JP7106460B2 - αグルカン - Google Patents
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Description
A)(保存領域II):D991におけるAsp(L.ロイテリGTFB 4,6-α-グルカノトランスフェラーゼにおけるN1019のAsnの置換)
B)(保存領域IV):I1098におけるIle(L.ロイテリGTFB 4,6-α-グルカノトランスフェラーゼにおけるQ1126のGlnの置換)
C)(保存領域IV):N1100におけるAsn(L.ロイテリGTFB 4,6-α-グルカノトランスフェラーゼにおけるK1128のLysの置換)
イントロダクション
乳酸菌、特にロイコノストック(Leuconostoc)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ワイセラ(Weissella)属及びオエノコッカス(Oenococcus)属に存在するスクロースをα-グルカン多糖に変換するグルカンスクラーゼ酵素を準備するため、グリコシドヒドロラーゼファミリー70(www.CAZy.org)を最初に確立した。GS特異性に依存し、構造的に異なるα-グルカンが形成される。まずは、(α1→3)-(ムタン)又は(α1→6)結合(デキストラン)を有するα-グルカンを合成するグルカンスクラーゼ酵素の大部分が特性評価されており、また、近年では、(α1→2)又は(α1→4)結合を有する各種のα-グルカンが、グルカンスクラーゼ生成物として同定されている。交互の(α1→3)/(α1→6)結合(アルテルナン)(例えばロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)NRRL B-1355のアルテルナンスクラーゼ)又は(α1→4)/(α1→6)結合(ロイテラン)(例えばラクトバシラス・ロイテリ121のロイテランスクラーゼ)を有するα-グルカンを生産するいくつかのグルカンスクラーゼ酵素が特性評価されている。また、分岐位置は、同じ酵素によって、又はL.メセンテロイデス株の別の(α1→2)又は(α1→3)分岐導入酵素によって導入してもよい。GSはこのように、α-グリコシド結合[(α1→2)、(α1→3)、(α1→4)及び(α1→6)]の全4つの考えられる結合タイプを合成することが可能であるが、あるグリコシド結合の組み合わせは、同じα-グルカン内ではこれまで見つかっていない。例えば、α-グルカンを(α1→3)+(α1→4)結合で合成する野生型グルランスクラーゼ酵素は、今まで報告されていない。GSによって産生されるα-グルカンはまた、その分岐度、分子量、及び立体構造が異なる。かかる違いは、多様な産業工業的応用を可能にする様々な機能的特性を示すα-グルカンをもたらす。
L.ファーメンタムGTFBタンパク質配列の解析
クエリー配列としてL.ロイテリ121GTFB(GenBankアクセッション番号AAU08014.2)を用いたBLASTにより、ラクトバシラス・ファーメンタムNCC 2970ゲノム(配列番号2)の解析を行い、GH70タンパク質をコードする遺伝子の同定を可能にした。非冗長タンパク質配列データベースに対するNCBI BLASTp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)検索を用い、L.ファーメンタムGH70タンパク質配列との類似性を示す配列を発見した。複数のアミノ酸配列アラインメントは、Jalview 2デスクトップアプリケーションを用い、Clustal W2により作成した。シグナルペプチドの有無は、Signal P4サーバを用いて解析した。L.ファーメンタムGTFBタンパク質の細胞内の局在は、CELLO v.2.5:subCELlular Localizationプレディクター(http://cello.life.nctu.edu.tw/)を用いて予測した。GTFBタンパク質のMw(分子量)の理論値は、ExPASy Compute pI/Mw(http://web.expasy.org/compute_pi/)において予測した。
