JP3183500B2 - 糖アルコールの定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は糖アルコールの定量
法、カラム及びキットに関する。１，５−アンヒドログ
ルシトール（以下ＡＧという）やミオイノシトール（以
下ＭＩという）などの糖アルコールは近年糖尿病のマー
カーとして注目を集めている物質である。

【０００２】

【従来の技術】ヒト体液中の糖アルコールを定量する場
合、通常多量に含まれている糖類（特にグルコース）や
タンパク質などの定量に影響を与えるような干渉物質を
除去した試料を使用する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記干渉物質の除去、
特にタンパク質の除去は従来遠心分離操作を必要とし、
煩雑であり、特に臨床応用を考える場合、その操作の簡
略化が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、 （１）糖アルコール、タンパク質、糖類を含有する検体
を、タンパク質除去能及び糖類除去能を有する塩基性陰
イオン交換樹脂を充填したカラムに通し、次いで通過液
中の糖アルコールを定量することを特徴とする糖アルコ
ールの定量方法。 （２）親水性ゲルろ過担体に４級アンモニウム基を導入
した強塩基性陰イオン交換樹脂及びホウ酸水溶液を充填
したタンパク質及び糖類除去用カラム （３）タンパク質除去能及び糖類除去能を有する塩基性
陰イオン交換樹脂及びホウ酸水溶液を充填したカラム、
糖アルコール定量用試薬及び検量線作製用糖アルコール
からなるキット （４）糖アルコール、タンパク質、糖類を含有する検体
に、油状沈澱を生じさせるタンパク質不溶化剤を添加
し、タンパク質を油状沈澱物として沈降させて上清液を
得、次いでその上清液をタンパク不溶化剤吸着樹脂及び
塩基性陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通すか又
は、タンパク質沈澱剤及びタンパク質変性剤を添加
し、タンパク質を水不溶化物として析出させ、得られた
析出液を塩基性陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通
し、次いで、得られた通過液中の糖アルコールを定量す
ることを特徴とする糖アルコールの定量方法及び （５）血中の１，５−アンヒドログルシトールを定量す
るにあたり、通液している干渉物質除去カラムとインジ
ェクターとバイオセンサーを備えた装置に多数の検体を
順次注入することを特徴とする１，５−アンヒドログル
シトールの定量法に関する。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明で用いられる検体として
は、タンパク質や糖類の混入が予想され、かつ糖アルコ
ールを含有するものであれば特に制限は無く、例えば血
清、血漿、尿、髄液などの体液や植物、動物等の組織の
抽出液などがあげられる。糖アルコールとしては、糖類
の還元体である直鎖状の多価アルコールやこれらの化合
物が分子内で脱水閉環したアンヒドロ化合物及び環状の
多価アルコールが有る。これら糖アルコールのうちでＡ
ＧとＭＩは糖尿病の診断マーカーとして有用であり、糖
尿病患者の血清中のＡＧ濃度は著しく低下し、尿中のＭ
Ｉ濃度は上昇することが知られている。なお、糖類と
は、アルドース、ケトースなどの単糖類やこれらのオリ
ゴ糖類の意で、糖アルコールは含まない。

【０００６】本発明の第１の発明においてカラムに充填
されるタンパク質除去能及び糖類除去能を有する塩基性
陰イオン交換樹脂は糖アルコールの除去能を有さないも
ので、芳香環を有さない親水性の高分子担体、例えば親
水性ゲルろ過担体（分子ふるい作用を有する高分子ゲ
ル）に４級アンモニウム基を交換基として導入した強塩
基性の陰イオン交換樹脂が好ましい。親水性ゲルろ過担
体としては例えばデキストラン、アガロース、セルロー
ス、キトサンなどの多糖類系、ポリビニルアルコール
系、ポリエチレングリコール系、ポリアクリルアミド
系、ポリ（メタ）アクリレート系などの、好ましくはポ
リビニルアルコール系又はポリ（メタ）アクリレート系
の樹脂があげられる。又、４級アンモニウム基として
は、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウ
ム基などのトリ低級（Ｃ₁ −Ｃ₄ ）アルキルアンモニウ
ム基、又、ヒドロキシエチルジメチルアンモニウム基等
のヒドロキシ低級（Ｃ₁ −Ｃ₄ ）アルキル・ジ低級（Ｃ
₁ −Ｃ₄ ）アンモニウム基があげられる。

【０００７】これらの強塩基性樹脂のイオン型は、ＯＨ
形またはホウ酸形などの弱酸塩形として用いられる。好
ましい樹脂としてはMonoQ （フアルマシア社製）、Shod
exTM（昭和電工社製）、Nucleosil 100 −ＳＢ（ナーゲ
ル社製）、Partisil 10SAX （ワットマン社製）、Sepra
lyte SAX 、Bond Elute SAX（アナリテカル インター
ナショナル社製）、QAE-Toyopearl （東ソ社製）、QA-T
risacryl（ＩＢＦ社製）、Sepabeads FP-QA （三菱化成
製）、QAE-Sephadex、Q-Sepharose （ファルマシア社
製）、QAE-Cellulose （チッソ社製）などがある。より
好ましい樹脂としてはポリビニルアルコール系の樹脂で
あってトリエチルアンモニウム基を有するQAE-Toyopear
l があげられる。又、後記のバイオセンサーを用いる場
合はポリ（メタ）アクリレート系の樹脂であってトリメ
チルアンモニウム基を有するShodex TMもあげられる。

【０００８】これらの樹脂の使用量は検体１ｍｌ当り１
ｍｌ以上好ましくは２〜６ｍｌ程度がよい。又、これら
の樹脂は目的に応じ２種以上併用してもよく、又、糖類
除去能が充分でない場合は後記の糖類除去能を有する樹
脂と併用してもよい。

