JP2000354485A - リパーゼの製造方法 - Google Patents
リパーゼの製造方法Info
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- JP2000354485A JP2000354485A JP11169589A JP16958999A JP2000354485A JP 2000354485 A JP2000354485 A JP 2000354485A JP 11169589 A JP11169589 A JP 11169589A JP 16958999 A JP16958999 A JP 16958999A JP 2000354485 A JP2000354485 A JP 2000354485A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Burkholderia属微生物のリパーゼを効率的に
しかも工業的にも有利に製造し得る方法を提供する。 【解決手段】 オレイルアルコールの存在下にBurkhold
eria属微生物を培養することを特徴とするリパーゼの製
造方法。
しかも工業的にも有利に製造し得る方法を提供する。 【解決手段】 オレイルアルコールの存在下にBurkhold
eria属微生物を培養することを特徴とするリパーゼの製
造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リパーゼの製造法
に関する。
に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】リパー
ゼは、脂質を加水分解する酵素として油脂加工、臨床診
断薬、洗剤、消化酵素などに使用されている他、医薬や
農薬の製造中間体などの製造におけるエステル加水分
解、エステル合成、エステル交換等の反応において、反
応を触媒する酵素として用いられてきている。特にBurk
holderia属微生物の産生するリパーゼは、光学活性化合
物の製造に有用な酵素として注目されており、種々の基
質への検討が行われている（J. Org.Chem., 57, 6003,
1992.、Tetrahedron Lett., 36, 1063, 1995、特開平６
−１８１７７７等）。
ゼは、脂質を加水分解する酵素として油脂加工、臨床診
断薬、洗剤、消化酵素などに使用されている他、医薬や
農薬の製造中間体などの製造におけるエステル加水分
解、エステル合成、エステル交換等の反応において、反
応を触媒する酵素として用いられてきている。特にBurk
holderia属微生物の産生するリパーゼは、光学活性化合
物の製造に有用な酵素として注目されており、種々の基
質への検討が行われている（J. Org.Chem., 57, 6003,
1992.、Tetrahedron Lett., 36, 1063, 1995、特開平６
−１８１７７７等）。
【０００３】Burkholderia属微生物の培養によるリパー
ゼの産生において、ダイズ油等の油脂を添加することに
よりリパーゼの生産効率が向上する、すなわちリパーゼ
の生産が誘導されることは知られている。しかしなが
ら、油脂を添加する方法では、培養液中に油脂に由来す
る不溶物が生成し、リパーゼの回収において工業的方法
として一般に用いられる限外濾過膜法や吸着流動型カラ
ム法を培養液からの回収に適用すると目詰まりが発生す
るので、培養液そのものに該回収方法を適用することが
困難であり、油脂除去のための前処理等煩雑な工程が必
要となる。
ゼの産生において、ダイズ油等の油脂を添加することに
よりリパーゼの生産効率が向上する、すなわちリパーゼ
の生産が誘導されることは知られている。しかしなが
ら、油脂を添加する方法では、培養液中に油脂に由来す
る不溶物が生成し、リパーゼの回収において工業的方法
として一般に用いられる限外濾過膜法や吸着流動型カラ
ム法を培養液からの回収に適用すると目詰まりが発生す
るので、培養液そのものに該回収方法を適用することが
困難であり、油脂除去のための前処理等煩雑な工程が必
要となる。
【０００４】また、微生物の培養におけるリパーゼ生産
の誘導のための化合物についても各種検討されている
が、微生物種と添加する化合物種の組み合わせによって
その効果がまったく異なり、微生物種によりそれぞれに
適した化合物を探索せねばならないというのが現状であ
り、Burkholderia属に由来するリパーゼを効率的にかつ
工業的にも有利に製造する方法が強く望まれていた。
の誘導のための化合物についても各種検討されている
が、微生物種と添加する化合物種の組み合わせによって
その効果がまったく異なり、微生物種によりそれぞれに
適した化合物を探索せねばならないというのが現状であ
り、Burkholderia属に由来するリパーゼを効率的にかつ
工業的にも有利に製造する方法が強く望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、Burkholder
ia属に由来するリパーゼの製造につき鋭意検討を行った
結果、Burkholderia属微生物をオレイルアルコールの存
在下に培養することにより該リパーゼを効率よくかつ工
業的にも有利に製造することができることを見出し、本
発明に至った。すなわち本発明は、オレイルアルコール