Phusion DNAポリメラーゼ(Finnzyme社、ヘルシンキ、フィンランド)を使用して、GTFBタンパク質(アミノ酸616-1593)のN末端欠失バージョンをコードするDNA断片を、L.ファーメンタムNCC 2970染色体DNAから増幅し、ライゲーション独立クローニング(LIC)を用いて修飾pET15bベクターへクローニングした。N末端欠失のgtfB遺伝子変異体の増幅に用いたプライマーは、LICクローニングを容易にするための5’伸長部分を有し(下線)、以下のとおりである:フォワード:CAGGGACCCGGTTTTGGTAAAGATGGTCGGATTG及びリバース:CGAGGAGAAGCCCGGTTAATTGTCTTCAATATTAGCATAATAATC。得られたPCR産物をアガロースバンドから精製し、dATPの存在下で、T4 DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社)の3’→5’エキソヌクレアーゼ活性により切断した。同時に、pET-15b/LICベクターをKpnIにより切断し、ゲルから単離し、次にdTTPの存在下でT4 DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社)で処理した。処理したpET-15b/LICベクター及びアンプリコンを1:4のモル比で混合し、混合物を用いて大腸菌DH5α細胞(Phabagen社)を形質転換した。これにより、3Cプロテアーゼによって切断可能なN末端His6タグを含むgtfB-ΔN構築物を得た。構築された発現ベクターpET15b/gtfB-ΔNを用い、宿主大腸菌BL21 Star(DE3)を形質転換した。遺伝子配列は、ヌクレオチドシークエンシング(GATC社、ケルン、ドイツ)により決定した。
L.ファーメンタムGTFB酵素の発現のため、pET15b/gtfB-ΔNで形質転換した大腸菌star BL21(DE3)の一晩培養液を、アンピシリン(100μg/mL)を添加した新鮮なLB培地で1:100に希釈し、600nmでの光学密度が約0.4に達するまで、37℃及び220rpmで増殖させた。次に、培養温度を16℃に低下させ、誘導因子であるイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドを0.1mMの終濃度で添加した。20時間後、細胞を遠心分離(10,000g×20分)により回収し、その後製造業者(Thermo Scientific、Pierce)により記載のプロトコルに従い、B-PER溶解試薬により破砕した。組換えGTFBタンパク質は、カラム材料としてNi2+-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)を用いたHisタグアフィニティークロマトグラフィー(シグマアルドリッチ社)により、無細胞抽出物から単離した。25mMのトリス-HCl(pH8.0)(1mMのCaCl2)によりカラムを洗浄した後、結合したタンパク質を、同じ緩衝液中の200mMイミダゾールにより溶出させ、イミダゾールは、分子量カットオフ30,000の撹拌限外濾過ユニット(Amicon、ベヴァリー、MA)を用いて除去した。更なる精製のため、タンパク質を1mLのHiTrapカラム(GE Healthcare社)にロードし、20mMのトリス-HCl緩衝液(pH8.0)(1mMのCaCl2を含む)中のNaCl(0~1M)の直線勾配を用いて溶出させた(1mL/分の流量)。Akta高速タンパク質液体クロマトグラフ(FPLC、GE Healthcare社、ウプサラ、スウェーデン)を用いて1mLのフラクションを回収した。限外濾過(YM30膜、ミリポア社、ビルリカ、MA)によりバッファー交換した。精製の過程は、フラクションのSDS-PAGE解析により評価し、タンパク質濃度は、Nanodrop 2000分光光度計(Isogen Life Science社、De Meern、オランダ)を用いて求めた。