【０００９】これらの樹脂はＯＨ形では安定性が無く、
長期間保存するとタンパク質除去能及び糖類除去能が低
下してくる。通常市販されるＣｌ形は安定であるが、ア
ルカリでＣｌを除去した後中性になるまで洗浄する必要
があるので、手間と時間がかかり好ましくない。本発明
者らは、ホウ酸形にすることにより安定性が向上し、使
用の際には水洗するだけでよいことを見い出した。即
ち、ＯＨ形又はホウ酸形の上記樹脂を樹脂が浸らない部
分が生じない程度の量のホウ酸水溶液、好ましくは０．
０５−１Ｍ濃度のホウ酸水溶液に浸しておくことにより
少なくとも１年間はその性能の低下を防ぐことができ
る。従って両者を充填したカラムを製造することによ
り、本発明の定量法が容易に実施しうる。また、これら
の樹脂は、イオン交換作用があるので、サンプル中にイ
オン性物質があると、イオン交換し流出液がアルカリ性
になるため、ｐＨ調整用に強カチオン交換樹脂を併用
し、例えばカラムの最下層に充填しても良く、例えばＡ
Ｇ50Ｗ−×８（バイオラッド社製）やAmberlite ＣＧ−
120 Type Ｉ（ローム＆ハース社製）などのスルフォン
酸を導入したイオン交換樹脂が用いられる。

【００１０】第１の発明を実施するには例えば次のよう
にすればよい。即ち、検体５０〜１００μｌをそのまま
上記カラムに通し、水０．５〜１．０ｍｌで該カラムを
２〜４回洗浄し、得られた通過液中に定量的に回収され
た糖アルコールをガスクロマトグラフィー法や酵素法な
どの常法により定量すればよい。なお、定量法によって
はタンパク質や糖類、特にタンパク質を完全に除去しな
くてもよい場合があり、この場合は、これらを定量に支
障のない程度に除去すればよい。

【００１１】酵素法について説明すると、測定しようと
する糖アルコールと特異的に反応する酵素を用い、たと
えば、血清中のＡＧを測定する場合には、ピラノースオ
キシダーゼやＬ−ソルボースオキシダーゼ等の１，５−
ＡＧ酸化酵素が用いられ、ＡＧの酸化反応により発生し
た過酸化水素を、種々の方法により検出すればよい。ま
た、尿中のＭＩを測定する場合にはミオイノシトールデ
ヒドロゲナーゼが用いられ反応によって生じた補酵素β
−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又
はβ−ニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸（Ｎ
ＡＤＰ）のそれぞれの還元体ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを
検出すればよい。

【００１２】定量法をさらに詳しく説明すると、例えば
ＡＧの場合、次のようにすればよい。即ち、試料に電子
受容体及びピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボース
オキシダーゼを試料１ｍｌ当り０．５〜１０単位、好ま
しくは１〜５単位添加し、４〜５０℃好ましくは２５〜
４０℃で、０．５〜３時間、好ましくは０．５〜１時間
インキュベートし次いで生成する過酸化水素量を測定
し、別に作成した検量線からＡＧ量を求めればよい。具
体的には次のとおりである。

【００１３】本発明で用いられる過酸化水素を検出する
方法としては、高感度に検出できる方法であれば、いず
れであっても良く、数多くの方法が利用できる。これら
のうちで最も一般的に用いられている方法は、ホースラ
ディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を触媒酵素とし
て、各種のＨＲＰ基質を過酸化水素で酸化するものであ
り、酸化反応の結果生成した色素、ケイ光物質や化学発
光をそれぞれ吸光度測定、ケイ光測定及び発光測定すれ
ば良い。色素を生成するＨＲＰの基質としては２，２′
−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、３，３′，
５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、４−ア
ミノアンチピリンと各種のトリンダー試薬などがある。
トリンダー試薬としては、フェノール、３−ヒドロキシ
−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）などの
フェノール誘導体、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）
や３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＤＡＯＳ）など
のアニリン誘導体がある。

【００１４】ケイ光物質を生成するＨＲＰの基質として
は、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（ｐ−ヒドロキ
シフェニル）プロピオン酸（ＨＰＰＡ）などがある。ま
た、化学発光するＨＲＰの基質としては、ルミノール、
イソルミノールなどが知られている。具体的には例えば
次のとおり、

【００１５】リン酸ナトリウム緩衝液（１／１５Ｍ，ｐ
Ｈ５．６）０．３ｍｌ、４ｍＭの２，２′−アジノビス
（３−エチルベンツチアゾリン−６−スルホン酸）（Ａ
ＢＴＳ）と１２単位／ｍｌのホースラディッシュペルオ
キシダーゼを含む発色液０．５ｍｌ、２５単位／ｍｌの
ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダー
ゼ溶液０．１ｍｌ及びＡＧ溶液０．１ｍｌを容器に入
れ、２５°で１時間反応させた後、４２０ｎｍにおける
吸光度を測定する。既知濃度のＡＧ溶液で検量線を作成
しておき試料の吸光度よりＡＧの濃度を算出する。

【００１６】ＨＲＰなしに化学発光で検出する方法もい
くつか知られている。たとえば、フェリシアンイオン存
在下に過酸化水素でルミノールを発光させる方法、金属
イオン存在下に過酸化水素でルシゲニンを発光させる方
法、ビス（２，４，６−トリクロルフェニル）オキザレ
ートの様なアリルシュウ酸エステル類の化合物をケイ光
物質存在下に過酸化水素と反応させ、シュウ酸エステル
の分解エネルギーでケイ光物質を励起させ発光させる方
法などが知られている。さらに過酸化水素を直接検出す
る方法として、過酸化水素電極を用いてもよい。

【００１７】又、たとえば、ＭＩの場合、次のようにす
ればよい。即ち、カラム通過液に補酵素及びミオイノシ
トールデヒドロゲナーゼを試料１ｍｌ当り０．１〜１０
単位、好ましくは０．５〜５単位添加し、４〜５０℃、
好ましくは２５〜４０℃で０．５〜３時間、好ましくは
０．５〜２時間インキュベートし、次いで生成する補酵
素の還元体を測定し、別に作成した検量線からＭＩ量を
求めればよい。

【００１８】本発明で用いられる補酵素の還元体、たと
えばＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを検出する方法としては、高
感度に検出できる方法であればいずれであっても良く、
数多くの方法が利用できる。これらのうちで、最も一般
的に用いられている方法は、これらの還元体そのものの
吸光度もしくはケイ光強度を測定するものである。さら
には、生成した補酵素の還元体をフェメジンメトサルフ
ェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチル
サルフェート、メチレンブルーなどの電子伝達体の存在
下に空気酸化し、発生した過酸化水素を前述の方法によ
り検出することもできる。具体的には、例えば次のとお
り。

