和狗。
包含本发明的α-葡聚糖的组合物可用于非治疗用途以降低血浆餐后葡萄糖和胰岛素水平。有利的是，也可将包含本发明的α-葡聚糖的组合物施用于可能在之后的某一时间有发展为2型糖尿病、胰岛素抗性或葡萄糖耐受不良风险的个体，例如健康个体。如本文所公开的包含本发明的α-葡聚糖的组合物在摄入后提供降低的胰岛素水平。许多健康的人希望减肥。食用含膳食纤维的膳食可增强饱腹感，因此有助于人们食用更少的可消化卡路里。包含本发明的α-葡聚糖的组合物可用于非治疗用途以减肥。
本发明的另一方面涉及包含本发明的α葡聚糖的食物组合物。本发明的α-葡聚糖提供具有低消化率但仍具有良好溶解性的碳水化合物，因而成为用于需要降低卡路里含量的食物产品的理想选择。食物组合物可为饮料，例如粉末状饮料混合物或饮料奶精；早餐谷物；宠物食物产品；烘焙面团产品，例如面包、披萨或成味馅饼；或糖食产品。糖食产品可为冷冻糖食产品，诸如冰淇淋；烘焙糖食产品，诸如饼干，例如有填充物的饼干或薄脆饼；巧克力糖食产品；或糖样糖食产品，诸如口香糖、果冻、硬熬制的糖果或耐嚼的糖果。术语“糖样糖食产品”或“糖样糖果”是指传统上基于糖但可采用另选的甜味剂和/或糖替代品制造的糖食产品。
在另一个实施方案中，本发明提供α-葡聚糖转移酶在减少食物材料(例如含淀粉的食物材料)中的可消化性碳水化合物方面的用途，该α-葡聚糖转移酶包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性(例如与SEQ ID NO：1具有至少92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在本发明的范围内，可消化性碳水化合物对应于可消化且可用于向体细胞提供能量的总碳水化合物的部分。根据本发明使用的α-葡聚糖转移酶可为发酵乳杆菌CNCM I-5068GTFB酶。
本发明的又一个实施方案是包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性(例如与SEQID NO：2具有至少92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的核酸序列的细菌，或者具有SEQ ID NO：2的核酸序列的细菌。包含通过SEQ ID NO：2鉴定的核酸序列的细菌可为发酵乳杆菌，例如发酵乳杆菌CNCM I-5068。
本发明的一个实施方案是发酵乳杆菌CNCM I-5068，也称为NCC2970。它于2016年3月8日保藏在法国巴黎巴斯德研究院(Institut Pasteur，25rue du Docteur Roux，F-75724PARIS Cedex 15，France)的国立微生物培养物保藏中心(CNCM)，保藏号为I-5068。
发酵乳杆菌CNCM I-5068可在发酵液中生长，优化条件以最大化GTFB酶的制备。例如，可通过用实时聚合酶链反应(PCR)测量酶的表达来鉴定最佳条件。可随后使用发酵液或通过在多糖或低聚糖底物的存在下发酵发酵乳杆菌CNCM I-5068来实现多糖或低聚糖底物诸如直链淀粉的转化。发酵乳杆菌CNCM I-5068可方便地以冻干粉末的形式提供。
在另一个实施方案中，本发明提供一种包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖转移酶，例如由与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列组成的α-葡聚糖转移酶。本发明还提供一种表达载体，该表达载体包含核酸序列，该核酸序列编码与SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性(例如与SEQ ID NO：1具有至少92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的多肽。表达载体可为用以转化细菌的载体。
本领域的技术人员将理解，他们可自由地组合本文所公开的本发明的所有特征。具体地讲，可将针对本发明的方法描述的特征与本发明的产品组合，反之亦然。此外，可组合针对本发明的不同实施方案所描述的特征。对于具体的特征如果存在已知的等同物，则此类等同物被纳入，如同在本说明书中明确提到这些等同物。参见附图和实验部分后，本发明的更多优点和特征是显而易见的。
实验部分
引言
最初确定配醣水解酶家族70(www.CAZy.org)以适应将蔗糖转化为α-葡聚糖多糖的葡聚糖蔗糖酶，该α-葡聚糖多糖仅在乳酸菌中发现，尤其是在明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)和酒球菌属(Oenococcus)中。根据GS特异性，形成结构不同的α-葡聚糖。最初，表征了用(α1→3)-(变聚糖)或(α1→6)-键(右旋糖酐)合成α-葡聚糖的大多数葡聚糖蔗糖酶；近年来，已经将具有(α1→2)-键或(α1→4)-键的各种α-葡聚糖鉴定为葡聚糖蔗糖酶产物。已经表征了一些葡聚糖蔗糖酶，其产生具有交替的(α1→3)/(α1→6)-键(交替糖)(例如肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)NRRL B-1355的交替蔗糖酶)或(α1→4)/(α1→6)-键(罗伊氏糖)(例如罗伊氏乳杆菌121的罗伊氏糖蔗糖酶)的α-葡聚糖。此外，可通过相同的酶或通过肠膜明串珠菌菌株的独立(α1→2)-支化酶或(α1→3)支化酶引入支化点。因此，GS能够合成α-糖苷键[(α1→2)、(α1→3)、(α1→4)和(α1→6)]的所有四种可能的键类型，但从未在相同的α-葡聚糖中发现过糖苷键的特定组合。例如，到目前为止，还没有报道过合成具有(α1→3)加(α1→4)-键的α-葡聚糖的野生型葡聚糖蔗糖酶。通过GS制备的α-葡聚糖在其支化度、分子量和构象方面也不同。此类差异导致α-葡聚糖显示出具有广阔工业应用前景的不同功能特性。
GH70GS酶家族(作用于蔗糖)与构成GH-H部族的GH13α-淀粉酶家族(作用于麦芽糖糊精/淀粉)的进化相关。由于它们的进化相关性，GH70和GH13酶家族在其序列和结构方面显示出相似性，并且使用相当的α-保留双位移催化机制。两个家族的蛋白质均具有催化(β/α)8桶结构，该结构具有结构域A、B和C，并且具有4个保守区域的活性位点被视为单个酶特异性的序列指纹。然而，GS也表现出独特的特征。在GH13家族中，这4个保守区域的顺序是I-II-III-IV。相比之下，在GS酶中，这种(β/α)8桶循环交替变换，导致保守区域的顺序为Ⅱ-III-IV-I，并且它们具有两个额外的特有结构域IV和V。此外，GS呈现出“U折叠”结构域结构，其中5个结构域中的4个(结构域A、B、IV和V)由多肽链的两个不连续部分构建而成。在从GH13进化的过程中，GH70酶似乎经历了一系列基因重排，从而导致这种不寻常的循环交替变换的结构域组织。