L.ファーメンタムGTFB-ΔN酵素の総活性は、最初にアミロース-ヨウ素法で測定した(Gangoiti J,Pijning T,Dijkhuizen L.,Appl Environ Microbiol 82:756~766.(2015)、Bai Y,van der Kaaij RM,Leemhuis H,Pijning T,van Leeuwen SS,Jin Z,Dijkhuizen L.,2015.Appl Environ Microbiol 81:7223~7232.(2015))。グリコシル化及び/又は加水分解活性から生じるα-グルカン-ヨウ素錯体の吸光度の減少を、40℃で14分間、660nmでモニターした。反応混合物は、0.125%(w/v)のアミロースV(AVEBE社、Foxhol、オランダ)、酵素2.5μg/mL、25mMの酢酸ナトリウム(pH5.5)及び1mMのCaCl2を含有した。活性の単位は、1分あたりに基質1mgを変換する酵素の量である。
L.ファーメンタムGTFB-ΔN(25μg/mL)を、別々に、25mMのスクロース(Acros社)、ニゲロース(シグマアルドリッチ社)、パノース(シグマアルドリッチ社)、イソマルトース(シグマアルドリッチ社)、イソマルトトリオース(シグマアルドリッチ社)、イソマルトペンタオース(Carbosynth社)、重合度(DP)2~7のマルトオリゴ糖(MOS)、及び0.6%(w/v)のアミロースV(AVEBE、Foxhol、オランダ)、ジャガイモデンプン(シグマアルドリッチ社)及びアミロペクチン(シグマアルドリッチ社)と共にインキュベートした。すべての反応は、24時間37℃で、1mMのCaCl2を含む25mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)で実施した。100℃で6分間インキュベートし、反応を停止させた。薄層クロマトグラフィー(TLC)及び/又は高性能-アニオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)により反応の経過をモニターした。
薄層クロマトグラフィー(TLC)は、シリカゲル60 F254(20×20cmのTLCシート、メルク社、ダルムシュタット、ドイツ)で実施した。TLCプレートは、n-ブタノール:酢酸:水(2:1:1、v/v)の溶媒系で6時間にわたり展開させた。炭水化物は、オルシノール/硫酸染色によって視覚化し、グルコース及びMOS(DP2~DP7)の混合物を同時に展開させて比較した。
生成混合物のHPSEC解析は、マルチアングルレーザー光散乱検出器(SLD 7000 PSS、マインツ)、粘度計(ETA-2010 PSS、マインツ)及び示差屈折率検出器(G1362A 1260 RID Agilent Technologies)を装備したサイズ排除クロマトグラフィーシステム(Agilent Technologies 1260 Infinity)を用いて実施した(Gangoiti J,van Leeuwen S,Vafiadi C,Dijkhuizen L.,Biochem Biophys Act 1860:1224~1236.(2016))。PFGガードカラムに連結した、100、300及び4,000Åの空隙率を有する3本のPFG-SECカラムを用いて分離を行った。溶出剤としてDMSO-LiBr(0.05M)を、0.5mL/分の流量で用いた。342~805,000DaまでのMwの標準プルランキット(PSS、マインツ、ドイツ)を用い、システムの較正及びバリデーションを行った。RI増加値の比率dn/dcもまたPSSで測定し、数値は0.072mL/gであった。アミロースV及びL.ファーメンタムGTFB-ΔN酵素により生成したポリマーの分子量を測定するため、マルチアングルレーザー光散乱シグナルを用いた。このシステムにおけるこれらの多糖類のRI増加値の比dn/dcはプルランと同じである。ユニバーサル較正法を用い、L.ロイテリGTFB-ΔNポリマーの分子量を測定した。WinGPC Unityソフトウェア(PSS、Mainz)をデータ処理に用いた。測定は二度行った。
「L.ファーメンタムGTFBによる基質利用」で上記した条件に従い、精製GTFB-ΔN(0.25mg)を37℃で48時間、アミロースVとインキュベートした。得られた生成混合物を、48mL/hの流量で、溶出剤として10mMのNH4HCO3を用い、BioGel P2カラム(2.5×50cm、バイオラド社、Veenendaal、オランダ)でのサイズ排除クロマトグラフィーにより分画した。異なるBiogel P2プールに存在する多糖/オリゴ糖を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF-MS)、核磁気共鳴(NMR)分光法及びメチル化分析により解析した。