の存在下にBurkholderia属微生物を培養することを特徴
とするリパーゼの製造方法を提供するものである。
ia属に由来するリパーゼの製造につき鋭意検討を行った
結果、Burkholderia属微生物をオレイルアルコールの存
在下に培養することにより該リパーゼを効率よくかつ工
業的にも有利に製造することができることを見出し、本
発明に至った。すなわち本発明は、オレイルアルコール
の存在下にBurkholderia属微生物を培養することを特徴
とするリパーゼの製造方法を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】Burkholderia属微生物とは、Yabu
uchiら（Microbiol. Immunol.、vol.36、p.1251、199
2）により提唱され、1993年に属として認定された（Int
ernational Journal of Systematic Bacteriology、vo
l.43、p.398、1993）微生物である。本発明において、
好ましくはBurkholderia cepaciaが使用され、なかでも
Burkholderia cepacia SC-20（工業技術院生命工学技術
研究所に、（受託番号）ＦＥＲＭＰ−１７４０６として
寄託されている（受理日：平成11年５月３１日））がさ
らに好ましく使用される。
uchiら（Microbiol. Immunol.、vol.36、p.1251、199
2）により提唱され、1993年に属として認定された（Int
ernational Journal of Systematic Bacteriology、vo
l.43、p.398、1993）微生物である。本発明において、
好ましくはBurkholderia cepaciaが使用され、なかでも
Burkholderia cepacia SC-20（工業技術院生命工学技術
研究所に、（受託番号）ＦＥＲＭＰ−１７４０６として
寄託されている（受理日：平成11年５月３１日））がさ
らに好ましく使用される。
【０００７】本発明においてオレイルアルコールは、Bu
rkholderia属微生物を培養するための培地へ培養前に予
め混合しておいて使用することができ、また、Burkhold
eria属微生物の培養液中に混合して使用することもでき
る。培養液中のオレイルアルコールの量は重量比で、通
常は0.1〜5%であり、好ましくは0.5%〜2%である。培養
液への添加の方法としては、例えば回分培養や流加培養
において培養初期あるいは培養途中で一括添加する方法
や、流加培養や連続培養において連続的または間欠的に
添加する方法等を挙げることができる。
rkholderia属微生物を培養するための培地へ培養前に予
め混合しておいて使用することができ、また、Burkhold
eria属微生物の培養液中に混合して使用することもでき
る。培養液中のオレイルアルコールの量は重量比で、通
常は0.1〜5%であり、好ましくは0.5%〜2%である。培養
液への添加の方法としては、例えば回分培養や流加培養
において培養初期あるいは培養途中で一括添加する方法
や、流加培養や連続培養において連続的または間欠的に
添加する方法等を挙げることができる。
【０００８】Burkholderia属微生物を培養する為の培地
としては、該微生物を培養するために通常使用され得る
培地であればよい。一般には、該微生物における通常の
培養に使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を
適宜含む各種の培地を用いることができる。炭素源とし
ては、グルコース、デキストリン、シュークロース等の
糖類、グリセロール等の糖アルコール、糖蜜等が挙げら
れる。これら炭素源の培地への添加量は培養液に対し通
常、０．１〜２０％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。窒素
源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エ
キス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Ste
ep Liquor ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸糖の天然
有機窒素源やアミノ酸類、硝酸ナトリウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無
機酸のアンモニウム塩や硝酸塩、フマル酸アンモニム、
クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、尿
素などの有機または無機窒素源等が挙げられる。これら
のうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミ
ノ酸類等は、多くの場合、炭素源としても使用すること
ができる。窒素源の添加量は培養液に対し通常、０．１
〜３０％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。有機塩や無機塩
としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、
マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸
塩、炭酸塩類およびリン酸塩類を挙げることができ、具
体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネ
シウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫
酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭
酸ナトリウム、リン酸水素一カリウム、リン酸水素二カ
リウム等を挙げることができ、その添加量は培養液に対
し通常、０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度とするとよ
い。
としては、該微生物を培養するために通常使用され得る
培地であればよい。一般には、該微生物における通常の
培養に使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を
適宜含む各種の培地を用いることができる。炭素源とし
ては、グルコース、デキストリン、シュークロース等の
糖類、グリセロール等の糖アルコール、糖蜜等が挙げら
れる。これら炭素源の培地への添加量は培養液に対し通
常、０．１〜２０％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。窒素
源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エ
キス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Ste
ep Liquor ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸糖の天然
有機窒素源やアミノ酸類、硝酸ナトリウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無
機酸のアンモニウム塩や硝酸塩、フマル酸アンモニム、
クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、尿
素などの有機または無機窒素源等が挙げられる。これら
のうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミ
ノ酸類等は、多くの場合、炭素源としても使用すること
ができる。窒素源の添加量は培養液に対し通常、０．１
〜３０％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。有機塩や無機塩
としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、
マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸
塩、炭酸塩類およびリン酸塩類を挙げることができ、具
体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネ
シウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫
酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭
酸ナトリウム、リン酸水素一カリウム、リン酸水素二カ
リウム等を挙げることができ、その添加量は培養液に対
し通常、０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度とするとよ
い。
【０００９】培養は、一般微生物における通常の方法に
準じて行うことができ、例えば試験管振盪式培養、往復
式振盪培養、ジャーファーメンター(Jar Fermenter)培
養、タンク培養等の液体培養、固体培養等の方法が可能
である。ジャーファーメンターを用いる場合は、ジャー
ファーメンター内に無菌空気を導入する必要があり、通
常、培養液容量の約０．１〜約２倍／分の通気条件を用
いる。培養温度は、微生物が生育可能な範囲で適宜変更
できるが、通常、約１５℃〜約４０℃の範囲の培養温度
が好ましく、培地のｐＨとしては、約６〜約８の範囲が
好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが、通
常約1〜約5日間が望ましい。
準じて行うことができ、例えば試験管振盪式培養、往復
式振盪培養、ジャーファーメンター(Jar Fermenter)培
養、タンク培養等の液体培養、固体培養等の方法が可能
である。ジャーファーメンターを用いる場合は、ジャー
ファーメンター内に無菌空気を導入する必要があり、通
常、培養液容量の約０．１〜約２倍／分の通気条件を用
いる。培養温度は、微生物が生育可能な範囲で適宜変更
できるが、通常、約１５℃〜約４０℃の範囲の培養温度
が好ましく、培地のｐＨとしては、約６〜約８の範囲が
好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが、通
常約1〜約5日間が望ましい。
【００１０】このようにしてBurkholderia属微生物の培
養により得られるリパーゼを回収する方法としては、通
常一般の酵素の回収において使用される方法を適用する