【００１９】１４０ｍＭの硫安を含む４０ｍＭ炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９．０）１．０ｍｌ、７ｍＭ ＮＡ
Ｄ溶液０．２ｍｌ、１０単位／ｍｌのミオイノシトール
デヒドロゲナーゼ溶液０．２ｍｌ、蒸留水０．４ｍｌ及
びＭＩ溶液０．２ｍｌを容器に入れ、２５℃で２時間反
応させた後、励起波長３６５ｎｍ、検出波長４５０ｎｍ
におけるケイ光強度を測定する。既知濃度のＭＩ溶液で
検量線を作成しておき、試料のケイ光強度よりＭＩの濃
度を算出する。

【００２０】第３の発明におけるキットは上記したタン
パク質除去能及び糖類除去能を有する塩基性陰イオン交
換樹脂及びホウ酸水溶液を充填したカラム、糖アルコー
ル定量用酵素及び検出用試薬からなる糖アルコール定量
用試薬及び検量線作成用糖アルコールをワンセットした
ものである。カラムは除タンパク、、除糖しうる親水性
ゲルろ過担体を基材とした強塩基性の陰イオン交換樹脂
を上層に陽イオン交換樹脂を下層に充填したディスポー
ザブルなミニカラムである。このカラムに充填する樹脂
の１回当りの使用量は例えば次のとおり。

【００２１】 親水性ゲルろ過担体より成る塩基性 陰イオン交換樹脂（ＯＨ形又はホウ酸形） ０．１〜２．０ｍｌ ホウ酸 〜 ｍｌ 陽イオン交換樹脂 ０．０１〜０．５ｍｌ Ｓｕｂ Ｔｏｔａｌ ０．５〜２．０ｍｌ ホウ酸 ０．５〜 １０ｍｌ 全量で １〜 １２ｍｌ

【００２２】糖アルコール定量用酵素としては、たとえ
ば、ＡＧの場合、ＡＧの定量に直接使用しうる酵素であ
れば特に制限はなく、例えば前記のピラノースオキシダ
ーゼやＬ−ソルボースオキシダーゼなどがあげられる。
また、たとえばＭＩの場合ＭＩの定量に直接使用しうる
酵素であれば特に制限はなく、例えば前記のミオイノシ
トールデヒドロゲナーゼがあげられる。

【００２３】糖アルコール定量用試薬としては、発生す
る過酸化水素量を指標とする場合、パーオキシダーゼも
しくはパーオキシダーゼ様活性物質と発色基質もしくは
発色剤およびカップラー、パーオキシダーゼとケイ光基
質、パーオキシダーゼと発光基質、フェリシアンイオン
と発光基質の組み合せなどが例示される。これらの試薬
の具体例は前記「過酸化水素を検出する方法」の記載よ
り明らかである。

【００２４】又、補酵素の還元体たとえばＮＡＤＨやＮ
ＡＤＰＨの量を指標とする場合、補酵素自身とし、その
もの自身の吸光度もしくはケイ光強度を測定する。一
方、補酵素の還元体を電子伝達体を介して過酸化水素に
変換すれば、前記の過酸化水素検出試薬が使用できる。

【００２５】キット中の糖アルコール定量用の酵素の量
は１００検体用、３００検体用など測定し得る試料の数
により異なるが、１検体当り、たとえばＡＧを定量する
場合０．５〜１０単位程度、ＭＩを定量する場合０．１
〜５単位程度を加えればよい。又、定量用試薬について
は、過酸化水素検出用試薬としてＨＲＰとＡＢＴＳを用
いる場合、ＨＲＰ１検体当り、０．０１〜０．１単位、
ＡＢＴＳは１〜２０μＭになるようにキット中に入れ
る。

【００２６】補酵素の還元体の検出方法として、そのも
ののケイ光強度を測定する場合、補酵素は１検体当り、
０．２〜１０μＭになるようにキットの中に入れる。ま
た、この他、検量線作成用試料として、たとえばＡＧ又
はＭＩの場合、それぞれの１００〜１０００μＭをキッ
トに組み込むのがよい。なお、１，５−ＡＧ定量用酵素
及び検出用試薬は、全てを混合して単一の試薬としても
よく、相互に干渉する成分が存在する場合には、各成分
を適宜な組み合せとなる様に分割してもよい。また、こ
れらは、溶液状、もしくは粉末状試薬として調製しても
よく、さらにこれらを濾紙もしくはフィルムなどの適当
な支持体に含有させ試験紙もしくは分析用フィルムとし
て調製してもよい。

【００２７】次に第５の発明であるバイオセンサーを用
いる自動定量法につき説明する。この方法は干渉物質除
去カラムに水あるいはほう酸緩衝液等を通液していると
ころにサンプルを注入し、サンプル中の干渉物質を吸着
除去し、ＡＧを含む通過液を直接バイオセンサーで検出
する方法である。したがって、本発明に用いる装置は、
基本的には、検体を注入するためのインジェクターとポ
ンプ等を用いることにより通液している干渉物質除去カ
ラムとＡＧを検出するためのバイオセンサーから成って
いる。

【００２８】本発明で用いられるバイオセンサーとして
は、例えば１，５−ＡＧ酸化酵素を固定化した膜を過酸
化水素電極表面に装着したフロ・セル型検出器が挙げら
れる。フロ・セル中を通過しているＡＧは、過酸化水素
電極表面のＡＧ酸化酵素によって酸化され、同時に過酸
化水素を生成し、これを過酸化水素電極によって検出
し、ＡＧを定量するセンサーである。また、膜型の固定
化酵素ではなく、小カラムに固定化酵素を充填したカラ
ムを用いたリアクター型のセンサーを用いても同時にＡ
Ｇを定量することができる。更には、このリアクター型
の場合、ＡＧは過酸化水素に変換されて出てくるので、
過酸化水素電極の代わりに、過酸化水素を検出できる電
気化学検出器を用いたバイオセンサーを使用することも
できる。

【００２９】１，５−ＡＧ酸化酵素の固定化の方法は、
一般的に行われている酵素固定化法例えば吸着法、架橋
法、共有結合法のいずれの方法を採用しても良いが、基
質であるＡＧおよび過酸化水素の透過性の良い膜を得る
方法を採用するのが好ましい。リアクター型の場合、通
液性の良いものを採用するのが好ましい。