MALDI-TOF-MS測定は、窒素レーザー(337nm、3nsパルス幅)を装備したAxima(商標)質量分析装置(Shimadzu Kratos Inc.,Manchester,UK)により記録した。試料溶液(1μL)をMALDI目標にスポットし、直後に10%(w/v)の2,5-ジヒドロキシ安息香酸マトリックス水溶液1μLと混合した。陽性イオンモードのスペクトルを、5000の半値幅(FWHM)の解像度及び遅延抽出(450ナノ秒)のリフレクターモードを用いて記録した。質量スペクトルは通常、200のイオンゲートブランキングで、1~5000Daで得た。
一及び二次元1Hの核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、溶媒としてD2Oを用い、298Kのプローブ温度で、Varian Inova 500スペクトロメーター(NMRセンター、フローニンゲン大学)で記録した。分析前に、サンプルをD2O(99.9atom% D、Cambridge Isotope Laboratories、アンドーバー、MA)で二回バッファー交換し、中間の凍結乾燥を経て、0.6mLのD2Oに溶解させた。すべてのNMRスペクトルは、MestReNova 5.3(Mestrelabs Research SL、Santiago de Compostella、スペイン)により処理した。化学シフト(δ)はppmで表し、内部標準のアセトン(1Hでδ 2.225ppm、13Cでδ 31.07)により較正した。異なる結合のパーセンテージは、各シグナルピーク面積の積分値により推定した。
メチル化分析は文献に記載のとおり実施した(van Leeuwen SS,Kralj S,van Geel-Schutten IH,Gerwig GJ,Dijkhuizen L,Kamerling JP.,Carbohydr Res 343:1237~1250.(2008))。簡潔には、ポリマー及びオリゴ糖サンプル(約5mg)を、DMSO中でCH3I及び固体NaOHを用いて過メチル化し、次にトリフルオロ酢酸により加水分解した。部分的にメチル化された単糖を、NaBD4により還元した。得られた部分メチル化されたアルジトールを、120℃のピリジン:無水酢酸(1:1 v/v)を用いて過アセチル化し、部分メチル化されたアルジトールアセタート(PMAA)の混合物を得た。PMAAは、van Leeuwenら(2008)に記載のように、GLC-EI-MS及びGLC-FIDにより解析した。
1~2mgの多糖類のサンプルを、50mMのNaIO4を含む100mMのNaOAc(pH4.1)1mLに溶解させ、暗所において4℃で112時間撹拌した。300μLのエチレングリコールを添加して過剰なIO4 -を中和した。SpectraPor 1000Daカットオフ透析フローターを用いて、分解産物を48時間水道水で透析した。透析後、サンプルを室温で一晩、NaBH4により還元し、続いて上記のとおりの透析を行った。還元された多糖サンプルを、30分間90℃で、1mLの90%蟻酸溶液中で凍結乾燥し、加水分解した。室温に冷却した後、蟻酸をN2流中で蒸発させた。GLC-EI-MS及びGLC-FID、並びにVan Leeuwenら(2008)のHPAEC-PADにより、TMS誘導体として乾燥多糖フラグメントを解析した。
L.ファーメンタムGTFB-ΔNポリマーを、50mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に5mg/mLの濃度で溶解させ、それぞれ過剰量のα-アミラーゼ(アスペルギルス・オリゼ、Megazyme社)、デキストラナーゼ(ケトミウム・エラチカム、シグマアルドリッチ社)及びプルラナーゼM1(クレブシェラ・プランチコラ、Megazyme社)と37℃で48時間インキュベートした。デンプン、IMMP L.ロイテリ121 GTFBポリマー及びA.クロッカムのロイテラン様GTFDポリマーを、それぞれこれらの条件下で完全分解を生じるα-アミラーゼ、デキストラナーゼ及びプルラナーゼ処理の陽性対照として用いた。加水分解の程度はTLC分析により試験した。
L.ファーメンタムGTFBタンパク質配列の解析
