JPH0545235B2

JPH0545235B2 -

Info

Publication number: JPH0545235B2
Application number: JP20886285A
Authority: JP
Inventors: Kyoshi Nakayama; Akiko Morita; Yukie Ogawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1985-09-24
Filing date: 1985-09-24
Publication date: 1993-07-08
Also published as: JPS6269995A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明はＯ−アシルカルニチンを生化学的に加
水分解してカルニチンを製造する方法に関するも
のである。本発明により製造されるカルニチン
は、脂肪酸代謝に関連する物質としてビタミン
Btと呼ばれたこともあり、心臓疾患等に医薬と
して利用される有用な物質である。従来はDL体
が医薬として使われてきたが、最近ではＬ体が注
目されている（例えば、医学のあゆみ、123巻、
660頁、1982年）。従来の技術従来のＬ−カルニチンの製法としては種々の方
法が知られているが、Ｌ体をつくるには生化学的
方法がすぐれているため、最近いくつかのＬ−カ
ルニチン製造法が研究されている。しかし、工業
的には、それぞれ問題点をもつており、充分なも
のとはいゝ難い。本発明に関係の深い方法につい
て記すと、DL−カルニチンを生化学的に光学分
割する方法としてコリンエステラーゼを用いる方
法が発表されている（Biotechnology and
Bioenineering 26巻、911頁、1984年）。その方法
は、DL−カルニチンをアセチル化したものにデ
ンキウナギのアセチルコリンエステラーゼまたは
ウマ血清のブチリルコリンエステラーゼを作用せ
しめてＤ体またはＬ体のみを加水分解してＬ−カ
ルニチンをえるものである。しかし、この方法で
用いられる酵素はその起源のために極めて高価な
もので、その供給を限られるので工業的には不満
足なものといわざるをえない。発明が解決しようとする問題と問題を解決する為
の手段本発明者らは上記したように従来のＬ−カルニ
チン製造法が工業的製法として難点があるため、
より効率的なＬ−カルニチンの製法を確立すべく
研究を重ねた。特にコリンエステラーゼを用いる
DL−カルニチンの光学分割の難点が酵素の給源、
価格にあることに注目し、安価な給源として微生
物をしらべた。その結果、従来全く知られていな
かつた知見として、多くの微生物がＯ−アシルカ
ルニチンからカルニチンを生成する能力をもつこ
とを見いだして本発明を完成するに至つた。発明の効果、作用本発明によれば、容易に合成しうるＯ−アシル
カルニチンに微生物もしくはその酵素系を作用さ
せることによりＬ−カルニチンをえることができ
る。本発明に使用する微生物は、シユードモナス
（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillus）属、
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、フ
ラボバクテリウム（Flavobacterium）属、アス
ペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム
（Penicillum）属、ブレラ（Bullera）属、ロドト
ルラ（Rhodotorula）属、ストレプトミセス
（Streptomyces）属またはノカルデイア
（Nocardia）属に属し、Ｏ−アシルカルニチンか
らＬ−カルニチンを生成する能力のある微生物で
あれば微生物の分類上の位置に無関係に使用でき
る。このような能力を有する微生物もしくはその処
理物をＯ−アシルカルニチンに接触反応せしめる
とＬ−カルニチンが生成する。本発明に使用する
微生物菌体をえるための培養法は、通常の培養法
によればよく、特に説明を要しないが、基質とし
て用いるＯ−アシルカルニチンを含有せしめた培
地に微生物を生育させると転換活性の高い菌体を
えることができる。固形培地、液体培地の何れも
が使用できる。このようにしてえた菌体を基質に
作用させてもよく、また菌体抽出液、精製酵素標
品、これらの固定化標品を作用させてもよい。ま
た微生物菌体を培養液から分けることなく、生育
培養の培養液に基質を加えて反応させてもよい。
基質濃度は、バツチ式、連続式の何れによるかに
よつても異るが、バツチ式では一般に媒質中0.1
〜30％好ましくは0.5〜10％程度で、連続式では
これよりやゝ濃度を低下させた方がよい。反応は
普通15〜60℃、好ましくは25〜40℃附近、PH４〜
10附近で行われる。反応時間は静置、撹拌、流下
等の手段あるいは酵素標品の形態、力価によつて
異つてくるので一様ではないが、バツチ法では通
常30分〜72時間程度である。反応が進行すると反応液中にカルニチンが生成
してくる。反応の進行は、例えばアセトニトリ
ル：38％アンモニヤ水：水（40：10：10）の溶媒
系で、セルロース・プレートを用い薄層クロマト
グラフイーを行い、アンモニヤ性硝酸銀液の噴霧
でR_f 0.57のスポツトの濃度の減少とR_f0.42のス
ポツトの濃度の増大により追跡できる。またＬ−
カルニチンの定量は、ペアソンらの方法
（Method of Enzymatic Analysis 第２版、第
４巻、1758〜1771頁、1974年）により行う。反応
終了後、反応液をイオン交換樹脂のカラムにか
け、溶出、濃縮するなどの公知の方法でＬ−カル
ニチンは回収される。次に本発明の実施例を示す。実施例１グルコース１％、塩化アンモニウム0.1％、肉
エキス0.5％、ポリペプトン0.5％、燐酸二カリ0.7
％、燐酸一カリ0.3％、硫酸マグネシウム（７水
塩）0.01％、塩化ナトリウム0.5％、硫酸第一鉄
（７水塩）0.001％、アセチルカルニチン１％の滅
菌培地（PH7.0）を５mlふくむ太型試験管に第１
表に示した細菌を植菌して、26℃で96時間振とう
培養した。培養液５mlから遠心分離によりえた菌
体を洗浄後アセチル−DL−カルニチンクロライ
ドを10mg／mlの濃度にふくむPH7.0の燐酸緩衝液
0.5mlを加えて30℃で18時間振とう培養で反応さ
せた結果第１表に示した転換率でＬ−カルニチン
が生成していた。

