WO1991006662A1 - Process for preparing asialo g¿m1? - Google Patents

Description

明 細 書

ァ シァ口 G_M1の製造法

技 術 分 野

本発明は、 ァシァ口 G_M1の製造法に関する。

従 来 技 術

ガングリオン ドは、 シアル酸を含有するスフイ ンゴ糖 脂質群の総称であり、 高等動物の脳特に神経系に存在す ることが知られている。 ガングリオシ ド類は、 生体内に おいて、 神経機能や細胞の相互識別、 分化、 增殖、 ガン 化、 老化等に関与し、 また細胞社会学的視点から、 コ レ ラ トキシン、 ボッリ ヌス毒素等の細胞毒素、 甲状腺ホル モン等のペプチ ドホルモン、 イ ンタ一フエロ ン等の受容 体機能にあずかり、 更に細胞表面の陰性電荷に寄与して いるものと考えられる。 実際、 ゥシの脳から抽出された ガングリオシ ド類が、 障害を受けた末梢神経の再生に促 進的に働き、 特に、 アルコール症の多発性神経炎や糖尿 病性ニューロパチ一の治療薬と して有用であることが報 告されている 〔 「医薬と薬学」 、 第 1 3巻、 6号、 1 4 0 7〜 1 4 1 2 ( 1 98 5 ) 、 「プラクティ ス」 、 (4 ) 、 4 5 2〜 4 5 6 ( 1 987 ) 、 「医薬ジャ一 ナル」 、 ( 7) 、 5 5〜 6 2 ( 1 986) 〕 。

上述したように、 ガングリォシ ド類は生体内において 種々の機能を有する重要な物質群であり、 従って、 各種 のガングリォシ ドを純粋に取出す方法の確立が望まれて いる。 従来、 特定のガングリオシ ドを製造するに当って は、 種々のクロマ トグラフィーを使用する方法が試みら れているが、 出発原料である牛脳等から抽出されたガン グリォシ ド成分が、 多種類のガングリォシ ドを微量ずつ 含むガングリォシ ド類の混合物であるため、 繁雑な操作 を行なっても目的物を得るのが非常に困難であり、 的確 な精製方法は見出されていない。 また、 化学的手法によ つてガンダリオシ ド類を合成する試みも成されているが、 工程が複雑であり、 副反応が起り易く 、 副生物の分離が 困難である。

一方、 ノイラ ミニダ一ゼは、 単独では、 ガングリォシ ド類には直接作用しないと考えられていた酵素であり、 実際、 コール酸塩等の界面活性剤の存在下にガングリオ シ ド G _{M 1}からァシァロガンダリオシ ド G _{A 1}を生成すると いう報告がなされているのみである 〔斎藤正樹 ： 代謝、

1 6 7 6 1 ( 1 9 7 7 ) 〕 。 しかも、 ノィラ ミニダ一 ゼにアイ ソザィムが存在することは全く知られていない。

発 明 の 開 示

本発明の目的は、 ガングリオシ ド類から、 特定のガン グリォシ ド即ちァシァロ G _{M 1}を得る方法を提供すること にある。

本発明の他の目的は、 ァシァ口 G_M1を高純度で収率良 く得る方法を提供することにある。

即ち本発明は、 ガングリオシ ド類にノイラ ミニダーゼ • ァイソザィム Lを作用させて、 ァシァ口 G_M1を得るこ とを特徴とするァシァ口 G_M1の製造法を提供する。

本発明者は鋭意研究の結果、 アースロバクタ一

( A rthrobacter ) 属細菌起源のノィラ ミニダ一ゼには 新規なアイソザィムが存在し、 該ノイラ ミニダ一ゼ · ァ ィソザィム Lをガンダリオシ ド類に作用させる場合には ァシァ口 G_M1が選択的に且つ高純度で収率良く得られる ことを見出した。 また本発明方法によれば、 副生物が生 成しないので、 得られるァシァ口 G_M1を容易に精製でき る。 さらに本酵素を用いてァシァ口 G_M1を製造する場合 には、 従来使用されていた界面活性剤を使用する必要が ないという利点もある。