L.ファーメンタムのゲノムのアノテーションから、単一のGH70ファミリータンパク質が同定された。L.ファーメンタムGH70タンパク質のBLASTp解析から、このタンパク質の最も近いホモログは、すべて同一性が47%以上のアミノ酸配列(表1)を有するGTFB様4,6-α-GTアーゼGH70サブファミリーのメンバーであることが明らかとなった。
L.ファーメンタムGTFB-ΔNタンパク質を、大腸菌BL21(DE3)Starにおいて良好に発現させた。用いた増殖及び誘導条件では、GTFB-ΔNの発現レベルは、可溶性及び不溶性フラクションにおいて比較的低かった(図4)。実験項にて説明したように、金属キレートクロマトグラフィー及びアニオン交換クロマトグラフィーからなる2つのクロマトグラフィー工程により、可溶性フラクションから酵素を精製した。精製された酵素のSDS-PAGE解析では、配列から推定される理論値に対応する、見かけの分子量が約110kDaの単一のタンパク質のバンドが見られた(図4)。この精製工程の結果、大腸菌培養液1Lあたり合計0.4mgの純粋なGTFB-ΔNタンパク質が得られた。
ホモロジーモチーフにおいて観察された相違は、L.ファーメンタムGTFBが新規な酵素反応及び/又は生成物特異性を有し得ることを示唆するものであった。したがって、L.ファーメンタムGTFB酵素を異なるオリゴ糖及び多糖と共に37℃で24時間インキュベートし、反応生成物をTLCにより解析した(図6)。L.ロイテリGTFBと同様、L.ファーメンタムGTFB酵素は、スクロース、パノース、ニゲロース及びDP2、DP3及びDP5のイソマルトオリゴ糖とは反応しなかった(データ非掲載)。その代わり、L.ファーメンタムGTFB酵素は、DP6及び7のマルトオリゴ糖(MOS)に対する加水分解及びトランスグリコシラーゼ(不均化)活性を示し、それはMOS基質以外の低分子及び高分子の生成物の蓄積から明白であった。しかしながら、L.ファーメンタムGTFBは、4以下のDPのMOSに対しては活性がなく、マルトペンタオース(DP5)に対する不均化活性は低かった。一方、L.ロイテリ121の場合、GTFB活性はマルトトリオース(DP3)において既に観察された。L.ファーメンタムGTFB酵素と、アミロースV、ジャガイモデンプン及びアミロペクチンとのインキュベートの結果、低分子量生成物に見られる外観が見られ、すなわち該酵素がこれらのポリマーに対する活性をも有することが示された。L.ファーメンタムGTFB酵素がL.ロイテリ121GTFBより顕著に多量のオリゴ糖生成物(主にアミロースVから合成された(修飾型)ポリマー)を産生した点に留意する必要がある。TLCにより観察されるように、DP2~5のMOSは各種のポリマー基質から蓄積され、すなわちL.ファーメンタムGTFBがグルコースドナー基質としてマルトヘキサオース又はそれ以上のMOSを必要とすることを物語るものである。
更に詳細な構造解析を行うため、L.ファーメンタムGTFBによりアミロースから産生される生成物を、Biogel P2でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。得られた7つのフラクション(F1~F7)をMALDI-TOF MS及び1H NMR分光法により別々に分析した(表2)。フラクションF6及びF7には、それぞれ、加水分解物マルトトリオース(DP3)及びマルトース(DP2)が含まれ、更なる試験には用いなかった。一次元1H NMRスペクトルは、δ 5.41及び5.37においてαアノマーシグナルを示し(図7)、この領域は、(α1→4)及び(α1→3)結合α-D-Glcp残基のアノマーシグナルを両方含むと考えられる。したがって、(α1→4)及び(α1→3)結合の有無を測定し、分岐度を求めるため、フラクションF1~F5ではメチル化分析も行った。メチル化分析データは、(α1→3)結合残基に対応するδ 5.37のピークに該当した(表2)。Biogel P2フラクションの1H NMR及びメチル化分析から、(α1→3)結合のパーセンテージが、生成物のDPの増加と共に増加することが証明された(表2)。DP>30の重合物を含む、最も高い分子量の生成物フラクションであるF1では、全反応生成混合物における16%及び4%と比較し、それぞれ→3)Glcp(1→グルコシル単位(28%)及び分岐→3,4)Glcp(1→グルコシル単位(8%)のパーセンテージが増加していた。