近年来，已经在GH70家族中鉴定出若干种支持GH13和GH70家族的进化相关性的麦芽糖糊精/淀粉转化酶。首先，发现罗伊氏乳杆菌121产生对蔗糖无活性的GS样酶。编码该酶的基因在编码葡聚糖蔗糖酶GTFA的基因的上游发现并且被命名为gtfB。罗伊氏乳杆菌121GTFB代替蔗糖，作用于麦芽糖糊精和淀粉底物，从供体底物的非还原端裂解(α1→4)-键，并在产物(4，6-α-葡聚糖转移酶活性，4，6-α-GTase)的非还原端合成新的(α1→6)-键。这导致合成具有线性链(α1→6)-键和(α1→4)-键(异麦芽酮糖醇/麦芽多糖，IMMP)的产物。目前数据库中共有54种相关的GTFB酶可用，除4种之外，它们都发现于乳杆菌属，组成了新的GH70亚族。在许多新基因组序列的注释之后，在非LAB属中也发现了一些GH70酶家族。之前，已经表征了光颖芨芨草微小杆菌255-15的GTFC酶[Gangoiti J，Pijning T，DijkhuizenL.，Appl Environ Microbiol 82：756-766.(2015)(Gangoiti J、Pijning T、DijkhuizenL.，《应用及环境微生物学》，第82期，第756-766页，2015年)]和圆褐固氮菌NCIMB 8003的GTFD酶[Gangoiti J，van Leeuwen S，Vafiadi C，Dijkhuizen L.，Biochem Biophys Act1860：1224-1236(2016)(GangoitiJ、van Leeuwen S、Vafiadi C、Dijkhuizen L.，《生物化学与生物生理学法案》，第1860期，第1224-1236页，2016年)]。这两种酶对蔗糖是非活性的，对麦芽糖糊精/淀粉有活性，显示出4，6-α-GTase活性，从而导致合成异麦芽/麦芽低聚糖(IMMO)(GTFC)和罗伊氏糖型的α-葡聚糖(GTFD)。令人惊讶的是，GTFC和GTFD中的结构域顺序类似于GH13酶，具有非交替变换顺序的保守区域I-Ⅱ-III-IV，并且缺乏在其它GH70酶中发现的结构域V。GTFC和GTFD代表2个另外的GH70亚族，并且是GH13α-淀粉酶和GH70葡聚糖蔗糖酶之间的结构非常有趣的进化中间体，允许进一步分析GH-H部族中(亚)家族的进化起源和分化(http：//www.cazy.org)。
发酵乳杆菌NCC 2970基因组序列的注释导致鉴定出与GTFB型的4，6-α-GTase酶具有明确序列相似性的单个家族GH70蛋白质。它还具有典型4，6-α-GTase酶的所有特征，对蔗糖是非活性的并且对麦芽糖糊精/淀粉有活性。然而，发酵乳杆菌GTFB氨基酸序列在保守区域Ⅱ和IV中的一些残基中显示出独特的变异，从而有助于活性位点供体/受体底物结合亚位点。因此，本发明人决定对该发酵乳杆菌GTFB酶进行生物化学表征，包括对其产物的详细表征。这表明它对麦芽糖糊精/淀粉具有4，3-α-葡聚糖转移酶(4，3-α-GTase)活性，这是GH70家族和GH-H部族的新反应特异性。
材料和方法
发酵乳杆菌GTFB蛋白质序列分析
使用罗伊氏乳杆菌121GTFB(GenBank登录号AAU08014.2)作为查询序列通过BLAST分析发酵乳杆菌NCC 2970基因组(SEQ ID NO：2)能够鉴定GH70蛋白质编码基因。使用针对非冗余蛋白质序列数据库的NCBI BLASTp搜索(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)发现了显示与发酵乳杆菌GH70蛋白质序列具有相似性的序列。使用Jalview 2桌面应用程序用Clustal W2进行多个氨基酸序列比对。使用Signal P4服务器分析是否存在信号肽。使用CELLO v.2.5：subCELlular LOcalization预测因子(http：//cello.life.nctu.edu.tw/)预测发酵乳杆菌GTFB蛋白质的亚细胞定位。通过ExPASy Compute pI/Mw(http：//web.expasy.org/compute_pi/)预测GTFB蛋白质的理论Mw(分子量)。
使用MEGA版本6(Tamura等人，2013年)，使用对应于编入CAZy索引的代表性表征的GH70蛋白质的总共72个氨基酸序列和通过BLASTp鉴定的GTFB样蛋白质序列进行系统发育分析。使用默认参数通过MUSCLE对序列进行比对。使用MEGA6，基于JTT矩阵模型，用最大似然法构建系统发育树。对包含比对缺口和缺失数据的位置执行部分删除。通过执行1，000次步长重复来评估所推断系统发育关系的统计置信度。
发酵乳杆菌GTFB基因的克隆
用于编码N末端截短形式的GTFB蛋白质(氨基酸616-1593)的DNA片段使用PhusionDNA聚合酶(芬兰赫尔辛基的Finnzyme公司(Finnzyme，Helsinki，Finland))从发酵乳杆菌NCC 2970染色体DNA进行扩增，并且使用不依赖于连接的克隆(LIC)克隆到经修饰的pET15b载体中。用于扩增N末端截短的gtfB基因衍生物的引物掺入5′延伸(下划线)以利于LIC克隆，并且是：正向CAGGGACCCGGTTTTGGTAAAGATGGTCGGATTG和反向CGAGGAGAAGCCCGGTTAATTGTCTTCAATATTAGCATAATAATC。通过琼脂糖条纯化所得的PCR产物，并且在dATP的存在下利用T4DNA聚合酶(纽英伦生物技术公司(New England Biolabs))的3′至5′核酸外切酶活性消化该产物。并行地，将pET-15b/LIC载体用KpnI进行消化，从凝胶中分离，然后在dTTP的存在下用T4DNA聚合酶(纽英伦生物技术公司)进行处理。将经处理的pET-15b/LIC载体和扩增子以1∶4的摩尔比混合在一起，然后将混合物用于转化大肠杆菌DH5α细胞(Phabagen)。这得到包含可被3C蛋白酶裂解的N-末端His6-标签的gtfB-ΔN构建体。将构建的表达载体pET15b/gtfB-ΔN转化到宿主大肠杆菌BL21 Star(DE3)中。通过核苷酸测序(德国科隆GATC公司(GATC，Cologne，Germany))验证基因序列。
酶的表达和纯化