【００３０】過酸化水素電極を用いたバイオセンサーで
は、電気化学的に酸化還元反応を検出しているため、還
元性あるいは酸化性のある物質では、シグナルが出て過
酸化水素と同様に検出してしまうため、検体中にこのよ
うな物質が共存しているとＡＧだけを検出することがで
きない。特に血液中に存在するアスコルビン酸、尿酸等
によって、妨害されるため、ＡＧのみを測定することが
できない。そこで一般的にはこれらの物質の透過性のな
い保護膜を装置して防いでいる。ところが、本発明によ
る方法では、前記の強塩基性陰イオン交換樹脂を充填し
た干渉物質除去カラムを用いることで、これらの妨害物
質を吸着除去することができ、該カラム流出液を直接バ
イオセンサーで測定することが可能となった。なお、バ
イオセンサーでの測定には、ほとんと影響が無いが検体
中には多量のタンパクがあるため、糖類を吸着する官能
基をタンパクが覆ってしまって処理能力を著しく低下さ
せることがあるので、充填剤の素材には、注意を要す
る。好ましくは、疎水性の強い芳香環を持たない比較的
親水性の素材のアクリル系、親水性素材のポリビニルア
ルコール系の素材に第４級アンモニウム基を導入した硬
質の樹脂が良い。また、これらの樹脂のＯＨ形あるいは
ほう酸形の樹脂では、前述したようにバイオセンサーの
測定を妨害する血中成分をも除去するので、バイオセン
サーにて連続的に検出するには最適の干渉物質除去カラ
ムとなっている。また、これらの樹脂は、ンオン交換作
用があるので、サンプル中にイオン性物質があると、イ
オン交換し流出液がアルカリ性になるため、ｐＨ調整用
に強カチオン交換樹脂を併用して充填しても良く、スル
フォン酸を導入したイオン交換樹脂が用いられる。

【００３１】カラムの通液速度は、バイオセンサー部分
の接触時間と関係し、接触時間によって感度と測定時間
が変わるので慎重に選ぶ必要があるが、干渉物質除去カ
ラムの内径が４〜１００ｍｍφの場合０．１から５．０
ｍｌ／ｍｉｎ程度の流速が好ましい。このときの通液
は、圧力差を用いて流下させても良いが、流速のコント
ロールが難しいので、ポンプを使用したほうが良い。使
用するポンプは脈動の少ないものが望ましく、シリンダ
ー型、プランジャー型が優れている。インジェイターは
シリンダータイプ、固定ループタイプのどちらでも構わ
ないが、低いＡＧ濃度の検体の再現性を良くするために
は、変動の少ないインジェクターを使用したほうが良
い。全自動のシステムでは、オートインジェクターを使
用するのは言うまでもない。また、サンプルの注入量
は、測定感度にもよるが、少ないほうが、干渉物質除去
カラムの耐久性にかかわるので良く、５〜５０μｌ程度
が好ましい。本発明で用いるサンプル（検体）として
は、除タンパクをしていない血清又は血漿をそのまま用
いることが出来るが、後記の如く血清又は血漿にタンパ
ク不溶化剤を添加してタンパクを水不溶化したものをサ
ンプルとして用いてもよい。

【００３２】カラムの通液には、水あるいはほう酸緩衝
液等が用いられているが、ほう酸緩衝液ではその濃度が
高いと糖類を吸着しない場合があり、低い濃度のほう酸
緩衝液が望ましく、０．２Ｍ以下、好ましくは０．１Ｍ
以下、さらに好ましくは０．００１−０．０５Ｍの濃度
が好ましい。この場合ほう酸緩衝液のｐＨは、干渉物質
除去カラムの充填剤の種類によって変える必要があり、
強カチオン交換樹脂を併用した場合は、陽イオンが吸着
するため、ｐＨを上げたほう酸緩衝液は好ましくなく、
むしろほう酸単独のほうが好ましい。強アニオン交換樹
脂単独で使用した場合には、陽イオンは通過するのでい
ずれのｐＨでも良く、バイオセンサーの酵素の至適ｐ
Ｈ、例えばｐＨ５〜９を採用することができる。水ある
いは低濃度のほう酸では、緩衝作用が小さいため、サン
プル中のイオン性物質が、干渉物質除去カラムでイオン
交換されｐＨが変動する。そのため、酵素反応の至適ｐ
Ｈを維持することができず、バイオセンサーの酵素膜の
耐久性を悪くしたり、ノイズやショックの原因となる場
合がある。そこで、至適ｐＨを維持するため干渉物質除
去カラムの後で、緩衝作用の強い緩衝液を混合すること
は、バイオセンサーの耐久性に良い結果を与える。ここ
で用いられる緩衝液は、ＡＧ酸化酵素の至適ｐＨ、例え
ばｐＨ５〜９を維持できる緩衝液であれば、何でも良
く、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。

【００３３】本発明による方法の好ましい測定法を挙げ
ると、オートインジェクターと干渉物質除去カラムと
１，５−ＡＧ酸化酵素固定化膜を装着した過酸化水素電
極型のバイオセンサーに蒸留水あるいは低濃度のほう酸
緩衝液を流し、干渉物質除去カラムとバイオセンサーの
間にミキシングジョイントを設けリン酸緩衝液を混合
し、ミキシングコイルを経てバイオセンサーに接続して
いるものである。バイオセンサーは記録計あるいはデー
タ処理機につながり、過酸化水素電極からのシグナルを
ピークとし、面積あるいは高さとして定量する。オート
インジェクターから標準ＡＧ及びサンプルである血清あ
るいは血漿を注入し、干渉物質除去カラムの通過液中の
ＡＧのみがバイオセンサーで過酸化水素の量として定量
される。標準ＡＧから検量線を作成し、その検量線を元
にサンプル中のＡＧが定量されてくる。

【００３４】次に第４の発明について説明する。第４の
発明ので用いられている油状沈澱を生じさせるタンパ
ク不溶化剤とは、該タンパク不溶化剤を加えることによ
り、タンパク質が油状沈澱物として析出し、遠心分離操
作をすることなしに除タンパク上清を得ることができる
様にするものである。たとえば、アクリノールなどが有
る。その使用量は、検体１ｍｌ当り２〜５０ｍｇ、好ま
しくは５〜２０ｍｇ程度であり、水溶液として検体に添
加することが好ましい。

