JPH01281083A - ノイラミニダーゼ・アイソザイムｌ及びガングリオシド類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規なノイラミニダーゼ・アイソザイム及び
それを用いるガングリオシド類の製造法に関する。

従来技術とその課題 ガングリオシドは、シアル酸を含有するスフィンゴ糖脂
質群の総称であり、高等動物の脳特に神経系に存在する
ことが知られている。ガングリオシド類は、生体内にお
いて、神経機能や細胞の相互識別、分化、増殖、ガン化
、老化等に関与し、また細胞社会学的視点から、コレラ
トキシン、ボツリヌス毒素等の細胞毒素、甲状腺ホルモ
ン等のペプチドホルモン、インターフェロン等の受容体
機能にあずかり、更に細胞表面の陰性電荷に寄与してい
るものと考えられる。実際、ウシの脳から抽出されたガ
ングリオシド類が、障害を受けた末梢神経の再生に促進
的に働き、特に、アルコール症の多発性神経炎や糖尿病
性ニューロバチ−の治療薬として有用であることが報告
されている〔「医薬と薬学」、第１３巻、６号、１４０
７〜１４１２　（１９８５）、［プラクティスＪ、４（
４）、４５２〜４５６　（１９８７）、［医薬ジャーナ
ルＪ、２２　（７）、５５〜６２　（１９８６）：ｌ。

上述したように、ガングリオシド類は生体内において種
々の機能を有する重要な物質群であり、従って、各種の
ガングリオシドを純粋に取出す方法の確立が望まれてい
る。従来、特定のガングリオシドを製造するに当っては
、種々のクロマトグラフィーを使用する方法が試みられ
ているが、出発原料である牛脳等から抽出されたガング
リオシド成分が、多種類のガングリオシドを微量ずつ含
むガングリオシド類の混合物であるため、繁雑な操作を
行なっても目的物を得るのが非常に困難であり、的確な
精製方法は見出されていない。また、化学的手法によっ
てガングリオシド類を合成する試みも成されているが、
工程が複雑であり、副反応が起り易く、副生物の分離が
困難である。

一方、ノイラミニダーゼは、単独では、ガングリオシド
類には直接作用しないと考えられていた酵素であり、実
際、コール酸塩等の界面活性剤の存在下にガングリオシ
ドＧＭ１からアシアロガングリオシドＧＡｌを生成する
という報告がなされているのみである〔斎藤正樹：代謝
、１６．７６１（１９７７））。しかも、ノイラミニダ
ーゼにアイソザイムが存在することは全く知られていな
い。

課題を解決するための手段 本発明者は、上記従来技術の課題に鑑みて鋭意研究を重
ねた結果、ガングリオシド類から特定のガングリオシド
を生成し得る、新規なノイラミニダーゼ・アイソザイム
を見い出し、本発明を完成した。

即ち本発明は、 ■下記の理化学的性状を有するノイラミニダーゼ・アイ
ソザイムＬ 作用：ガングリオシド類の混合物から選択的にガングリ
オシドＧＭ１及び／又はアシアロＧＭ□を生成する 分子伍：約８８０００ダルトン（ゲル濾過クロマトグラ
フィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ 電気泳動法による） 至適ｐＨ：４．７〜５．５（牛脳ガングリオシド類を基
質とした場合） 熱安定性二６０°Ｃ以下、及び ■ガングリオシド類に、請求項（１）のノイラミニダー
ゼ・アイソザイムＬを作用させて、ガングリオシドＧＭ
１及び／又はアシアロＧＭｌを選択的に得ることを特徴
とするガングリオシド類の製造法に係る。

本発明は鋭意研究の結果、アースロバフタ−・ウレアフ
ァシェンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｕｒｅａｆａ
ｃｌｅｎＳ）属細菌起源のノイラミニダーゼには新規な
アイソザイムが存在し、該アイソザイムをガングリオシ
ド類に作用させる場合には、ガングリオシドＧ　及び／
又はアシアロＧＭ１が高純度で収率良くｌ 且つ選択的に得られることを見出した。また、本発明に
よれば、副生物が生成しないので、得られるガングリオ
シドＧＭ１及び／又はアシアロＧ！４１を容易に精製で
きる。また、本酵素を用いる場合には、従来使用されて
いた界面活性剤を使用する必要がない。