本発明で使用するノイラ ミニダーゼ · アイソザィム L (以下単にアイソザィム Lという） は、 下記の理化学的 性質を有する。

(1) 作用 ： ガングリォシ ド類から選択的にァシァロ G_M1 を生成する

(2) 分子量 ： 約 88000ダルト ン 分子量は、 以下に示すゲル沪過クロマ トグラフィー及 び S D S— P A G E電気泳動によって行なった。

〔ゲル泸過ク ロマ ト グラフィー〕

セフアデッ クス G 1 50 (フアルマシァ社製） を用い るゲル泸過法によった。 溶出液としては、 50 mMリ ン 酸緩衝液 （p H 6. 8) を用いた。

[S D S - P A G E電気泳動法〕

U. K. Laeninliの方法 [Nature , 227 , 680 ( 1 97 0) 〕 に従い、 S D S—ポリアク リルア ミ ドゲ ル電気泳動を行なつた。

(3) 至適 p H : 4. 7〜 5. 5 (牛脳ガンダリオシ ド類 を基質とした場合）

(4) 安定 p H域 ·. 4. 5〜9. 5

(5) 作用適温 ： 4 5〜 5 5 °C

(6) 熱安定性 ： 60で以下

一方、 アースロノくクタ一 * ゥ レアフ ァ シエンス

( A rthrobacter ureaf aciens ) 源のノィラ ミ ニダ一 ゼは I及び Πに分離されており、 その理化学的性質は下 記第 1表の通りである 〔Y. Uchida et al , J .

B iochem. ， 86. 4 2 5 ( 1 97 9) 〕 。 I Π

分子量（ゲル 法） 5 1 0 0 0 3 9 0 0 0 至適 p H 5. 0〜 5. 5 5. 0〜 5. 5 安定 P H 6. 0〜 9. 0 6. 0〜 9 , 0 作用適温 5 3 V 5 3 °C

熱安定性 5 0て以下 5 0て以下 上記の記載から、 アイ ソザィム Lと従来のノィラ ミニ ダ一ゼは、 作用、 分子量、 至適 p H、 安定 p H、 作用適 温及び熱安定性といった理化学的性質を異にし、 異なつ た分子種の酵素であることが判る。

アイソザィム Lの活性測定は、 ノィラ ミニダ一ゼの場 合と同様に行なわれる。 例えば、 ジャーナル ォブ バ ィォロジカル ケ ミス ト リ一 〔 J . B iol . C hem . 2 34 , 1 9 7 1 ( 1 9 5 9 ) 3 等に記載のチォバルビ ツール酸法に従って行なえばよい。 アイ ソザィム Lの 1 単位は、 3 7 °Cで 1分間に 1マイクロモルの N—ァセチ ルノイラ ミ ン酸を生成する酵素量とする。

アイソザィム Lは、 アースロバクタ一属細菌を培養し 得られる培養物から採取できる。

アースロバクタ一属細菌と しては公知のものを用いる ことができ、 例えば、 アースロバクタ一 · ゥレアファ シ エンス M 1 0 5 7株 （微ェ研条寄第 1 3 9 1号） 等のァ ースロバクタ一 · ゥレアファ ンエンス等を挙げること力 できる。