b結合分布データを、GLC強度に基づく分子パーセントにて示す。
多糖生成物(F1)の一次元1H NMRスペクトル(図9)では鋭いアノマーシグナルがδ 5.41及びδ 5.37ppmにおいて示され、それぞれ、(α1→4)及び(α1→3)結合グルコース単位が、6:4の比率で存在することが、メチル化分析データ(表2)と整合した。表3は、NMRデータをまとめたものである。
連続的な(α1→3)結合がないことを確認するため、F1のサンプルを緩酸性条件でNaIO4によるスミス分解に供し、続いてNaBH4による還元及び蟻酸による穏やかな加水分解に供した。結合解析を考慮すると、過剰な加水分解によるエリトリトール及び[α-D-Glcp-(1→3)]nD-Glcp断片に起因する断片[α-D-Glcp-(1→3)-]nα-D-Glcp-(1→2)-L-エリトリトールが、予想される。HPAEC-PAD分析では、2分間及び6分間の溶出時間でフラグメントのピークを示した。断片[α-D-Glcp-(1→3)]nα-D-Glcp-(1→2)-L-エリトリトール及び[α-D-Glcp-(1→3)]nD-Glcp(n≧1)の保持時間は10分を上回ると予想されるため、これらの結果は、連続する(α1→3)結合が存在しないことを示唆する。
F1の一次元1H NMRのスペクトルにおける、α-D-Glcp-(1→3)-及びα-D-Glcp-(1→4)-残基に対応する、それぞれδ 3.43及び3.42の構造レポーターシグナルは、8.4%の分岐形成を示す。2つの特徴的なピークの相対強度は等しく、4.2% α-D-Glcp-(1→3)-残基及び4.2% α-D-Glcp-(1→4)-残基を示す。連続する(α1→3)結合残基がないことを考慮すると、すべての3-置換残基は(α1→4)結合でなければならない。また、分岐残基は(1→3,4)-α-D-Glcp-(1→4)-残基であり、8.4%に達する。40%(α1→3)の結合が観察されたため、残基の31.6%は-(1→3)-α-D-Glcp-(1→4)-残基でなければならない。(α1→3)結合残基の4.2%が末端であるため、35.8%の-(1→4)-α-D-Glcp-(1→3)残基が存在する。これより、15.8%の(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)残基が残る。一次元及び二次元NMR分光分析、メチル化分析及びスミス分解分析によるすべてのデータを総合すると、F1の複合モデルが構築され、同定されたすべての構造エレメントが正しい相対量を示している(図10)。
L.ファーメンタムGTFB酵素の作用パターンをより詳細に解明するため、時間経過による実験を、マルトヘプタオース及びアミロースV基質を用いて実施した。10分間、1時間及び24時間の反応後に形成されたオリゴ糖生成物をHPAECにより分析した。マルトヘプタオース(G6及びG5がわずかに混入)との反応の初期において、G2が主な反応生成物として同定された(図11A)。グルコース(G1)及びマルトトリオース(G3)に対応する小規模なピークも同定されたが、また未知の構造であるが高DP含量のピークが58分の時点で溶出された。G2の遊離は、L.ファーメンタムGTFB酵素が、DP含量の高い化合物の合成と共に、マルトペンタオシル単位のMOSアクセプター基質への転移を触媒することを示唆する。時間の経過後、グルコース及びDP2~5を有するMOSの量が増加し、一方、24時間後にG6及びG7が減少した。更に、L.ファーメンタムGTFBの不均化活性の結果として、MOS滞留時間にフィットせず、おそらく(1→3)結合を含むオリゴ糖に対応するピークが、G7の開始基質のそれより短い、及び長い保持時間で検出された。アミロースVとのインキュベートにより、G1、G3、G4、G5と共に、第1の明瞭な反応生成物としてG2が得られた(図12A)。これらのプロファイルは、G7及びアミロースVが共に基質として用いられたときにL.ロイテリ121GTFB酵素により得られたものとは著しく異なった(図11B及び図12B)。両基質において、L.ロイテリ121GTFBは、反応の初期に主要な第1の生成物として、(G2の代わりに)グルコースを遊離させる。