为了表达发酵乳杆菌GTFB酶，将用pET15b/gtfB-ΔN转化的大肠杆菌star BL21(DE3)过夜培养物以1∶100稀释到补充有氨苄青霉素(100μg mL-1)的新鲜LB发酵液中，在37℃和220rpm下生长，直至600nm处的光密度达到约0.4。然后将培养温度降至16℃，加入诱导剂异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷至终浓度为0.1mM。20小时后，通过离心(10，000g×20分钟)收获细胞，随后根据制造商(赛默飞世尔公司(Thermo Scientific)，Pierce系列)描述的方案用B-PER裂解试剂破碎细胞。使用Ni2+-次氮基三乙酸酯(Ni-NTA)作为柱材料(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))，通过His-标签亲和层析从无细胞的提取物中分离重组GTFB蛋白质。用25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM CaCl2洗涤柱之后，用相同缓冲液中的200mM咪唑洗脱结合的蛋白质，并使用截断分子量为30，000的搅拌超滤单元(马萨诸塞州贝弗利米康公司(Amicon，Beverly，MA))去除咪唑。为了进一步纯化，将蛋白质加载到1mL-HiTrap柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))并使用线性梯度的NaCl(从0到1M)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)(含1mM CaCl2)洗脱(流速为1mL/分钟)。使用
Figure BDA0001886861100000161
快速蛋白质液相色谱仪(FPLC；瑞典乌普萨拉通用电气医疗集团(GE Healthcare，Uppsala，Sweden))收集1mL级分。通过超滤(YM30膜；马赛诸萨州比勒利卡密理博公司(Millipore，Billerica，MA))交换缓冲液。通过级分的SDS-PAGE分析评估纯化进展，并使用Nanodrop 2000分光光度计(荷兰DeMeern的Isogen Life Science公司(Isogen Life Science，De Meem，The Netherlands))测定蛋白质浓度。
酶活性测定
通过直链淀粉碘法测定发酵乳杆菌GTFB-ΔN酶的初始总活性[Gangoiti J，Pijning T，Dijkhuizen L.，Appl Environ Microbiol 82：756-766.(2015)(GangoitiJ、Pijning T、Dijkhuizen L.，《应用环境微生物》，第82期，第756-766页，2015年)][Bai Y，van der Kaaij RM，Leemhuis H，Pijning T，van Leeuwen SS，Jin Z，Dijkhuizen L.，2015.App1 Environ Microbiol 81：7223-7232.(2015)(Bai Y、van der Kaaij RM、Leemhuis H、Pijning T、van Leeuwen SS、Jin Z，Dijkhuizen L.，《应用环境微生物》，第81期，第7223-7232页，2015年)]。在660nm和40℃下，监测由转糖基化和/或水解活性引起的α-葡聚糖-碘复合物的吸光度的降低14分钟。反应混合物包含0.125％(w v-1)直链淀粉V(荷兰Foxhol的AVEBE公司(AVEBE，Foxhol，The Netherlands))、2.5μg mL-1的酶、25mM的乙酸钠(pH 5.5)和1mM CaCl2。一个活性单位被定义为每分钟转化1mg底物的酶量。
通过在3.5至8.0改变pH，在40℃下测定pH对酶活性的影响。对3.5至7.0的pH值，使用柠檬酸钠缓冲液(25mM)，对7.0至8.0的pH值，使用磷酸钠缓冲液(25mM)。在25mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5，1mM CaCl2)中，在30℃至65℃的温度范围内测定最佳温度。在30℃至55℃的温度下，在含1mMCaCl2的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中将浓度为0.1mg mL-1的酶温育10分钟，以确定温度对GTFB-ΔN稳定性的影响。然后立即将样品冷却至4℃，在含1mM CaCl2的25mM柠檬酸钠(pH 5.5)中于40℃下以标准反应条件测量残余活性。
通过发酵乳杆菌GTFB的底物利用
发酵乳杆菌GTFB-ΔN(25μg mL-1)分别与25mM蔗糖(Acros)、黑曲霉糖(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、潘糖(西格玛奥德里奇公司)、异麦芽糖(西格玛奥德里奇公司)、异麦芽三糖(西格玛奥德里奇公司)、异麦芽五糖(卡博森斯公司(Carbosynth))、聚合度(DP)为2-7的麦芽低聚糖(MOS)以及0.6％(w/v)直链淀粉V(荷兰Foxhol的AVEBE公司(AVEBE，Foxhol，The Netherlands))、马铃薯淀粉(西格玛奥德里奇公司)和支链淀粉(西格玛奥德里奇公司)一起温育。所有反应均在含1mM CaCl2的25mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中于37℃下进行24小时。通过在100℃下温育6分钟停止反应。通过薄层色谱法(TLC)和/或高性能阴离子交换色谱法(HPAEC)监测反应的进展。
具有脉冲安培检测分析的薄层色谱法和高性能阴离子交换色谱法
薄层色谱法(TLC)在硅胶60F254，20×20cm TLC片材(德国达姆施塔特默克公司(Merck，Darmstadt，Germany))上进行。将TLC板在正丁醇∶乙酸∶水(2∶1∶1，v/v)溶剂体系中显影6小时。用苔黑酚/硫酸染色观察碳水化合物，并与同时运行的葡萄糖和MOS(DP2至DP7)的混合物进行比较。
将碳水化合物样品在DMSO中以3∶100稀释，通过HPAEC在Dionex DX500工作站(荷兰阿姆斯特丹戴安公司(Dionex，Amsterdam，The Netherlands))上进行分析，该工作站配备有CarboPac PA-1柱(Dionex；250×2mm)和ED40脉冲安培检测系统。在57分钟内以0.25mLmin-1的流速施加在100mM NaOH中的10mM至240mM乙酸钠梯度。每个样品的注射体积为5μL。使用商业低聚糖标准品来分配峰的同一性。
HPSEC分析
使用配备有多角度激光散射检测器(SLD 7000PSS，美因茨)、粘度计(ETA-2010PSS，美因茨)和示差折光率检测器(G1362A 1260RID，安捷伦科技公司)的尺寸排阻色谱系统(Agilent Technologies 1260Infinity)对产物混合物进行HPSEC分析[GangoitiJ，van Leeuwen S，Vafiadi C，Dijkhuizen L.，Biochem Biophys Act 1860：1224-1236.(2016)(Gangoiti J、van Leeuwen S、Vafiadi C、Dijkhuizen L.，《生物化学与生物生理学法案》，第1860期，第1224-1236页，2016年)]。通过使用孔隙率为