アースロバクター属細菌の培養は、 通常の液体培地及 び固体培地のいずれを用いても実施できるが、 通常液体 培地を用いるのが有利である。 また所望の酵素を生産す るためには、 振盪培養や通気攪拌培養等を行なうのが好 ま しい。 培地と しては特に制限がなく 、 微生物の培養に 用いられる通常の栄養源等を含有する各種の培地を使用 できる。 栄養源としては、 例えば、 ブドウ糖、 果糖、 乳 糖、 転化糖、 澱粉糖化液、 コ口 ミ ン酸、 ソルビ トール、 グリセロール等の糖質類、 ピルビン酸、 リ ンゴ酸、 コハ ク酸等の有機酸類、 ペプチ ド類、 肉エキス、 酵母エキス、 カザミ ノ酸、 尿素、 アンモニゥム塩、 硝酸塩等の窒素源、 リ ン、 マグネシウム、 カ リ ウム、 ナ ト リ ウム等の無機塩 類、 硼素、 鋦、 沃素、 鉄、 マンガン、 亜鉛、 コバル ト、 モリ ブデン等の微量元素類、 ビタ ミ ン類等の微量成育因 子等を挙げることができる。 更に、 例えば動物組織抽出 物又は浸出物等を含有する天然乃至半合成培地等も使用 できる。 培地の具体例としては、 例えば、 ト ッ ド · へゥ ィ ッ ト肉汁 （ T odd H ewi tt B roth) やブレイ ン · ノヽ一 卜 ♦ イ ンフユ一ジ ョ ン ( B rai n H eart I nf usi on ) 培地等の名称で市販されているもの等を挙げることがで 3る。

培養は、 通常 20〜4 CTC程度、 好ま しく は 2 5〜 30 °C程度の温度下に行なわれ、 、 1 0〜 70時間程度 で終了する。

アースロバクター属細菌の培養液から、 公知の方法に 従ってアイソザィム Lを採取することができる。 例えば、 培養液から菌体を分離除去し、 得られる清澄液に、 硫安 分画、 ァフィ二ティ ク ロマ ト グラフィ ー、 必要に応じィ オン交換ク ロマ ト グラフ ィ ー、 ク ロマ トフ ォーカ シング、 ゲル沪過等の精製操作を施せばよい。

かく して得られるアイソザィム Lをガンダリオシ ド類 に作用させることにより、 ァシァ口 G_M1を選択的に得る ことができる。 該酵素反応は、 ガンダリオシ ド類及び緩 街液、 更に必要に応じて殺菌水を含む原料液に、 ァイソ ザィム Lを添加することにより行なわれる。

上記酵素反応において、 ァシァ口 G_M1の原料であるガ ングリオシ ド類と しては特に制限されず公知のものが使 用でき、 その具体例と しては、 例えば、 ガングリォシ ド

G Ml > Dl a ゝ G D 1 b 、 " T l a G T 1 b 及ひ Go b かり 選ばれた少なく とも 1種、 牛脳抽出ガングリォシ ド混合 物等を挙げることができる。 ガングリオシ ド類の使用量 は特に制限されないが、 通常原料液 1 HIS当り 5 Omg以下、 好ま しく は 0. 0 5〜 2ing程度とすればよい。 緩衝液と しては p Hが 4〜 8程度の公知のものが使用でき、 例え ば、 1 0〜 200 mM程度の酢酸緩街液 （p H 4. 5〜 5. 5 ) 、 Mcllvaine緩衝液 （p H 3. 5〜 5. 5 ) 等 を例示できる。 アイソザィム Lの使用量も特に制限され ないが、 通常原料液 Ι ϋΐδ当り 5 mU以上、 好ま しく は

0. 1〜 1 0 U程度とすればよい。 反応温度及び p Hは 酵素が作用し得る温度及び P Hであれば特に制限されな いが、 通常 20〜 50で程度の温度及び 4〜8程度の p Hとすればよい。 反応時間は基質濃度、 反応温度等に 応じて適宜選択すればよいが、 例えば 37°Cの時には 30分〜 24時間程度とすればよい。

反応液からァシァロ G_M1を精製するに当っては公知の 精製方法が採用できる。 例えば、 反応液から溶媒抽出し た後、 濃縮、 脱塩、 凍結乾燥等を行なう ことにより精製 できる。