【００３５】また、タンパク不溶化剤吸着樹脂とは、除
タンパクのために過剰に加えられたタンパク不溶化剤を
吸着し得るものであれば何でもよく、アクリノールを用
いた場合には、ダイヤイオンＨＰ−２０ＳＳ（三菱化成
製）などの疎水性樹脂が好ましい。これらのタンパク不
溶化剤吸着樹脂は塩基性陰イオン交換樹脂の上層部に添
加すればよく、一回のクロマト操作により、タンパク不
溶化剤の除去と糖類の除去の両方を同時に行うことがで
きる。

【００３６】塩基性陰イオン交換樹脂は主として糖類を
除去するものであり、通常ＯＨ形又はホウ酸形として用
いられる。陰イオン交換樹脂のＯＨ形を用いる方法で
は、検体を強塩基性樹脂のＯＨ形にゆっくりと通し、糖
類を吸着除去するものである。好ましい強塩基樹脂は、
４級アンモニウム塩を交換基とする樹脂で、強塩基性の
トリメチルアミノ基（Ｉ型）やヒドロキシエチルジメチ
ルアミノ基（ＩＩ基）を有する陰イオン交換樹脂、トリ
エチルアミノ基を有する陰イオン交換樹脂（ＱＡＥ−樹
脂）などが有る。また、この方法では、処理液の樹脂中
の通過速度の影響を受けるため、樹脂の粒度を細かく
（２００〜４００メッシュ）し、ゆっくり通過させるの
が好ましい。また、処理液を中和するために、さらに陽
イオン交換樹脂で処理しても良い。

【００３７】陽イオン交換樹脂とは、各種の陰イオン性
樹脂のＨ形である。陰イオン性樹脂としては、強酸性の
陽イオン交換樹脂から弱酸性の陽イオン交換樹脂まで、
あらゆるタイプの陽イオン交換樹脂を包含する。特に好
ましくは、スルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹
脂のＨ形などがある。

【００３８】陰イオン交換樹脂のホウ酸形を用いる方法
では糖をホウ酸との複合体として吸着除去するものであ
るが、ホウ酸形の陰イオン交換樹脂であれば特に制限は
なく、強塩基性の陰イオン交換樹脂から弱塩基性の陰イ
オン交換樹脂まであらゆるタイプの陰イオン交換樹脂を
包含する。特に好ましくは、強塩基性のトリメチルアミ
ノ基（Ｉ型）を有する陰イオン交換樹脂のホウ酸塩形、
強塩基性のヒドロキシエチルジメチルアミノ基（ＩＩ
型）を有する陰イオン交換樹脂のホウ酸塩形、トリエチ
ルアミノ基を有する陰イオン交換樹脂（ＱＡＥ−樹脂）
のホウ酸塩形、中塩基性でジメチルアミノ基とヒドロキ
シエチルジメチルアミノ基の２種類のイオン交換基を有
する樹脂（バイオラッド社製、バイオレックス５）のホ
ウ酸塩形などが有る。また、検体の処理により脱落して
来るホウ酸イオンを再吸着するため、さらに陰イオン交
換樹脂で処理しても良い。さらに、処理液を中和するた
めに、陽イオン交換樹脂による処理を追加しても良い。

【００３９】陰イオン交換樹脂とは、各種陽イオン性樹
脂のＯＨ形又は弱酸塩形のものであり、陽イオン性の樹
脂としては、強塩基性の陰イオン交換樹脂から弱塩基性
の陰イオン交換樹脂まで、あらゆるタイプの陰イオン交
換樹脂を包含する。また、これら陽イオン性樹脂の弱酸
塩形を構成する弱酸類としては、炭酸、蟻酸，酢酸など
の有機酸が好ましい。陽イオン性樹脂で特に好ましいも
のは、強塩基性のトリメチルアミノ基（Ｉ型）やヒドロ
キシエチルジメチルアミノ基（ＩＩ型）を有する陰イオ
ン交換樹脂などが有る。陽イオン交換樹脂としては前記
のものがある。糖類を主とすると干渉物質の除去に多種
類の樹脂を必要とする組み合せにおいては、１本のカラ
ムに全ての樹脂が層状になる様重ねて充填するか、混合
して充填すれば良い。層状に重ねて充填する場合、糖類
を除去する樹脂を上層に、中和用樹脂を下層に充填する
のが好ましい。

【００４０】第４の発明のを実施するには検体に、タ
ンパク質を油状沈澱させうるタンパク質不溶化剤を添加
し、タンパク質を沈澱させた後、その上清を上記のカラ
ムに通過させ、カラムを水洗後通過液中の糖アルコール
を定量すればよい。第４の発明のにおいて、タンパク
質の沈澱剤としては例えばトリクロル酢酸、過塩素酸、
硫酸、塩酸などの強酸類が有る。沈澱剤の添加量は０．
５〜１０％であるが、使用する検体及び変成剤の種類と
量によって変化し、血清にＳＤＳを添加した場合のトリ
クロル酢酸の至適使用量は２〜６％となる。又、タンパ
ク質変成剤とは沈澱剤により沈澱したタンパク質の再溶
解を防止するために加えるものであり、ドデシルベンゼ
ンスルホン酸ナトリウム（以下ＳＤＳと言う）、タング
ステン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、ベンジ
ンアルコールなどが有り、中でもＳＤＳがより好まし
い。ＳＤＳを用いた場合の添加量は、検体中のタンパク
質を完全に変成させ得る十分な量であれば良く、血清の
場合０．２％〜５％であるが、より好ましくは０．５〜
２％である。

【００４１】上記のタンパク質変成剤と沈澱剤はそれぞ
れ単独に２つの溶液として構成し、順次検体に添加する
が、場合によっては、それぞれ混合した溶液とし一度に
添加しても良い。又、カラムに充填する塩基性陰イオン
交換樹脂としては上記発明２で使用するものと同じも
のが使用され、又、中和剤として陽イオン交換樹脂も併
用しうる。