Figure BDA0001886861100000181
和
Figure BDA0001886861100000182
的三个PFG-SEC柱与PFG保护柱配合进行分离。DMSO-LiBr(0.05M)用作洗脱液，流速为0.5mLmin-1。使用Mw范围为342至805，000Da的标准普鲁兰多糖试剂盒(德国美因茨PSS公司(PSS，Mainz，Germany))校准和验证系统。还通过PSS测量特定的RI增量值dn/dc，该值为0.072mLg-1。多角度激光散射信号用于确定直链淀粉V和由发酵乳杆菌GTFB-ΔN酶生成的聚合物的分子量。该系统中这些多糖的特定RI增量值dn/dc被认为与普鲁兰多糖相同。由通用校准方法测定罗伊氏乳杆菌GTFB-ΔN聚合物的分子量。使用WinGPC Unity软件(美因茨PSS公司(PSS，Mainz))处理数据。重复进行测量。
通过发酵乳杆菌GTFB从直链淀粉合成的产物的制备、分离和表征
在上述“通过发酵乳杆菌GTFB的底物利用”中条件下将纯化的GTFB-ΔN(0.25mg)与直链淀粉V在37℃下温育48小时。所得产物混合物通过尺寸排阻色谱法在BioGel P2柱(2.5×50cm；荷兰费嫩达尔Bio-Rad公司(Bio-Rad，Veenendaal，The Netherlands))上分馏，使用10mM NH4HCO3作为洗脱液，流速为48mL h-1。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、核磁共振(NMR)光谱和甲基化分析来分析存在于不同Biogel P2池中的多糖/低聚糖。
(i)MALDI-TOF质谱
在配备有氮激光器(337nm，3ns脉冲宽度)的AximaTM质谱仪(英国曼彻斯特岛津克雷托斯公司(Shimadzu Kratos Inc.，Manchester，UK))上记录MALDI-TOF-MS测量结果。将样品溶液(1μL)点在MALDI靶上并立即与1μL的10％(w v-1)2，5-二羟基苯甲酸基质水溶液混合。使用反射器模式在分辨率为5000半极大处全宽度(FWHM)和延迟提取(450ns)下记录正离子模式光谱。质谱通常从1至5000Da获得，离子门在200处消隐。
(ii)NMR光谱
在Varian Inova 500光谱仪(格罗宁根大学NMR中心(NMR Center，University ofGroningen))上记录一维和二维1H核磁共振(NMR)光谱，使用D2O作为溶剂并且探头温度为298K。在分析之前，将样品在D2O(99.9原子％D，马萨诸塞州安多弗Cambridge IsotopeLaboratories公司(Cambridge Isotope Laboratories，Inc.，Andover，MA))中交换两次并进行中间冻干，然后溶解于0.6mL D2O中。用MestReNova 5.3(西班牙波斯特拉MestrelabsResearch SL公司(Mestrelabs Research SL，Santiago de Compostella，Spain))处理所有NMR光谱。化学位移(δ)以ppm表示，并用内标丙酮校准(1H为δ2.225ppm，13C为δ31.07)。通过各个信号峰面积的积分来估计不同键的百分比。
(iii)甲基化分析
如前所述进行甲基化分析[van Leeuwen SS，Kralj S，van Geel-Schutten IH，Gerwig GJ，Dijkhuizen L，Kamerling JP.，Carbohydr Res 343：1237-1250.(2008)(vanLeeuwen SS、Kralj S、van Geel-Schutten IH、Gerwig GJ、Dijkhuizen L、Kamerling JP.，《碳水化合物研究》，第343期，第1237-1250页，2008年)]。简而言之，使用CH3I和固体NaOH在DMSO中对聚合物和低聚糖样品(约5mg)进行全甲基化，随后用三氟乙酸水解。用NaBD4还原部分甲基化的单糖。使用吡啶∶乙酸酐(1∶1v/v)在120℃下将所得的部分甲基化的糖醇进行全乙酰化，得到部分甲基化的糖醇乙酸酯(PMAA)的混合物。如van Leeuwen等人2008年所述，通过GLC-EI-MS和GLC-FID分析PMAA。
Smith降解
将1mg至2mg的多糖样品溶解于100mM NaOAc(pH 4.1)中的1mL50mM NaIO4，在4℃下于黑暗中搅拌112小时。通过添加300μL乙炔二醇来中和过量的IO4 -。将降解产物在SpectraPor 1000Da截止透析漂浮液中用流动的自来水透析48小时。透析之后，将样品在室温下用NaBH4还原过夜，然后再执行如上所述的透析。将还原的多糖样品冻干并在1mL 90％甲酸中于90℃下水解30分钟。冷却至室温后，通过N2流蒸发甲酸。如Van Leeuwen等人2008年所述，在GLC-EI-MS和GLC-FID上以及通过HPAEC-PAD将干燥的多糖片段分析为TMS衍生物。
用水解酶进行发酵乳杆菌GTFB产物分析
将发酵乳杆菌GTFB-ΔN聚合物以5mg mL-1的浓度溶解于50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中，并分别与过量的α-淀粉酶(米曲霉(Aspergillus oryzae)；Megazyme公司)、右旋糖苷酶(无定毛壳菌(Chaetomium erraticum)；西格玛奥德里奇公司)和普鲁兰酶M1(植生克雷伯菌(Klebsiella planticola)；Megazyme公司)在37℃下温育48小时。淀粉、IMMP罗伊氏乳杆菌121GTFB聚合物和圆褐固氮菌罗伊氏糖样GTFD聚合物分别用作α-淀粉酶、右旋糖苷酶和普鲁兰酶处理的阳性对照，从而在这些条件下完全降解。通过TLC分析检查水解度。
结果和讨论
发酵乳杆菌GTFB蛋白质序列分析
发酵乳杆菌基因组的注释可以鉴定单个GH70家族蛋白质。发酵乳杆菌GH70蛋白质的BLASTp分析显示，该蛋白质的最接近的同源物都是GTFB样4，6-α-GTase GH70亚族的成员，具有超过47％相同的氨基酸序列(表1)。
表1：使用发酵乳杆菌NCC 2970GH70蛋白质作为查询序列，通过BLASTp搜索鉴定的 蛋白质序列。对应于罗伊氏乳杆菌121GTFB 4，6-α-葡聚糖转移酶的序列以粗体突出显示。
Figure BDA0001886861100000211
Figure BDA0001886861100000221
Figure BDA0001886861100000231