ことができ、例えば次のような方法を挙げることができ
る。まず、微生物の培養物から限外ろ過、遠心分離等に
より培養上清を集めた後、これに、例えばエタノールや
アセトン等の有機溶媒を添加してリパーゼを沈殿させ、
該沈殿物を限外ろ過あるいは遠心分離等によって回収す
ることができる。使用する前記有機溶媒の量としては培
養液量の例えば約０．３〜約１０倍容、好ましくは約１
〜約５倍容である。また、培養上清を例えば陽イオン交
換樹脂、陰イオン交換樹脂等の一般の酵素が吸着する樹
脂と混ぜ合わせることによりリパーゼを吸着させた後、
公知の方法に準じて溶出させて回収することも可能であ
る。
養により得られるリパーゼを回収する方法としては、通
常一般の酵素の回収において使用される方法を適用する
ことができ、例えば次のような方法を挙げることができ
る。まず、微生物の培養物から限外ろ過、遠心分離等に
より培養上清を集めた後、これに、例えばエタノールや
アセトン等の有機溶媒を添加してリパーゼを沈殿させ、
該沈殿物を限外ろ過あるいは遠心分離等によって回収す
ることができる。使用する前記有機溶媒の量としては培
養液量の例えば約０．３〜約１０倍容、好ましくは約１
〜約５倍容である。また、培養上清を例えば陽イオン交
換樹脂、陰イオン交換樹脂等の一般の酵素が吸着する樹
脂と混ぜ合わせることによりリパーゼを吸着させた後、
公知の方法に準じて溶出させて回収することも可能であ
る。
【００１１】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらによって限定されるものでは
ない。なお例中、%は、特に断りのない限りw/v％を表わ
す。 実施例1 １％のオレイルアルコールを含む100mlのPY培地（酵母
エキス 1%、ファイトン（ディフコ） 1%、りん酸２水素
１カリウム 0.2%、硫酸マグネシウム・7水和物0.02%、
硫酸第一鉄・7水和物 0.001%、pH7.0）を500ml容の三角
フラスコに分注し、121℃で15分滅菌した。この培地
に、Nutrient Broth培地（ディフコ）中で30℃、48時間
振とう培養したBurkholderia cepacia SC-20（（受託番
号）ＦＥＲＭ Ｐ−１７４０６）の培養液1mlを植菌
し、30℃、48時間振とう培養を行った。培養後、培養液
を、15000rpm、5分遠心したところ、得られた上清液
は、清澄であった。該上清液を回収し、リパーゼの活性
測定を以下の方法で行った。15mlのトリブチリン、50ml
のエマルジョン液（塩化ナトリウム 17.9g、りん酸２水
素１カリウム 0.41g、グリセロール 540ml、アラビアゴ
ム 6g に水を加えて、1Lに調製した液）に水235mlを加
えよく混合した後、該混合液に培養上清液の20倍水希釈
液を100μl添加し、30℃、pH 7.0の条件下で、pHスタッ
ト法により遊離する酪酸の量を測定した。リパーゼの活
性単位として、1U（ユニット）は、1分間に１マイクロ
モルの酪酸を遊離する酵素の量である。結果を表１に示
す。
明するが、本発明はこれらによって限定されるものでは
ない。なお例中、%は、特に断りのない限りw/v％を表わ
す。 実施例1 １％のオレイルアルコールを含む100mlのPY培地（酵母
エキス 1%、ファイトン（ディフコ） 1%、りん酸２水素
１カリウム 0.2%、硫酸マグネシウム・7水和物0.02%、
硫酸第一鉄・7水和物 0.001%、pH7.0）を500ml容の三角
フラスコに分注し、121℃で15分滅菌した。この培地
に、Nutrient Broth培地（ディフコ）中で30℃、48時間
振とう培養したBurkholderia cepacia SC-20（（受託番
号）ＦＥＲＭ Ｐ−１７４０６）の培養液1mlを植菌
し、30℃、48時間振とう培養を行った。培養後、培養液
を、15000rpm、5分遠心したところ、得られた上清液
は、清澄であった。該上清液を回収し、リパーゼの活性
測定を以下の方法で行った。15mlのトリブチリン、50ml
のエマルジョン液（塩化ナトリウム 17.9g、りん酸２水
素１カリウム 0.41g、グリセロール 540ml、アラビアゴ
ム 6g に水を加えて、1Lに調製した液）に水235mlを加
えよく混合した後、該混合液に培養上清液の20倍水希釈
液を100μl添加し、30℃、pH 7.0の条件下で、pHスタッ
ト法により遊離する酪酸の量を測定した。リパーゼの活
性単位として、1U（ユニット）は、1分間に１マイクロ
モルの酪酸を遊離する酵素の量である。結果を表１に示
す。
【００１２】比較例１ オレイルアルコールに代えて、ダイズ油を用いる以外は
実施例１と同様にしてBurkholderia cepacia SC-20
（（受託番号）ＦＥＲＭ Ｐ−１７４０６）の培養及び
遠心分離を行い、培養液の遠心分離上清液を得た。得ら
れた上清液は白濁していた。該上清液のリパーゼ活性を
実施例１と同様にして測定した。結果を表１に示す。
実施例１と同様にしてBurkholderia cepacia SC-20
（（受託番号）ＦＥＲＭ Ｐ−１７４０６）の培養及び
遠心分離を行い、培養液の遠心分離上清液を得た。得ら
れた上清液は白濁していた。該上清液のリパーゼ活性を
実施例１と同様にして測定した。結果を表１に示す。
【００１３】比較例２〜３ オレイルアルコールに代えて、ステアリルアルコールま