本発明ノイラミニダーゼ・アイソザイムＬ（以下単にア
イソザイムＬという）の活性測定は、ノイラミニダーゼ
の通常の活性測定方法と同様にして行なえばよい。例え
ば、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー
（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ　、　　Ｃｈｅｍ、２３４．１９７
１　（１９５９）Ｅ等に記載のチオバルビッール酸法に
従って行なえばよい。アイソザイムＬの１単位は、３７
℃で１分間に１マイクロモルのＮ−アセチルノイラミン
酸を生成する酵素量とする。

本発明アイソザイムＬの分子量測定に採用したゲル済過
クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、
以下のようにして行なった。

〔ゲル？濾過りロマトグラフィー〕

セファデックスＧ１５０　（ファルマシア社製）を用い
るゲル清適法によった。溶出液としては、５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６，８）を用いた。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法〕 Ｕ、に、　　Ｌａｅｍｍｌｉの方法［：Ｎａｔｕｒｅ　
、　　２２７゜６８０　（１９７０））に従い、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。

また本発明アイソザイムＬの安定ｐＨ域は４゜５〜９．
５であり、作用適温は４５〜５５℃である。

一方、アースロバフタ−・ウレアファシェンス属細菌起
源のノイラミニダーゼはＩ及びＨに分離されており、そ
の理化学的性質は下記第１表の通りであるとされていた
（Ｙ、　Ｕｃｈｆｄａ　ｅｔ　ａｔ　、　　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｃｍ、　、　８６．４２５　（１９７９）　
）。

第１表 上記したように、従来のノイラミニダーゼと本発明アイ
ソザイムしは理化学的性質を異にしている。従って、本
発明アイソザイムしは、従来より知られているアースロ
バフタ−・ウレアファシェンス属細菌起源のノイラミニ
ダーゼとは異なった分子種の酵素であることが判る。

本発明アイソザイムしは、アースロバフタ−・ウレアフ
ァシェンス属細菌を培養し、得られる培養物から採取で
きる。

アースロバフタ−・ウレアファシェンス属細菌としては
公知のものを用いることができ、その具体例としては、
例えば、アースロバフタ−・ウレアファシェンスＭ１０
５７株（微工研条寄第１３９１号）等を挙げることがで
きる。

アースロバフタ−・ウレアファシェンス属細菌の培養は
、通常の液体培地及び固体培地のいずれを用いても実施
できるが、通常液体培地を用いるのが有利である。また
所望酵素を生産するためには、振盪培養や通気攪拌培養
等を行なうのが好ましい。培地としては特に制限がなく
、微生物の培養に用いられる通常の栄養源等を含有する
各種の培地を使用できる。栄養源としては、例えば、ブ
ドウ糖、果糖、乳糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビトー
ル、グリセロール等の糖質類、ピルビン酸、リンゴ酸、
コハク酸等の有機酸類等の炭素源、ペプチド類、肉エキ
ス、酵母エキス、カザミノ酸、尿素、アンモニウム塩、
硝酸塩等の窒素源、リン、マグネシウム、カリウム、ナ
トリウム等の無機塩類、硼素、銅、沃素、鉄、マンガン
、亜鉛、コバルト、モリブデン等の微量元素類、ビタミ
ン類等の微量成育因子等を例示できる。更に、例えば動
物組織抽出物又は浸出物等を含有する天然乃至半合成培
地等も使用できる。該培地の具体例としては、例えば１
、トッド・ヘライツト肉汁（ＴｏｄｄＨｃｗｉｔｔ　Ｂ
ｒｏｔｈ）やプレイン・ハート・インフュージョン（Ｂ
　ｒａｉｎ　　Ｈｅａｒｔ　　Ｉ　ｎｆｕｓｉｏｎ　）
培地等の名称で市販されているもの等を例示できる。

培俺条件としては、培養温度２０〜４０℃程度、好まし
くは２５〜３０℃程度、培養時間は１０〜７０時間程度
とすればよい。

かくして得られるアースロバフタ−やウレアファシェン
ス属細菌の培養液から、公知の方法に従って本発明アイ
ソザイムＬを採取することができる。例えば、培養液か
ら菌体を分離除去し、得られる清澄液に、硫安分画、ア
フィニティクロマトグラフィー、必要に応じイオン交換
クロマトグラフィー、クロマトフオーカシング、ゲル濾
過等の精製操作を施せばよい。

かくして得られる本発明アイソザイムＬをガングリオシ
ド類に作用させることにより、ガングリオシドＧ　及び
／又はアシアロＧＭ１を選択的に得Ｍす ることができる。上記酵素反応は、ガングリオシド類（
基質）及び緩衝液、更に必要に応じて殺菌水を含む基質
液に、アイソザイムＬを添加することにより行なわれる
。