通过该BLASTp搜索鉴定的发酵乳杆菌GH70蛋白质与其它所表征的GH70酶和(推定的)GH704，6-α-GTase的系统发育关系如图1所示。葡聚糖蔗糖酶(GS)存在于明串珠菌属、链球菌属、乳酸杆菌属、酒球菌属和魏斯氏菌属的乳酸菌的基因组中，但目前在乳酸杆菌菌株中发现了编码推定的GTFB同源物的大多数基因(片球菌属和明串珠菌属中存在的4种GTFB样蛋白质除外)。发酵乳杆菌GH70酶与罗伊氏乳杆菌121GTFB 4，6-α-GTase及其同源物聚集在一起，表明该蛋白质是GTFB型GH70亚族的成员。GTFB样蛋白质显示出类似于GH70GS的结构域组织，具有循环交替变换的(β/α)8桶，然而，在生物化学方面它们与光颖芨芨草微小杆菌255-15GTFC和圆褐固氮菌NCIMB 8003 GTFD酶更相关。与这些观察结果一致，GTFB样GH70亚族与GS的进化更密切相关，但它在GS和GTFC以及由光颖芨芨草微小杆菌255-15和圆褐固氮菌NCIMB 8003编码的GTFD 4，6-α-GTase之间具有中间位置。
所鉴定的来自发酵乳杆菌的GTFB基因序列对由1593个氨基酸组成的计算分子量为180kDa的多肽进行编码。与GH70酶的细胞外位置一致，通过CELLO v.2.5：subCELlularLOcalization预测因子服务器预测发酵乳杆菌GTFB，以用作细胞外蛋白质。使用Signal P4.0服务器的算法分析发酵乳杆菌GTFB的氨基酸序列的N-末端，表明该蛋白质含有39个氨基酸的经典革兰氏阳性N-末端信号肽。发酵乳杆菌GTFB与罗伊氏乳杆菌121GTFB具有显著的氨基酸同一性(77％同一性，57％覆盖率)，后者为具有4，6-α-葡聚糖转移酶活性的第一个表征GH70成员(EP2248907)。此外，在发酵乳杆菌GTFB酶中也发现了由五个结构域(A、B、C、IV和V)组成的大多数GH70蛋白质的典型U折叠结构域组织特征(图3)。与罗伊氏乳杆菌121GTFB类似，发酵乳杆菌GTFB蛋白质的结构域A、B、C和IV由多肽链的不连续N-末端和C-末端延伸构建，而结构域V仅由N-末端多肽部分组成。此外，发酵乳杆菌GTFB具有存在于许多葡聚糖蔗糖酶中的约700个残基和据信参与细胞壁附着的乳酸杆菌属菌种的GTFB样蛋白质的较大可变N-末端结构域[Bath K，Roos S，Wall T，Jonsson H.FEMS Microbiol Lett253：75-82.(2005)(Bath K、Roos S、Wall T、Jonsson H，《FEMS微生物学快报》，第253期，第75-82页，2005年)]。
为了预测发酵乳杆菌GTFB酶的反应和/或产物特异性，通过与其它GH70家族蛋白质的序列比对鉴定该蛋白质的同源区域I-IV(图2)。这四个同源基序包含催化和底物结合残基，因此被认为是GH70和GH13家族酶中单个酶特异性的序列指纹。发酵乳杆菌GTFB中保守区域I-IV的顺序为Ⅱ-III-IV-I，并且对应于在葡聚糖蔗糖酶和GTFB样4，6-α-葡聚糖转移酶中发现的顺序，从而反映了其循环交替变换的结构域组织。发酵乳杆菌GTFB的基序I-IV显示出与对应于(推定的)GTFB样4，6-α-葡聚糖转移酶的基序的显著相似性。首先，GH70家族酶的基序I-IV中严格保守的七个残基存在于发酵乳杆菌GTFB中。在这七个残基中，三个推定的催化残基Asp987、Glu1025和Asp1097(发酵乳杆菌GTFB编号)分别被鉴定为亲核物质、一般酸/碱催化剂和过渡态稳定剂。与其它GTFB样酶相似，Tyr残基取代所有GS中保守的亚位点+1/+2Trp残基(罗伊氏乳杆菌GTF180 GS中的W1065)，支化蔗糖酶除外。值得注意的是，保守的W1065(GTF180罗伊氏乳杆菌180编号)也被光颖芨芨草微小杆菌GTFC和圆褐固氮菌GTFD 4，6-α-GTase酶中的Tyr取代。因此，在该位置处存在Tyr残基而不是典型的Trp残基表示区分淀粉/麦芽糖糊精底物上具有活性的GH70蛋白质与“经典”GS的主要差异。此外，发酵乳杆菌GTFB在位置1028和1138(GTF180罗伊氏乳杆菌180编号)处包含Asp和Arg残基，分别有助于底物结合亚位点+1和+2，如大多数GTFB样4，6-α-GTase中的情况那样。然而，发酵乳杆菌GTFB还示出在基序II和IV中有助于-1、+1和+2供体/受体结合亚位点的一些残基的独特变异。具体而言，在葡萄糖蔗糖酶和GTFB样蛋白质中高度保守的亚位点+1Asn残基(罗伊氏乳杆菌GTF180GS中的N1029)被发酵乳杆菌GTFB中的Asp取代。在GS中，发现残基N1019对于活性和键特异性至关重要。此外，推定的过渡态稳定剂(GTF180罗伊氏乳杆菌180编号)后的位置1137和1140处的氨基酸为Ile和Asn，而不是大多数GTFB样和GTFC样4，6-α-GTase中存在的Gln和Lys残基。先前的突变研究表明，这两个残基有助于GS中的糖苷键特异性。具体地讲，发现位置1137处的残基对于亚位点+2处的糖部分的正确取向是关键的。尽管发酵乳杆菌GTFB与罗伊氏乳杆菌121GTFB 4，6-α-GTase蛋白质具有明显的序列相似性，但它在功能方面重要的位置处包含独特的序列特征。
发酵乳杆菌GTFB的纯化和生化表征
发酵乳杆菌GTFB-ΔN蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)Star中成功表达。在所用的生长和诱导条件下，GTFB-ΔN的表达水平在可溶性和不溶性级分中都相对较低(图4)。如实验部分所述，通过两个色谱步骤(由金属螯合色谱和阴离子交换色谱组成)从可溶性级分中纯化酶。纯化酶的SDS-PAGE分析显示表观分子量为约110kDa(图4)的单个蛋白质条带，这符合从序列推导的理论值。由于该纯化过程，每升大肠杆菌培养物获得总共0.4mg的纯GTFB-ΔN蛋白质。
使用直链淀粉V作为底物，通过碘染色测定法测定pH和温度对酶活性的影响。纯化的重组发酵乳杆菌GTFB在pH 5.5下表现出最高活性，在pH4至6的范围内保留超过80％的该活性(图5A)。该酶在30℃至60℃具有活性，显示其在50℃下具有最大活性，但在65℃下进行反应时活性急剧下降(图5B)。此外，酶在高于45℃的温度下在20mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0中显示出较低的稳定性(图5C)。根据报道，罗伊氏乳杆菌121GTFB 4，6-α-GTase酶具有类似pH和温度最佳值。通过碘染色测定法计算纯化的发酵乳杆菌GTFB酶在含有1mM CaCl2的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中对0.125％(w v-1)直链淀粉V的特异性总活性为22±0.36U mg-1蛋白质。该值为所报道的得自罗伊氏乳杆菌121的GTFB(在pH 5.0和40℃的最佳条件下)的值的约10倍，即2.8U mg-1[Bai等人，2015年]。还在螯合剂EDTA的存在下测定了发酵乳杆菌GTFB的活性，最终浓度为10mM，从而形成轻微(20％)抑制。