【表】実施例２グルコース１％、塩化アンモニウム0.1％、燐
酸一カリ0.8％、燐酸二カリ0.2％、硫際マグネシ
ウム（７水塩）0.01％、硫酸第一鉄（７水塩）
0.001％、塩化ナトリウム0.5％、肉エキス0.5％、
ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.3％、アセチル
カルニチン１％の培地（PH6.0）５mlをふくむ太
型試験管に第２表に示したかびまたは酵母を植菌
し、酵母では４日間、かびでは７日間26℃で振と
う培養後、集菌洗浄した菌体を用いる他は実施例
１と同様に実施した場合、第２表に示した転換率
（対アセチルカルニチン、モル％）でＬ−カルニ
チンが生成していた。

【表】実施例３グルコース１％、塩化アンモニウム0.1％、燐
酸二カリ7.5％、燐酸一カリ0.25％、硫酸マグネ
シウム（７水塩）0.01％、硫酸第一鉄（７水塩）
0.001％、塩化ナトリウム0.5％、肉エキス0.5％、
ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.3％、アセチル
カルニチン１％の組成の培地（PH7.2）をふくむ
太型試験管に第３表に示した放線菌を植菌後26℃
で10日間振とう培養した。この培養液から集菌、
洗浄した菌体を用いる他は実施例１と同様に実施
した場合、第３表に示した転換率（対アセチルカ
ルニチン転換率モル％）でＬ−カルニチンが生成
した。

【表】

【表】実施例４実施例１の培地で、アセチルカルニチンの代り
にブチリルカルニチンを用いた培地20mlをふくむ
300ml三角フラスコにバチルス・ズブチリス
ATCC 9466を植菌して26℃で48時間振とう培養
後遠心分離により菌体を集め、これにブチリルカ
ルニチンクロリド１％をふくむ燐酸緩衝液（PH
7.0）10mlを加えて30℃で20時間振とう反応させ
たところ反応液中にＬ−カルニチンが1.6mg／ml
の濃度に生成した。実施例５実施例２の培地で、アセチルカルニチンの代り
にブチリルカルニチンを用いる他は実施例２と同
様に実施した場合、第４表に示した転換率（対ブ
チリルカルニチン転換率モル％）でＬ−カルニチ
ンが生成した。

【表】実施例６実施例１の培地で、アセチルカルニチンの代り
にブチリルカルニチンを用い、菌株としてシユー
ドモナス・エルギノーザIFO 3924を用いる他は
実施例１と同様に実施したとき、Ｌ−カルニチン
が7.2％（モル％）の転換率で生成した。実施例７実施例３の培地で、アセチルカルニチンの代り
にブチリルカルニチンを用い、菌株としてストレ
プトミセス・ロゼオフラブスATCC 19920を用い
る他は実施例３と同様に実施した場合、Ｌ−カル
ニチンが13.7％（モル％）の転換率で生成した。
この反応でえられた反応液から菌を除いた上澄液
400mlをイオン交換樹脂（ダウエツクス50）のカ
ラムに通し、稀塩酸で溶出し、Ｌ−カルニチンの
溶出分画を濃縮後、エチルアルコールを添加し
て、Ｌ−カルニチン・クロライドの粗結晶240mg
をえた。実施例８実施例１の培地30mlをふくむ300mlの三角フラ
スコにてバチルス・ズブチリスATCC 9466を26
℃で24時間振とう培養した後、遠心分離により集
菌して、菌体を50ｍＭ燐酸緩衝液（PH7.0）で洗
浄後、１％アセチルカルニチンをふくむPH7.0の
燐酸緩衝液１mlに懸濁して26℃で24時間振とう培
養したとき、反応液中にはＬ−カルニチンが塩酸
塩として4.3mg／mlの濃度に生成していた。

Claims

【特許請求の範囲】

１シユードモナス属、バチルス属、ブレビバク
テリウム属、フラボバクテリウム属、アスペルギ
ルス属、ペニシリウム属、ブレラ属、ロドトルラ
属、ストレプトミセス属またはノカルデイア属に
属し、かつＯ−アシルカルニチンを加水分解して
Ｌ−カルニチンを生成する活性を有する微生物
を、水性媒体中でＯ−アシルカルニチンに作用さ
せ、Ｌ−カルニチンを生成させることを特徴とす
るカルニチンの製造法。