上記酵素反応において、主にガングリオシドＧ肘を得よ
うとする場合、その反応条件は以下の通りである。ガン
グリオシド類としては特に制限されず公知のものが使用
でき、その具体例としては、例えば、ガングリオシドＧ
　　　、Ｇ　　　、Ｇ　　　。

Ｄｌａ　　　Ｄｌｂ　　　Ｔｌａ Ｇ　　及びＧＱｌｂから選ばれた少くとも１種、牛ｌｂ 脳抽出ガングリオシド混合物等を例示できる。ガングリ
オシド類の使用量は特に制限されないが、通常基質液１
−あたり飽和濃度（通常２０ＩＩ１ｇ以下）、好ましく
は０．１〜３ｍｇ程度とすればよい。アイソザイムＬの
使用量も特に制限されないが、通常基質液１醇当り１ｍ
Ｕ以上、好ましくは１０．〜５００ｍＵ程度とすればよ
い。緩衝液としてはｐＨが４〜８程度の公知のものが使
用でき、例えば、１０〜２００ｍＭ程度の酢酸緩衝液（
ｐＨ４，５〜５．　５）　、Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液
（ｐＨ３，５〜５゜５）等を例示できる。反応温度は酵
素が作用し得る温度であれば特に制限されないが、通常
３０〜４０℃程度とすればよい。反応時間は基質濃度、
反応温度等により適宜選択すればよいが、例えば３７℃
の時には３０分〜１２時間程度とすればよい。

また、上記酵素反応において、主にアシアロＧ８、を得
ようとする場合には、その反応条件は以下の通りである
。ガングリオシド類としては特に制限されず公知のもの
が使用でき、その具体例としては、例えば、ガングリオ
シドＧ　　　Ｇ　　　、ＧＭ１ゝ　Ｄｌａ Ｄｌｂ　”　Ｔｌａ　”　Ｔｌｂ及びＧＱｌｂから選ば
れた少くとも１種、牛脳抽出ガングリオシド混合物等を
例示できる。ガングリオシド類の使用量は特に制限され
ないが、通常基質液１或あたり２０ｍｇ以下、好ましく
は０．０５〜ｌｆｆ１ｇ程度とすればよい。アイソザイ
ムＬの使用量も特に制限されないが、通常基質液１ｍＱ
当り３ｍＵ以上、好ましくは０．１Ｕ程度とすればよい
。緩衝液及び反応温度は上記と同様の条件でよい。反応
時間は基質濃度、反応温度等により適宜選択すればよい
が、例えば３７℃の時には３０分〜１２時間程度とすれ
ばよい。

上記酵素反応において、酵素伍、反応温度、反応時間等
を適宜選択することにより、ガングリオシドＧ　及びア
シアロＧ、工を夫々単独で若しくは混合物として得るこ
とができる。

反応液からガングリオシドＧＭ１及びアシアロＧ肘を精
製するに当っては公知の精製方法が採用できる。例えば
、ガングリオシドＧ１４１又アシアロＧ肘を単独で得た
場合には、溶媒抽出した後、凍結乾燥等により精製でき
る。また混合物として得た場合には、イオン交換樹脂カ
ラムなどを用いてガングリオシドＧ　とアシアロＧＭ１
とを分離し、次いで、濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行なう
ことにより精製できる。

発明の効果 本発明に従い、本発明アイソザイムＳをガングリオシド
類に作用させる時には、従来合成又は精製が困難である
とされていたガングリオシド類の中、ガングリオシドＧ
Ｍ１及び／又はアシアロＧＭｌを高純度で収率良く且つ
選択的に得ることができる。しかも副生物が生成しない
ので、得られるガングリオシドＧ　及び／又はアシアロ
Ｇ　を容易ＭＩ　　　　　　　　　　　Ｍｌ に精製できる。また、本酵素を用いる場合には、従来使
用されていた界面活性剤を使用する必要がない。

実施例 以下に参考例及び実施例を挙げ、本発明をより一層明瞭
なものとする。

参考例１ ラクトース５．Ｏｇ、リン酸第２アンモニウム２．０ｇ
、塩化ナトリウム３．０ｇ、リン酸第２カリウム１．０
ｇ、硫酸マグネシウム０．１ｇ及ヒ脱塩水１０００１１
１１２を含む培地（ｐＨを７．ｏｌ：調整）を、２Ｑ容
坂ロフラスコにいれ、オートクレーブで加熱滅菌した。