发酵乳杆菌GTFB的底物和产物特异性
在同源基序中观察到的差异表明发酵乳杆菌GTFB可具有新的酶反应和/或产物特异性。因此，将发酵乳杆菌GTFB酶与不同低聚糖和多糖在37℃下温育24小时，并通过TLC分析反应产物(图6)。与罗伊氏乳杆菌GTFB类似，发酵乳杆菌GTFB酶不能作用于具有DP2、DP3和DP5的蔗糖、潘糖、黑曲霉糖和异麦芽低聚糖(数据未示出)。相反，发酵乳杆菌GTFB酶显示出DP 6和7的麦芽低聚糖(MOS)的水解和转糖基酶(歧化)活性，低分子量和高分子量产物积聚而不是MOS底物聚集可作为证据。然而，发酵乳杆菌GTFB对DP低于4的MOS没有活性，并且显示出与麦芽五糖(DP5)的较低歧化活性；就罗伊氏乳杆菌121 GTFB而言，已经用麦芽三糖(DP3)观察了活性。将直链淀粉V、马铃薯淀粉和支链淀粉与发酵乳杆菌GTFB酶一起温育导致出现一系列较低分子量的产物，表明该酶对这些聚合物也具有活性。应当指出的是，发酵乳杆菌GTFB酶比罗伊氏乳杆菌121GTFB产生显著更大量的低聚糖产物，其主要由直链淀粉V合成(改性)聚合物。如通过TLC观察到的那样，DP 2至5的MOS由各种聚合物底物累积，反映出发酵乳杆菌GTFB需要麦芽六糖或更长的MOS作为葡萄糖供体底物。
为了研究发酵乳杆菌GTFB的产物特异性，通过一维1H NMR光谱分析麦芽七糖和直链淀粉V衍生的产物混合物(图7)。两种产物混合物的1H-NMR光谱显示在δ约5.40和5.35处存在两组对应于(α1→4)键和新合成的(α1→3)键的异头重叠信号。(α1→3)键的存在由δH-54.16ppm处的(α1→3)键的结构报告基因组信号证实。光谱还显示了对应于游离葡萄糖单元(GαH-1，δ 5.225；Gβ H-1，δ 4.637)和4-取代还原末端葡萄糖残基(RαH-1，δ 5.225；Rβ H-1，δ4.652)的信号。检测到对应于痕量(小于1％)的(α1→6)键(H-1，δ约4.97)的小信号。麦芽七糖和直链淀粉V产物的(α1→4)-连接的葡萄糖残基和(α1→3)-连接的葡萄糖残基的摩尔比分别为86∶14和81∶19。由发酵乳杆菌GTFB从直链淀粉V生成的产物混合物的甲基化分析显示存在末端、3-取代、4-取代和3，4-二取代吡喃葡萄糖残基，摩尔百分比为25％、16％、55％和4％，这与通过1H NMR确定的键比率一致，并证实发酵乳杆菌GTFB表现出(α1→3)键特异性。与仅生成线性(α1→6)葡聚糖链(4，6-α-GTase)的罗伊氏乳杆菌GTFB酶相比，发酵乳杆菌GTFB用作4，3-α-葡聚糖转移酶(4，3-α-GTase)，催化(α1→4)键的裂解和以线性或支链取向形成新的(α1→3)。
发酵乳杆菌GTFB酶对直链淀粉的作用也通过具有多重检测的HPSEC进行表征(图8)。起始直链淀粉V底物的HPSEC曲线显示出在23.0mL时洗脱的单峰，平均Mw为174×103Da，而发酵乳杆菌GTFB处理的直链淀粉V显示两种不同的分子量分布峰：在21.5mL时洗脱的早期峰对应于平均Mw为800×103Da的高分子量聚合物，第二峰对应于平均Mw为1400Da的低聚糖。就罗伊氏乳杆菌121GTFB 4，6α-GT而言，对应于IMMP的峰在26.5mL时洗脱并且具有15×103Da的平均Mw。因此，发酵乳杆菌GTFB能够合成分别为起始直链淀粉V底物和IMMP产物的Mw值的约8倍和50倍的聚合物。然而，基于折射率信号，该聚合物占总产物混合物的小于20％，而显著比例的低分子量葡聚糖存在于发酵乳杆菌GTFB的产物混合物中。
通过发酵乳杆菌GTFB从直链淀粉V合成的产物的结构表征
对于更详细的结构表征，将由发酵乳杆菌GTFB从直链淀粉产生的产物通过尺寸排阻色谱法在Biogel P2上进行纯化。通过MALDI-TOF MS和1H NMR光谱分别分析获得的七个级分(称为F1-F7)(表2)。级分F6和F7分别包含水解产物麦芽三糖(DP3)和麦芽糖(DP2)，未进行进一步研究。1D 1H NMR光谱(图7)显示在δ5.41和5.37处具有α-异头信号；该区域可包含(α1→4)和(α1→3)连接的α-D-Glcp残基的异头信号。因此，还使级分F1-F5经受甲基化分析以确定(α1→4)和(α1→3)键的存在并确定支化度。甲基化分析数据与δ 5.37处对应于(α1→3)-连接残基的峰相符(表2)。Biogel P2级分的1H NMR和甲基化分析表明，(α1→3)键的百分比随着产物的DP的增加而增加(表2)。包含DP＞30的聚合物材料的最高分子量产物F1显示→3)Glcp(1→葡糖基单元(28％)和支化→3，4)Glcp(1→葡糖基(8％)在总反应产物混合物中的百分比增加分别为16％和4％。
表2：由0.6％(w v-1)的直链淀粉V与25μg mL-1的发酵乳杆菌GTFB的温育获得的产 物混合物通过尺寸排阻色谱法在Biogel P2上产生的级分(F1-F7)的键组成。
Figure BDA0001886861100000281
a数据表示在1H NMR光谱中，(α1→4)键信号的峰值区域在5.41ppm处与(α1→3)键信号的峰值区域在5.37ppm处的积分比。
b基于GLC强度，以摩尔百分比显示键分布数据。
为了阐明存在于级分F1中的结构元素，进行了2D NMR(13C-1HHSQC、1H-1H TOCSY和1H-1H ROESY)实验(图9)。
聚合物级分F1的结构分析
多糖产物(F1)的1D 1H NMR光谱(图9)在δ 5.41ppm和δ 5.37ppm处显示出尖锐的异头信号，符合以6∶4的比率存在的(α1→4)连接的葡萄糖单元和(α1→3)连接的葡萄糖单元，这符合甲基化分析数据(表2)。表3汇总了NMR数据。
在δ 5.41异头轨迹中观察到至少三种重叠类型的残基，如从2D 1H-1HCOSY光谱(图9)中的H2信号分别在δ 3.59、3.63和3.69处证实的那样。在具有60ms(未示出)和150ms(图9)混合时间的2D TOCSY光谱中的进一步分析能够分别在δ 3.70、3.85和3.97处解析三个H-3信号，并且在δ 3.65-3.67和3.42处解析H-4信号。就末端α-D-Glcp-(1→4)-残基而言，H-2、H-3和H-4信号预期分别在δ 3.57、3.71和3.42处，对于(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-残基，H-2、H-3和H-4预期分别在δ 3.63、3.96和3.65处，而(1→3)-α-D-Glcp-(1→4)-残基应该使H-2、H-3和H-4分别在δ 3.68、3.85和3.65处。2D13C-1H HSQC光谱显示13C化学位移，这与这些残基预期的1H化学位移相关。最值得注意的是，δ 78.8处的4-取代C-4值与δ 3.65处的H-4和δ 80.4处的C-3相关，这与δ 3.85ppm处的H-3相关。在2D NMR光谱中观察到的数据符合这三种类型残基的出现。