L.ファーメンタムGTFBによるDP2~DP5を含むMOSの顕著な蓄積は、L.ロイテリ121GTFBでは見られなかった。これらの結果は、L.ファーメンタム及びL.ロイテリ121GTFB酵素が、それらの重合メカニズムにおいて異なることを示唆する。新規なL.ファーメンタムGTFB酵素は、低分子DPのMOSの転移を優先的に触媒し、A.クロオコッカムGTFD酵素のそれに類似する作用様式を示す。一方、L.ファーメンタムGTFB4,3-α-GTでは、特定の最小限長(少なくともDP6)のMOSが、酵素活性に、並びにα(1→3)/(1→4)の交互の構造及びα(1→3)分岐点を有するα-グルカンの産生に必要であると考えられる。最後に、進化的に関連するGH13及びGH77ファミリーに属する酵素の場合に観察されるように、上記のデータは、L.ファーメンタムGTFBの4,3-α-GTが複数のドナー結合サブ部位を有することを示す。
L.ファーメンタムGTFB酵素(Biogel P2のフラクションF1)により合成されるポリマーを更に解析するため、このα-グルカンを、高い活性量のα-アミラーゼ、デキストラナーゼ及びプルラナーゼ酵素で処理した。L.ファーメンタムGTFBにより産生されるポリマーは、α-アミラーゼのエンド-(1→4)加水分解活性に対する抵抗性を示した。TLC分析により明らかなように、グルコース、マルトース及び高分子量オリゴ糖は、48時間のα-アミラーゼ分解後、極微量が検出された(図13)。同じ反応条件下で、デンプン対照基質は完全に加水分解され、α-(1→3)結合の存在がL.ファーメンタムGTFBポリマーをα-アミラーゼ消化に対して耐性にすることを示した。L.ファーメンタムGTFBポリマーを、デキストラナーゼ及びプルラナーゼ酵素処理にも供した。デキストラナーゼはデキストランにおける連続する(1→6)結合のエンド加水分解を触媒し、一方、プルラナーゼはプルラン、デンプンのアミロペクチン及びα-及びβ-限界デキストリンに存在する(1→6)結合を切断する。すなわち、デキストラナーゼ及びプルラナーゼ処理において、アミロースVからL.ロイテリGTFB及びA.クロオコッカムGTFDにより産生されるポリマーをそれぞれ陽性対照として含めた。予想通り、デキストラナーゼは、L.ロイテリ121GTFBにより産生されるIMMPを効率的に加水分解し、一方プルラナーゼは、A.クロオコッカムGTFD酵素により合成されるロイテラン様ポリマーを完全に消化した。対照的に、L.ファーメンタムGTFBポリマーの場合、加水分解は観察されず、1H NMR分析から推論される(1→6)結合の欠如(1%未満)と一致していた。
本実施例は、L.ファーメンタムNCC2970がコードする、(α1→4)結合を切断し、(α1→3)結合を合成するGH70酵素を初めて同定し、解析したものである。発明者らは、この酵素を(α1→4)-α-D-グルカン:(α1→4)、(α1→3)-α-D-グルカンα-グルカノトランスフェラーゼ、略して4,3-α-グルカノトランスフェラーゼと命名することを提案する。その一次配列に関して、このタンパク質は明らかに、元来4,6-α-グルカノトランスフェラーゼを唯一含む新規なGTFB様GH70サブファミリーに属するが、しかしながら、それはまた、GSのアクセプター結合サブ部位を形成する残基における独自の変異を有し、その活性部位が独自の特徴を示すことを示唆している。これらの知見と一致するように、L.ファーメンタムGTFBは、基質としてマルトデキストリン及びデンプンを用いる点で、従来同定されたGTFB酵素に類似するが、連続する(α1→6)結合の合成を触媒する代わりに、(α1→3)結合に対する特異性を示す。L.ファーメンタム活性により、直鎖方向及び分岐方向における単一の(α1→3)結合により相互に結合した、異なるマルトオリゴ糖の長さを有する独特のα-グルカン構造が合成される。
Claims (13)
- (α1→3)結合したD-グルコース単位を含むα-グルカンの製造方法であって、
非還元末端に少なくとも2つの(α1→4)結合したD-グルコース単位を含む多糖又はオリゴ糖基質を、(α1→4)グルコシド結合を切断でき、かつ新しい(α1→3)グルコシド結合を生成できるα-グルカノトランスフェラーゼ酵素と接触させて、連続する(α1→3)グルコシド結合を形成することなく、(α1→3)グルコシド結合を散在させた(α1→4)結合したD-グルコース単位の直鎖状セグメントを有するグルコースポリマーを形成するステップを含み、