これに、アースロバクター〇ウレアファンェンスＭ　１
０５７株を接種し、２８℃で２４時間振盪培養を行ない
、得られた培養液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０
分）して培養上清を得た。

得られた培養上清に硫安を加え、硫安８０％飽和で沈澱
する部分を採取し、これを少量の水に溶かし、１０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）で透析した。透析液を、可溶
性デンブシとコロミン酸との２Ｎ水酸化ナトリウム溶液
にエピクロルヒドリンを加えて調製した、コロミン酸を
リガンドとするゲルを充填したカラムに通塔してノイラ
ミニダーゼを吸着させ、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４
゜５）で溶出した。

次いで、ノイラミニダーゼ活性区分を硫安塩析し、脱塩
水で透析し、透析液をクロマトフオーカシングにより３
戒分に分離した。クロマトフオーカシングは、透析液を
、２５ｍＭイミダゾール−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）で平
衡化したポリバアッファー交換体充填カラムに通塔し、
ｐＨ３，８に調整したポリブアッファ−７４〔ファルマ
シア社製〕で溶出して行なった。

得られた３戒分を個々に硫安塩析し、１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、Ｕｌｔｒ。

ｇｅｌ　ＡｃＡ４４　（１，Ｂ、　　Ｆ、バイオテクニ
クス社製〕を用いてゲル濾過し、４戒分を得た。その中
の１戒分から、アイソザイムＬの９８０単位を得た。

アイソザイムＬの酵素活性は、チオバルビッール酸法に
従い、以下のようにして行なった。

即ち、酵素液０．　１ｔＩｌｆ２．０．４％Ｎ−アセチ
ルノイラミンラクトース溶液０．０５−及び０．２Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ５，０）０．０５ｍ１２を、３７°Ｃで
１０分間反応させ、遊離したＮ−アセチルノイラミン酸
をチオバルビッール酸で定量した。アイソザイムＬの１
単位は、３７℃で１分間に１マイクロモルのＮ−アセチ
ルノイラミン酸を生成する酵素量とした。

実施例１ ０．５％ガングリオシドＧＤｌａ溶液１１１１Ｑ、４０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）１ｍＱ、アイソザイムＬ
溶液１１１１２（０，３Ｕ／１１１９）及び殺菌水１戒
を、３７℃で１時間反応させた後、反応液にクロロホル
ムを１／１０容添加し、酵素反応を停止した。

反応液より、クロロホルム：メタノール（２：１）を用
いて生成したガングリオシドＧＭ、を抽出した後、凍結
乾燥し、ガングリオシドＧＭ、３．　５ｍｇを白色粉末
として得た。

尚、ガングリオシドＧＭ１の生成は、薄層クロマトグラ
フィーにより検出及び確認した。

実施例２ ガングリオシド類として、牛脳抽出ガングリオシド混合
液１戒（ガングリオシド類１０ｍｇを含む）を使用する
以外は、実施例１と同様にしてガングリオシドＧＭ□約
６．８ｍｇを白色粉末として得た。

実施例３ ０．０５％ガングリオシドＧ１４１溶液１０脱、４０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）１０ｍｆ２、アイソザイム
Ｌ溶液１０ｍ　（３Ｕ／ｍＱ）及び殺菌水１０或を、３
７℃で３時間反応させた後、実施例１と同様にして精製
し、アシ７０６Ｍ１約２．６ｍｇを白色粉末として得た
。

実施例４ ガングリオシド類として、牛脳抽出ガングリオシド混合
液１０ｍ１（ガングリオシド類５ｍｇを含む）を使用す
る以外は、実施例３と同様にして反応を行なった。生成
したアシアロＧＭ１を実施例３と同様にして精製し、ア
シ７０６Ｍ１約３．１ｍｇを白色粉末として得た。

（以　上）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性状を有するノイラミニダーゼ・
   アイソザイムＬ 作用：ガングリオシド類から選択的にガングリオシドＧ
   ＿Ｍ＿１及び／又はアシアロＧ＿Ｍ＿１を生成する。 分子量：約８８０００ダルトン（ゲルろ過クロマトグラ
   フィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ 電気泳動法による） 至適ｐＨ：４．７〜５．５（牛脳ガングリオシド類を基
   質とした場合） 熱安定性：６０℃以下
2. （２）ガングリオシド類に、請求項（１）のノイラミニ
   ダーゼ・アイソザイムＬを作用させて、ガングリオシド
   Ｇ＿Ｍ＿１及び／又はアシアロＧ＿Ｍ＿１を選択的に得
   ることを特徴とするガングリオシド類の製造法。