在δ5.37异头轨迹中，2D 1H-1H COSY光谱(图9)显示在δ 3.57和3.61处的H2信号，表明存在至少两种类型的残基。2D 1H-1H TOCSY光谱显示在δ 3.75和4.03处的H-3信号，在δ3.67和3.43处的H-4信号以及在δ 4.16处的H-5信号。H-2-H-4在δ 3.57、3.75、3.43处的信号分别对应于末端α-D-Glcp-(1→3)-单元预期的信号。该单元的H-5信号预期在δ约4.02处，其与相同化学位移处的强H-3信号重叠。2D13C-1H HSQC光谱(图9)显示与δ 4.02处的1H化学位移相关的C-5(δ 72.4)和C-3值(δ 74.3)，表明如末端α-D-Glcp-(1→3)-残基预期的那样在δ 4.02处出现H-5。对于H-2-H-5，δ 3.61、4.03、3.67和4.16的其余组合与-(1→4)-α-D-Glcp-(1→3)-残基一致。2D 13C-1H HSQC光谱(图9)证实了1H化学位移的分配，显示与δ3.65处的H-4相关的未取代的C-4值δ 71.2与4-取代的α-D-Glcp-(1→3)-残基相符。虽然未发现3，4-二取代残基的明显信号，但在δ 3.42ppm和3.43ppm处观察到如结构报告基因信号指示的显著量的末端残基，表示相对于异头信号的8.4％。由于仅观察到(α1→4)和(α1→3)异头信号，因此支链残基必须是3，4-二取代的。甲基化分析数据(表2)进一步支持了这一点，表明F1中有约8％的3，4-二取代残基。
值得注意的是，(α1→3)-异头轨迹在δ 3.85处不显示H-3信号，而2D13C-1H HSQC光谱显示在δ 3.85处仅3-取代的C-3(δ 80.4)与H-3相关，并且2D 1H-1H ROESY光谱(图9，红色)显示在δ 3.85处(α1→3)-异头信号仅与H-3之间的残基间相关性，表明未出现顺序的(α1→3)-键。此外，4-取代的C-4：H-4信号仅在δ 78.8：3.65-3.67ppm处观察到。
表3：由发酵乳杆菌GTFB聚合物产物级分F1的1D和2D NMR光谱确定的1H和13C化学 位移。
A B C D E F
<sup>1</sup>H <sup>13</sup>C <sup>1</sup>H <sup>13</sup>C <sup>1</sup>H <sup>13</sup>C <sup>1</sup>H <sup>13</sup>C <sup>1</sup>H <sup>13</sup>C <sup>1</sup>H <sup>13</sup>C
1 5.41 100.6 5.41 100.6 5.37 100.0 5.41 100.6 5.41 100.6 5.37 100.0
2 3.63 72.3 3.69 71.3 3.61 72.3 3.69 71.3 3.59 72.3 3.57 72.3
3 3.97 74.2 3.85 80.4 4.03 74.2 3.85 80.4 3.70 73.5 3.75 73.5
4 3.65 77.8 3.66 71.3 3.67 77.8 3.66 77.8 3.42 70.3 3.43 70.3
5 3.85 72.0 3.75 73.5 4.16 71.3 3.85 72.0 3.75 73.5 4.02 72.9
6a 3.87 61.3 3.87 61.3 3.87 61.3 3.87 61.3 3.87 61.3 3.87 61.3
6b 3.77 3.77 3.77 3.77 3.77 3.77
Smith降解分析
为了证实不存在连续的(α1→3)-键，在温和酸性条件下用NaIO4对F1样品进行Smith降解，之后用NaBH4还原并用甲酸温和水解。考虑到键分析，预期有[α-D-Glcp-(1→3)-]nα-D-Glcp-(1→2)-L-赤藓糖醇的片段，并且由于过量水解赤藓糖醇预期有[α-D-Glcp-(1→3)-]nD-Glcp片段。HPAEC-PAD分析显示2分钟至6分钟洗脱时间之间的片段峰。由于预期[α-D-Glcp-(1→3)-]nα-D-Glcp-(1→2)-L-赤藓糖醇和[α-D-Glcp-(1→3)-]nD-Glcp(n≥1)的片段的保留时间超过10分钟，这些结果支持所建议的不存在连续(α1→3)-键。
构建F1的复合模型
F1的1D 1H NMR光谱中分别针对α-D-Glcp-(1→3)-残基和α-D-Glcp-(1→4)-残基在δ 3.43和3.42处的结构报告基因信号指示发生8.4％支化。两个不同峰的相对强度相等，表明有4.2％的α-D-Glcp-(1→3)-残基和4.2％的α-D-Glcp-(1→4)-残基。考虑到没有连续的(α1→3)-连接的残基，所有3-取代残基必须为(α1→4)-连接的。另外，支链残基也为(1→3，4)-α-D-Glcp-(1→4)-残基，量为8.4％。由于观察到40％的(α1→3)键，因此31.6％的残基必须是-(1→3)-α-D-Glcp-(1→4)-残基。由于4.2％的(α1→3)-连接残基为末端，因此存在35.8％的-(1→4)-α-D-Glcp-(1→3)-残基。这剩下15.8％的-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-残基。综合来自1D和2D NMR光谱分析、甲基化分析和Smith降解分析的所有数据，构建F1的复合模型，以正确的相对丰度显示所有所鉴定的结构元素(图10)。
通过发酵乳杆菌GTFB酶由麦芽七糖和直链淀粉V及时形成低聚糖