前記α-グルカノトランスフェラーゼが、配列番号1に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。 - 前記基質が、少なくとも5の重合度を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記基質が、デンプン、デンプン誘導体、マルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、マルトデキストリン、(α1→4)グルカン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記基質が、穀粉中に含まれる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- (α1→3)グルコシド結合が散在しており、(α1→3,4)分岐点を有する、(α1→4)結合したD-グルコース単位の直鎖状セグメントを含むα-グルカンであって、
前記α-グルカンが少なくとも3%の分岐比率を有し、1重量%未満で連続する(α1→3)結合を含み、5×102Da~1×107Daの平均分子質量を有し、
前記α-グルカンが、配列番号1に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むα-グルカノトランスフェラーゼ酵素を用いて得られたものであり、
前記α-グルカノトランスフェラーゼ酵素が、非還元末端に少なくとも2つの(α1→4)結合したD-グルコース単位を含む多糖又はオリゴ糖基質を用いて(α1→4)グルコシド結合を切断でき、かつ新しい(α1→3)グルコシド結合を生成できるものである、α-グルカン。 - 請求項5に記載のα-グルカンを含む食品組成物。
- 前記食品組成物が、飲料、朝食用シリアル、ペットフード製品、焼成された生地製品、又は菓子製品である、請求項6に記載の食品組成物。
- 食品材料の消化性炭水化物を還元するための、配列番号1に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むα-グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用であって、
前記α-グルカノトランスフェラーゼ酵素が、非還元末端に少なくとも2つの(α1→4)結合したD-グルコース単位を含む多糖又はオリゴ糖基質を用いて(α1→4)グルコシド結合を切断でき、かつ新しい(α1→3)グルコシド結合を生成できるものである、使用。 - 配列番号2に対して少なくとも90%の同一性を有する核酸配列を含む細菌であって、
前記核酸配列が、非還元末端に少なくとも2つの(α1→4)結合したD-グルコース単位を含む多糖又はオリゴ糖基質を用いて(α1→4)グルコシド結合を切断でき、かつ新しい(α1→3)グルコシド結合を生成できるα-グルカノトランスフェラーゼをコードするものである、細菌。 - 前記細菌がラクトバシラス・ファーメンタムである、請求項9に記載の細菌。
- ラクトバシラス・ファーメンタムCNCM I-5068。
- 配列番号1に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、非還元末端に少なくとも2つの(α1→4)結合したD-グルコース単位を含む多糖又はオリゴ糖基質を用いて(α1→4)グルコシド結合を切断でき、かつ新しい(α1→3)グルコシド結合を生成できるものである、α-グルカノトランスフェラーゼ酵素。
- 配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、
前記ポリペプチドが、非還元末端に少なくとも2つの(α1→4)結合したD-グルコース単位を含む多糖又はオリゴ糖基質を用いて(α1→4)グルコシド結合を切断でき、かつ新しい(α1→3)グルコシド結合を生成できる酵素をコードするものである、発現ベクター。
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