【００４２】この発明４のの方法を実施するには、検
体にタンパク質変性剤と沈澱剤を添加し、タンパク質を
水不溶性の沈澱とした後、沈澱を遠心分離することな
く、そのまま樹脂を充填したカラムに通し、水洗後、通
過液中の糖アルコールを定量すればよい。なお、ここで
使用するカラムは不溶化したタンパク質をろ過して除去
できるものであれば何でもよいが、濾紙、表面親水化処
理ポリエチレン樹脂の焼結シートなどのフィルターを樹
脂の上部に取りつけたものの方が好ましい。

【００４３】第４の発明のを実施する場合の１検体当
りの使用量は例えば次のとおり、 タンパク質の変成沈澱剤 タンパク質変成剤：ＳＤＳ ２〜２０μｇ 沈 澱 剤 ：トリクロロ酢酸 ５〜３０μｇ カ ラ ム ろ過フィルター １枚以上 強塩基性陰イオン交換樹脂（ＯＨ形） ０．１〜１．０ｍｌ 陽イオン交換樹脂 ０．０１〜０．５ｍｌ 全量で０．２〜１．５ｍｌ 又は ろ過フィルター １枚以上 強塩基性陰イオン交換樹脂（ホウ酸形） ０．１〜０．５ｍｌ 強塩基性陰イオン交換樹脂（ＯＨ形） ０．１〜１．０ｍｌ 陽イオン交換樹脂 ０．０１〜０．５ｍｌ 全量で０．５〜２ｍｌ

【００４４】第４の発明のを実施する場合の１検体当
りの使用量は例えば次のとおり、 油状沈澱を生じさせるタンパク不溶化剤 アクリノール ２〜２０μｇ カ ラ ム ダイヤイオン ＨＰ−２０ ＳＳ ０．１〜０．５ｍｌ 強塩基性陰イオン交換樹脂（ＯＨ形） ０．１〜１．０ｍｌ 陽イオン交換樹脂 ０．０１〜０．５ｍｌ 全量で０．５〜２ｍｌ 又は ダイヤイオン ＨＰ−２０ ＳＳ ０．１〜０．５ｍｌ 強塩基性陰イオン交換樹脂（ホウ酸形） ０．１〜０．５ｍｌ 強塩基性陰イオン交換樹脂（ＯＨ形） ０．１〜１．０ｍｌ 陽イオン交換樹脂 ０．０１〜０．５ｍｌ 全量で０．５〜２．０ｍｌ

【００４５】

【実施例】次に、実験例、実施例により、本発明を具体
的に説明する。

【００４６】実験例１． （ピラノースオキシダーゼを使用した。ＡＧの検量線）
０．２５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ５．６）にピラノース
オキシダーゼ（グルコースに対する比活性５単位／ｍ
ｇ、宝酒造製）２ｍｇ／ｍｌ、ＨＲＰ０．２４単位／ｍ
ｌ、ＡＢＴＳ ４ｍＭとなる様に溶解しＡＧ検出試薬を
作成した。ＡＧ標準液０．１ｍｌに蒸留水２ｍｌ添加し
てＡＧ溶液とし、さらに前記のＡＧ検出試薬０．５ｍｌ
を加えて２５℃で１時間反応した。この反応液の４２０
ｎｍにおける吸光度を測定して検量線を作成したものを
図１に示した。

【００４７】実験例２． （Ｌ−ソルボースオキシダーゼを使用したＡＧの検量
線）実験例１のピラノースオキシダーゼの代りにＬ−ソ
ルボースオキシダーゼ（グルコースに対する比活性４．
３単位／ｍｇに変えて全く同様に反応させ、ＡＧの検量
線を作成した。その結果を図２に示した。

【００４８】実験例３． （ミオイノシトールデヒドロゲナーゼを使用したＭＩの
検量線）７０ｍＭ硫安を含む２０ｍＭ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．０）で、ミオイノシトールデヒドロゲナ
ーゼ（１０単位／ｍｇ、シグマ社製）及びＮＡＤをそれ
ぞれ１単位／ｍｌ、１ｍＭとなる様に溶解しＭＩ検出試
薬を作成した。ＭＩ標準液０．１ｍｌに、ＭＩ検出試薬
０．９ｍｌを加え２５℃で２時間反応した。この反応液
のケイ光強度を励起波長３６５ｎｍ、検出波長４５０ｎ
ｍで測定し、その結果を図３に示した。

【００４９】実施例１−１． （ピラノースオキシダーゼを使用するＡＧの測定）血清
検体を、後述した実施例１−４〜１−６に示す前処理を
ほどこして糖類を除去し、残存するＡＧの実験例１に示
した方法で測定した。ＡＧの定量は、それぞれのＡＧ標
準液を血清検体と全く同様の方法で前処理して作成した
検量線によって行った。その結果を表１に示した。

【００５０】実施例１−２ （Ｌ−ソルボースオキシダーゼを使用するＡＧの測定）
実施例１−１で使用したものと同一の血清検体を後述し
た実施例１−４〜１−６に示した前処理をほどこして糖
類を除去し、残存するＡＧを実験例２に示した方法で測
定した。ＡＧの定量は、それぞれのＡＧ標準液を血清検
体と全く同様の方法で前処理して作成した検量線によっ
て行った。その結果を表１に示した。

【００５１】

【表１】

【００５２】実施例１−３． （ミオイノシトールデヒドロゲナアーゼを使用するＭＩ
の測定）尿検体を、後述した実施例１−７に示す前処理
をほどこして糖類を除去し、残存するＭＩを実験例３に
示した方法で測定した。ＭＩの定量は、それぞれＭＩ標
準液を尿検体と全く同様の方法で前処理して作成した検
量線によって行った。結果は同一尿検体をガスクロで測
定した値と良く一致した。

【００５３】実施例１−４． （血清検体の、タンパク質吸着樹脂を添加した干渉物質
除去カラムによる糖アルコール分析用前処理）イオン交
換樹脂ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８Ｈ形、ＱＡＥ−トヨパール５５
０Ｃ（東ソ製）ホウ酸形をそれぞれ０．１ｍｌ、０．５
ｍｌづつ小カラムに下部より順次層状に充填し試料前処
理カラムを作成した。このカラムにヒト血清０．１ｍｌ
を直接導通後蒸留水０．５ｍｌで４回洗浄して通過液
２．１ｍｌを得た。この通過液中に回収された糖アルコ
ールのうち、ＡＧを定量する場合の例を、実験例１と同
様にして行った。同一検体のガスクロ法による測定値と
の相関を図６に示した。上記カラムにおいて、ＱＡＥ−
トヨパール５５０Ｃホウ酸形をそのＯＨに変え、他は上
記と同様にすると、本実施例と同様の結果を得た。