実 施 例

以下に参考例及び実施例を挙げ、 本発明をより一層明 瞭なものとする。

参考例 1

ラ ク トース 5. 0 g , リ ン酸第 2ア ンモニゥム 2. 0 g、 塩化ナ ト リ ウム 3. 0 g、 リ ン酸第 2カ リ ウム

1. 0 g、 硫酸マグネシウム 0. l g及び脱塩水

1 00 Omfiを含む培地 （p Hを 7. 0に調整） を、 2 β 容坂ロフラスコにいれ、 ォ一 ト ク レーブで加熱滅菌した。

これに、 アースロバク タ一 * ゥ レアフ ァ シエンス M l 0 57株を接種し、 28てで 24時間振盪培養を行ない、 得られた培養液を遠心分離 （ 1 0 0 0 0 r p m、 1 0分） して培養上清を得た。

得られた培養上清に硫安を加え、 硫安 80 %飽和で沈 澱する部分を採取し、 これを少量の水に溶かし、 1 0 m M酢酸緩衝液 （p H4. 5) で透析した。 透析液を、 可 溶性デンプンとコロ ミ ン酸とを含む 2 N水酸化ナ ト リ ウ ム溶液にェピクロルヒ ドリ ンを加えて調製した、 コロ ミ ン酸をリガン ドとするゲルを充填したカラムに通塔して ノィラ ミニダ一ゼを吸着させ、 l O O mM酢酸緩衝液

(p H4. 5) で溶出した。

次いで、 ノイラ ミニダーゼ活性区分を硫安塩折し、 脱 塩水で透析し、 透析液をクロマ トフ ォーカ シングにより 3成分に分離した。 クロマ トフ ォーカ シングは、 透析液 を、 2 5 mMイ ミ ダゾール— H C β ( ρ Η 7. 4 ) で平 衡化したポリバァ ッフ ァ一交換体充填カラムに通塔し、 ρ Η 3. 8に調整したポリ ブア ツフ ァー 74 〔フアルマ ₁。

シァ社製〕 で溶出して行なった。

得られた 3成分を個々に硫安塩析し、 l O O mMリ ン 酸緩街液 （p H 7. 0 ) に溶解し、 U ltrogel A c A 4 4 〔 1. B. F. バイオテクニクス社製〕 を用いてゲル 泸過し、 4成分を得た。 その中の 1成分から、 アイソザ ィム Lの 980単位を得た。

アイソザィム Lの酵素活性は、 チォバルビッ一ル酸法 に従い、 以下のようにして測定した。

即ち、 酵素液 0. 1 、 0. 4 %Ν—ァセチルノイラ ミ ンラク ト一ス溶液 0. 0 5mQ及び 0. 2M酢酸緩衝液 (p H 5. 0) 0. 0 5mfiを、 37でで 1 0分間反応さ せ、 遊離した N—ァセチルノイラ ミ ン酸をチォバルビッ —ル酸法で定量した。 アイ ソザィム Lの 1単位は、 37 Cで 1分間に 1マイ クロモルの N—ァセチルノイラ ミ ン 酸を生成する酵素量と した。

実施例 1

0. 5 %ガンダリオシ ド G_{Dl a} 溶液 1 πιβ、 4 0 mM酢 酸緩衝液 （p H 5. 0) 1 及び殺菌水 1 mfiを混合し、 これにアイソザィム Lの水溶液 1 πΐβ (8 U/mj2) を加え て 37。Cで 1時間反応させた後、 反応液にクロロホルム を 1 Z 1 0容添加し、 酵素反応を停止した。 反応液から、 クロ口ホルム ： メ タノール （2 : 1 ) を用いて生成した ァシァ口 G_M1を抽出した後、 凍結乾燥し、 ァシァ口 G_M1 2. Omgを白色粉末と して得た。

上記で得られた白色粉末は、 下記条件の薄層クロマ ト グラフ ィ 一による分析の結果、 ァシァ口 G_M1の標準物質 (純度 99 %以上、 ホーネン社製） と同じ R f 値

( 0. 6 1 ) の単一スポ ッ トを示し、 該標準物質と同等 以上の純度のァシァロ G_M1であることを確認した。

〔薄層ク口マ トグラフィ 一条件〕

薄層プレー ト ； メルク社製高性能 T L C (H P T L C)