为了更好地理解发酵乳杆菌GTFB酶的作用模式，用麦芽七糖和直链淀粉V底物进行时间进程实验。通过HPAEC分析反应10分钟、1小时和24小时后形成的低聚糖产物。在与麦芽七糖(略微被G6和G5污染)反应的早期阶段，G2被鉴定为主要反应产物(图11A)。还鉴定了对应于葡萄糖(G1)和麦芽三糖(G3)的较小峰，而具有未知结构但具有高DP的峰在58分钟处洗脱。G2的释放以及具有较高DP的化合物的合成同时表明发酵乳杆菌GTFB酶催化麦芽五糖基单元向MOS受体底物的转移。随后随时间推移，DP2至5的葡萄糖和MOS的量增加，而在24小时后，G6和G7耗尽。此外，由于发酵乳杆菌GTFB歧化活性，在比G7起始底物的保留时间短和长的保留时间处检测到了不符合MOS保留时间且可能对应于包含(1→3)键的低聚糖的峰。与直链淀粉V温育得到G2作为第一澄清反应产物，同时得到G1、G3、G4、G5(图12A)。当G7和直链淀粉V都用作底物时，这些曲线与用罗伊氏乳杆菌121GTFB酶获得的曲线显着不同(图11B和图12B)。对于两种底物，罗伊氏乳杆菌121GTFB在反应开始时释放葡萄糖(而不是G2)作为主要第一产物。对于罗伊氏乳杆菌121GTFB，没有看到由发酵乳杆菌GTFB产生的具有DP2至DP5的MOS的明显积聚。这些结果表明发酵乳杆菌和罗伊氏乳杆菌121GTFB酶的聚合机理不同。新型发酵乳杆菌GTFB酶优先催化低DP的MOS转移，显示出更类似于圆褐固氮菌GTFD酶的作用模式。另一方面，发酵乳杆菌GTFB 4，3-α-GT似乎需要具有一定最小长度(至少DP6)的MOS作用于并产生具有α(1→3)/(1→4)交替结构和具有α(1→3)支化点的α-葡聚糖。最后，数据表明发酵乳杆菌GTFB 4，3-α-GT可存在多于一个供体结合亚位点，如在属于进化相关GH13和GH77家族的酶的情况下所观察到的那样。
酶促处理发酵乳杆菌GTFB产物
为了进一步表征由发酵乳杆菌GTFB酶(Biogel P2级分F1)合成的聚合物，用高活性剂量的α-淀粉酶、右旋糖苷酶和普鲁兰酶处理该α-葡聚糖。由发酵乳杆菌GTFB产生的聚合物对α-淀粉酶的内切(1→4)-水解酶活性具有抗性。如TLC分析显示，在α-淀粉酶消化48小时后仅检测到痕量的葡萄糖、麦芽糖和高分子量低聚糖(图13)。在相同的反应条件下，淀粉对照底物完全水解，表明α-(1→3)键的存在使得发酵乳杆菌GTFB聚合物对α-淀粉酶消化具有抗性。发酵乳杆菌GTFB聚合物也经受右旋糖苷酶和普鲁兰酶酶促处理。右旋糖苷酶催化右旋糖酐中连续(1→6)键的内切水解，而普鲁兰酶裂解普鲁兰多糖、支链淀粉和淀粉的α-极限糊精和β-极限糊精中存在的(1→6)键。因此，对于右旋糖苷酶和普鲁兰酶处理，分别包括通过罗伊氏乳杆菌GTFB和圆褐固氮菌GTFD由直链淀粉V产生的聚合物作为阳性对照。正如预期的那样，右旋糖苷酶有效地水解由罗伊氏乳杆菌121GTFB产生的IMMP，而普鲁兰酶完全消化由圆褐固氮菌GTFD酶合成的罗伊氏糖样聚合物。相比之下，在发酵乳杆菌GTFB聚合物的情况下未观察到水解，这与从1H NMR分析推导出的不存在(1→6)键(小于1％)一致。
结论
该工作鉴定和表征了由发酵乳杆菌NCC 2970编码的第一GH70酶裂解(α1→4)-键和合成(α1→3)-键。本发明人提出将该酶(α1→4)-α-D-葡聚糖命名为：(α1→4)，(α1→3)-α-D-葡聚糖α-葡聚糖转移酶，简称为4，3-α-葡聚糖转移酶。关于其一级序列，该蛋白质明显属于新型GTFB样GH70亚族，初始仅包含4，6-α-葡聚糖转移酶，然而，它也具有形成GS的受体结合亚位点的残基的独特变异，表明其活性位点显示出不同的特征。根据这些发现，发酵乳杆菌GTFB在使用麦芽糖糊精和淀粉作为底物而不是催化连续(α1→6)键的合成时类似于先前表征的GTFB酶，它显示出(α1→3)键特异性。发酵乳杆菌活性导致合成独特的α-葡聚糖，该α-葡聚糖由不同长度的麦芽低聚糖构成，通过线性和支链取向的单(α1→3)键相互连接。
尽管GS具有广泛的产物光谱并且合成各种类型的键，但迄今为止所表征的GS中没有一个产生由(α1→4)-键和(α1→3)-键组成的α-葡聚糖。发酵乳杆菌GTFB产物的结构也不同于对应于在不同的地衣和真菌中发现的包含(α1→4)-键和(α1→3)-键二者的α-葡聚糖的结构。实际上，这些多糖中的大多数具有线性结构，而其它多糖主要由(α1→3)-键组成和/或不存在(α1→3，4)-支化点。发酵乳杆菌GTFB对食物基质中存在的淀粉的直接作用提供具有与低消化率一致的结构特征的淀粉衍生物。

Claims (13)

1.制备包含(α1→3)连接的D-葡萄糖单元的α-葡聚糖的方法，所述方法包括使在其非还原端包含至少两个(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的多糖或低聚糖底物与能够裂解(α1→4)糖苷键并建立新(α1→3)糖苷键的α-葡聚糖转移酶接触，以形成具有与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分的葡萄糖聚合物，而不形成连续的(α1→3)糖苷键；其中所述α-葡聚糖转移酶为发酵乳杆菌GTFB酶；且其中所述α-葡聚糖转移酶包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述底物具有至少五的聚合度。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述底物选自淀粉、淀粉衍生物、麦芽低聚糖、葡萄糖低聚糖、直链淀粉、支链淀粉、麦芽糖糊精、(α1→4)葡聚糖以及它们的组合。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述底物包含在谷物面粉中。
5.包含与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分并且具有(α1→3,4)支化点的α-葡聚糖，其中所述α-葡聚糖具有至少3％的支化比，包含小于1重量％的连续(α1→3)键，并且具有5×102Da至1×107Da的平均分子量。
6.包含根据权利要求5所述的α-葡聚糖的食物组合物。
7.根据权利要求6所述的食物组合物，其中所述食物组合物为饮料；早餐谷物；宠物食物产品；烘焙面团产品；或糖食产品。
8.包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖转移酶用于减少食物材料的可消化性碳水化合物的用途，其中所述α-葡聚糖转移酶为发酵乳杆菌GTFB酶，且能够裂解(α1→4)糖苷键并建立新(α1→3)糖苷键。
9.包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的核酸序列的细菌，其中所述核酸编码发酵乳杆菌GTFB酶，且所述发酵乳杆菌GTFB酶能够裂解(α1→4)糖苷键并建立新(α1→3)糖苷键。
10.根据权利要求9所述的细菌，其中所述细菌是发酵乳杆菌。
11.发酵乳杆菌CNCM I-5068。
12.包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖转移酶，其中所述α-葡聚糖转移酶是来自发酵乳杆菌的GTFB酶，且能够裂解(α1→4)糖苷键并建立新(α1→3)糖苷键。
13.表达载体，所述表达载体包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的多肽，其中所述多肽是来自发酵乳杆菌的GTFB酶，且能够裂解(α1→4)糖苷键并建立新(α1→3)糖苷键。
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