【００５４】また、上記前処理カラムに充填する樹脂
を、ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８ Ｈ形とＱＡＥ−トヨパール ホ
ウ酸形の１：５の混合樹脂に変え、他は上記と同様とす
ると、本実施例と同様の結果が得られた。なお、本実施
例で使用したＱＡＥ−Toyopearl のＯＨ形及びホウ酸形
の樹脂は市販のＣｌ形より次の方法で調製される。即
ち、ＱＡＥ−Toyopearl ５５０Ｃ（Ｃｌ形）２５０ｍ
ｌをカラムに充填し、０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液１
ｌをゆっくり流してＣｌイオンを流出させた後、蒸留水
で洗浄し、カラム流出廃液が中性になるので洗浄し、Ｏ
Ｈ形の樹脂を得る。このＯＨ形の樹脂に、０．５Ｍホウ
酸溶液３ｌを上部よりゆっくり流し、流出廃液のｐＨが
酸性になるまで中和する。ついで蒸留水で流出廃液が中
性になるまで洗浄し、ホウ酸形の樹脂を得る。又、ＡＧ
５０Ｗ−Ｘ８のＨ形は市販のＮａ形より次の方法で調製
される。即ち、ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８（Ｎａ形）２００ｍｌ
をカラムに充填し、ＩＭ塩酸１リットルをゆっくり流し
てＮａイオンを流出させた後、蒸留水で洗浄し、流水廃
液のｐＨを中性とする。

【００５５】実施例１−５． （血清検体の不可逆的タンパク不溶化剤とろ過フィルタ
ー付干渉物質除去カラムによる糖アルコール分析用前処
理）イオン交換樹脂ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８ Ｈ形、ＡＧ１−
Ｘ８ ＯＨ形（いづれもバイオラッド社製）をそれぞれ
０．１ｍｌ、０．４ｍｌづつ小カラムに下部より順次層
状に充填し、充填した樹脂の最上部に親水性ポリエチレ
ンの焼結フィルターをセットし、試料前処理カラムを作
製した。ヒト血清０．２ｍｌ〜５％ＳＤＳ溶液０．１ｍ
ｌを加えて振トウの後、さらに１２％トリクロル酢酸水
溶液０．１ｍｌを加えて強く振トウした。得られた沈澱
物を含む分散液の０．２ｍｌを上記の試料前処理カラム
導通し、蒸留水０．５ｍｌで４回洗浄して通過液２．２
ｍｌを得た。この通過液中に回収された糖アルコールの
うち、ＡＧを定量する場合の例を以下に示す。ＡＧの測
定は、実験例１に示した方法で行った。即ち、このＡＧ
溶液にＡＧ検出試薬０．５ｍｌを直接添加して反応させ
た。さらに、ＡＧの標準液を用いて作成した検量線を用
いて定量した。この様にして測定した正常人及び糖尿病
患者の血清ＡＧ値と、同一検体をガスクロ法で測定した
場合の血清ＡＧ値の相関を、図４に示した。この図から
明らかなように、本発明の方法による定量値は、ガスク
ロ法による定量値と高い相関性を示し、大過剰に存在す
るグルコースの影響を全く受けなかった。

【００５６】実施例１−６． （血清検体の、油状沈澱を生じさせるタンパク不溶化剤
と不溶化剤吸着樹脂添加干渉物質除去カラムによる糖ア
ルコール分析用前処理）イオン交換樹脂ＡＧ５０Ｗ−Ｘ
８ Ｈ形、ＡＧ１−Ｘ８ ０Ｈ形（いずれもバイオラッ
ド社製）、疎水性樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０ＳＳ（三
菱化成製）をそれぞれ０．１ｍｌ、０．３ｍｌ、０．１
ｍｌづつ小コラムに下部より順次層状に充填し試料前処
理カラムを作製した。ヒト血清０．２ｍｌへ２．５％ア
クリノール０．２ｍｌを加えて振トウした。血清中のタ
ンパク質は油状の沈澱となって沈降するので、この上清
部分の０．２ｍｌを上記の飼料前処理カラムへ導通し、
蒸留水０．５ｍｌで４回洗浄して通過液２．２ｍｌを得
た。この通過液中に回収された糖アルコールのうち、Ａ
Ｇを定量とする場合の例を、実施例１−４と同様にして
行った。同一検体のガスクロ法による測定値との相関を
図５に示した。

【００５７】実施例１−７． （尿検体のタンパク吸着樹脂を添加した干渉物質除去カ
ラムによる糖アルコール分析用前処理）イオン交換樹脂
ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８ Ｈ形、ＱＡＥ−トヨパールホウ酸形
をそれぞれ０．２ｍｌ．１．８ｍｌづつ小カラムに下部
より順次層状に充填し、試料前処理カラムを作成した。
このカラムにヒト尿０．５ｍｌを直接導通後、蒸留水
１．０ｍｌで８回洗浄して通過液８．５ｍｌを得た。こ
の通過液中に回収された糖アルコールのうち、ＭＩを定
量する場合の例を以下に示す。上記の通過液８．５ｍｌ
全量を濃縮乾固し、蒸留水０．１ｍｌで再溶解して前処
理カラムの処理液を得た。ＭＩの検出は実験例３に従っ
て行った。即ち、この処理液に、直接ＭＩ検出試薬を
０．９ｍｌ添加して反応させた。さらに、ＭＩの定量は
ＭＩ標準液を用いて作成した検量線を用いて行った。こ
の様にして測定した正常人と糖尿病患者の尿中ＭＩ値
を、同一検体のガスクロ法での測定値と比較した結果を
表２に示した。