No.564 1

展 開 溶 媒 ； クロ口ホルム ： メ タ ノール ：

0. 02 % C a C £ ₂ = 60 : 3 5 : 8 発 色 剤 ； オルシン硫酸試薬

実施例 2

0, 0 5 %ガンダリオシ ド G_Mr溶液 1 0ϋΐβ、 4 0 mM 酢酸緩衝液 （P H 5. 0) 1 0 m 及び殺菌水 1 Omfiを混 合し、 これにアイソザィム Lの水溶液 1 0 ma ( 3 U Zmfi) を加えて 37 Cで 8時間反応させた後、 実施例 1 と同様 にして精製し、 ァシァ口 G_M1約 2. 6mgを白色粉末と し て得た。 実施例 1 と同様にしてァシァ口 G_M1の生成を確

^ » 、しした/ 0

実施例 3 ガングリオン ド類と して、 牛脳抽出ガングリオン ド混 合液 1 0 ΙΠβ (ガングリオシ ド類 5 ingを含む） を使用する 以外は、 実施例 2と同様にして反応及び精製し、 ァシァ 口 G_M1約 3. 1 nigを白色粉末として得た。 実施例 1と同 様にしてァシァ口 G_M1の生成を確認した。

Claims

請求の範囲

① ガングリオシ ド類に、 ノィラ ミニダ一ゼ · アイ ソザ ィム Lを作用させて、 ァシァ口 G_M1を得ることを特徵 とするァシァ口 G_M1の製造法。

② ノィラ ミニダ一ゼ · ァイソザィム Lがアースロバク ター属細菌の培養物から得られる請求項①の方法。

③ アースロバクター属細菌がアースロバクタ一 · ウレ ァフ ァ シエンスである請求項①の方法。

④ アースロ ノく'ク タ一 * ゥ レアファ ンエンスがアース口 ノくクタ— · ウレァファ シエンス M l 0 57株である請 求項①の方法。

⑤ ノイラ ミニダ一ゼ♦ ァイソザィム Lが下記理化学的 性質を有する請求項①の方法。

作用 ： ガングリオシ ド類から選択的にァシァ口 G_M1 を生成する

分子量 ： 約 8800 0ダルト ン （ゲル沪過クロマ ト グラフィ 一及び S D S - P A G E電気泳動法に よる）

至適 p H _: 4. 7〜 5. 5 (牛脳ガンダリオシ ド類 を基質と した場合）

熱安定性 ： 60 以下

⑥ ガングリォシ ド類が、 ガングリォシ ド G_M1、 Gpia ■ G_Dlb 、 G_{Tl a} 、 G_T i b 及び G_Qlb から選ばれた少な く とも 1種又は牛脳から抽出されたガングリオシ ド混 合物である請求項①の方法。

⑦ ガンダリオシ ド類及び緩衝液を含む原料液に、 ノィ ラ ミニダーゼ · アイソザィム Lを添加して反応が行な われる請求項①の方法。

⑧ 原料液が更に殺菌水を含む請求項⑦の方法。

⑨ ガングリオシ ド類の使用量が、 原料液 1 mfi当り 50 以下である請求項⑦の方法。

⑩ ガングリオシド類の使用量が、 原料液 ImC当り

0. 0 5〜 2mg程度である請求項⑨の方法。

⑪ ノイラ ミニダ一ゼ♦ァイソザィム Lの使用量が、 原 料液 1 ΙΠβ当り 5 mU以上である請求項⑦の方法。

⑫ ノィラ ミニダーゼ * ァイソザィム Lの使用量が、 原 料液 ΐ Βΐβ当り 0. 1〜 1 0 ϋ程度である請求項⑪の方 法 Ο

⑬ 反応が 20〜 50 C程度の温度下に行なわれる請求 項①の方法。

⑭ 反応が H 4〜8程度で行なわれる請求項①の方法,