たはパルミチルアルコールを用いる以外は実施例１と同
様にしてBurkholderia cepacia SC-20（（受託番号）Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１７４０６）の培養、遠心分離及び得られ
る上清液のリパーゼ活性を測定した。結果を表１に示
す。
たはパルミチルアルコールを用いる以外は実施例１と同
様にしてBurkholderia cepacia SC-20（（受託番号）Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１７４０６）の培養、遠心分離及び得られ
る上清液のリパーゼ活性を測定した。結果を表１に示
す。
【００１４】比較例４ オレイルアルコールを用いない以外は実施例１と同様に
してBurkholderia cepacia SC-20（（受託番号）ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１７４０６）の培養、培養液の遠心分離及び得
られる上清液のリパーゼ活性を測定した。結果を表１に
示す。
してBurkholderia cepacia SC-20（（受託番号）ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１７４０６）の培養、培養液の遠心分離及び得
られる上清液のリパーゼ活性を測定した。結果を表１に
示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】実施例２〜３ 100mlPY培地中のオレイルアルコールの濃度を0.5%また
は2%とする以外は実施例１と同様にしてBurkholderia c
epacia SC-20（（受託番号）ＦＥＲＭ Ｐ−１７４０
６）の培養、培養液の遠心分離及び得られる上清液のリ
パーゼ活性を測定した。なお、いずれの場合も、培養液
の遠心分離により得られる上清液は清澄であった。実施
例１の結果と併せて表２に示す。
は2%とする以外は実施例１と同様にしてBurkholderia c
epacia SC-20（（受託番号）ＦＥＲＭ Ｐ−１７４０
６）の培養、培養液の遠心分離及び得られる上清液のリ
パーゼ活性を測定した。なお、いずれの場合も、培養液
の遠心分離により得られる上清液は清澄であった。実施
例１の結果と併せて表２に示す。
【００１７】
【表２】
【００１８】
【発明の効果】本発明によれば、Burkholderia属微生物
のリパーゼを効率的にしかも工業的にも有利に製造する
ことができる。
のリパーゼを効率的にしかも工業的にも有利に製造する
ことができる。
Claims (3)
- 【請求項１】オレイルアルコールの存在下にBurkholder
ia属微生物を培養することを特徴とするリパーゼの製造
方法。 - 【請求項２】Burkholderia属微生物が、Burkholderia c
epaciaである請求項1に記載の方法。 - 【請求項３】Burkholderia属微生物が、Burkholderia c
epacia SC-20株である請求項２に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11169589A JP2000354485A (ja) | 1999-06-16 | 1999-06-16 | リパーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11169589A JP2000354485A (ja) | 1999-06-16 | 1999-06-16 | リパーゼの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000354485A true JP2000354485A (ja) | 2000-12-26 |
Family
ID=15889298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11169589A Pending JP2000354485A (ja) | 1999-06-16 | 1999-06-16 | リパーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000354485A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040012305A (ko) * | 2002-08-02 | 2004-02-11 | 김영권 | 리파아제를 생산능을 가지는 신규한 불콜데리아멀티보란스 ｄｈ4와 이를 이용한 리파아제 생산방법 |
-
1999
- 1999-06-16 JP JP11169589A patent/JP2000354485A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040012305A (ko) * | 2002-08-02 | 2004-02-11 | 김영권 | 리파아제를 생산능을 가지는 신규한 불콜데리아멀티보란스 ｄｈ4와 이를 이용한 리파아제 생산방법 |
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