【００５８】

【表２】

【００５９】実施例１−８． （血清ＡＧ測定キットの例） （１）キットの調整 ＡＧ検出試薬：ＰＲＯＤ２００ｍｇ（５単位／ｍｇ、宝
酒造製）、ＨＲＰ０．２４ｍｇ（１００Ｕ／ｍｇ、和光
純薬製）及びＡＢＴＳ２２０ｍｇ（ベーリンガー社製）
を０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）１
００ｍｌを溶解し、１６ｍｌづつバイアルに分注し、常
法により凍結乾燥した。 復元液：トリトン；Ｘ−４０５（和光純薬製）０．６ｇ
を蒸留水１００ｍｌに溶解し、バイアルに１６ｍｌづつ
分注して栓をした。 標準液：５ｍｇのＡＧを１００ｍｌの蒸留水で溶解し、
バイアルに３ｍｌづつ分注して栓をした。 前処理カラム：フリットフィルターを装着したリザーバ
ー（１．５ｍｌ容量、アナリティカルインターナショナ
ル社製）に、下から順にＡＧ５０Ｗ−Ｘ８ Ｈ形（バイ
オラッド社製）０．１ｍｌとＱＡＥ−トヨパールホウ酸
形（東ソ社製）０．５ｍｌを充填した。さらに充填した
樹脂上からフリットフィルターを装着し、樹脂が動かな
い様に固定した。また、充填した樹脂の安定性を保ちか
つ乾燥しない様に０．２Ｍのホウ酸溶液をカラム上部に
満たし、出口にはキヤップを取り付け入口にはシールを
して密封した。

【００６０】（２）操作法 前処理カラムのキャップとシールを取り除きリザーバー
内のホウ酸溶液を排液し、さらに１ｍｌの蒸留水で２回
洗浄することにより、樹脂内の過剰のホウ酸を完全に洗
い流した。この洗浄した前処理カラムを試験管の上にセ
ットし、血清検体１００μｌを直接導通後、さらに蒸留
水０．５ｍｌで４回洗浄して通過液２．１ｍｌを得た。
ＡＧ検出試薬１バイアルを復元液１バイアルで復元し、
この溶液０．５ｍｌを、上記の前処理カラム通過液２．
１ｍｌに加えて攪拌し、２５℃で１時間反応した。この
反応液の４２０ｎｍにおける吸光度を通常の分光光度計
により測定した。また標準液を蒸留水で倍々希釈して希
釈系列を作成し、これも血清検体の場合と同様に処理し
て反応させ、ＡＧの検量線を作成した。血清検体中のＡ
Ｇ濃度は、この検量線を用い検体の吸光度値から計算し
た。キットの方法によっても、実施例１−４と同様の結
果が得られた。

【００６１】実施例２−１ 測定は、ポンプから、０．０５Ｍ−ほう酸緩衝液（ｐＨ
５．８）を０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で送液し、オート
インジェクター、干渉物質除去カラム、バイオセンサー
とこれに連結したデータ処理機からなる装置で行った。
バイオセンサーは、フローセル（容量約１００μｌにつ
いた過酸化水素電極（（株）エイブル社製）の表面（５
ｍｍφ）に同じ大きさのＰＲＯＤ固定膜をナイロンネッ
トで装着して使用した。ＰＲＯＤ固定化膜は、次の方法
により作成した。ＰＲＯＤ（宝酒造（株）製５．４Ｕ／
ｍｇ）１０ｍｇと牛血清アルブミン（シグマ社製）６ｍ
ｇを１／１５Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）０．６ｍ
ｌに溶解し、１％グルタルアルデヒド水溶液０．２ｍｌ
を加え混合する。混合後直ちにニトロセルロース膜（２
５ｍｍφ×孔径３μｍ）２枚の上にゆっくり滴下し、全
体が均一になるように広げて、４℃で一夜風乾して得
た。

【００６２】干渉物質除去カラムは、５ｍｍφ×１００
ｍｍのカラムにポリビニルアルコール系のＱＡＥ−トヨ
パール５５０Ｃ（東ソ−（株）社製）を通常の方法でＯ
Ｈ形としさらにほう酸形とした樹脂と強カチオン交換樹
脂ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８（Ｈ形）（バイオラッド社製）を
５：１に混合した樹脂を充填したカラムを用いた。この
装置で、オートインジェクター（２０μｌ固定ループ）
にＡＧの標準１，１０，４０μｇ／ｍｌを並べ、次いで
血清サンプル１０本並べて、測定を開始した。データ処
理機により、ＡＧの標準の面積値から検量線を作製し、
サンプルのＡＧ定量値が得られた。また、同一検体をＧ
Ｃ法で測定した定量値と相関を図７に示した。この図か
ら明らかなように、本発明による定量値は、ＧＣ法と高
い相関を示した。

【００６３】実施例２−２ 測定装置は、ポンプ２台、オートインジェクター、干渉
物質除去カラム、バイオセンサーとこれに連結したデー
タ処理機からなっており、オートインジェクターに接続
して干渉物質除去カラムに水０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速
で流し、カラム通過液は、０．１ｍｌ／ｍｉｎの流速で
供給される０．５Ｍ−リン酸緩衝液とミキシングジョイ
ントを通じて混合され、ミキシングコイル（１．０ｍｍ
φ×３ｍ）にて完全に混合された実施例２−１と同じバ
イオセンサーのフローセルに入るように接続された装置
である。干渉物質除去カラムは、５ｍｍφ×１００ｍｍ
のカラムにＱＡＥ−トヨパール５５０Ｃ（ほう酸形）を
充填したものを用いた。この装置で、実施例２−１と同
様に測定した。また、同一検体をＧＣ法で測定した定量
値との相関を図８に示した。この図から明らかなよう
に、本発明による定量値は、ＧＣ法と高い相関を示し
た。

【００６４】実施例２−３ 測定装置は、実施例２−２と同様なシステムで行い、干
渉物質除去カラムに０．０１Ｍ−ほう酸緩衝液（ｐＨ
６．０）を１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流し、もう一方
から１．１Ｍ−りん酸緩衝液（ｐＨ５．８）を０．１ｍ
ｌ／ｍｉｎの流速で供給して使用した。干渉物質除去カ
ラムは、５ｍｍφ×１００ｍｍのカラムにアクリル系の
シヨウデックスＴＭ−Ｌ（昭和電工（株）製）（ほう酸
形）を充填したものを用いた。この装置で、実施例２−
１と同様にして、血清サンプル２０本を測定した。ま
た、同一検体をＧＣ法で測定した定量値との相関を図９
に示した。この図から明らかなように、本発明による定
量値は、ＧＣ法と高い相関を示した。

【００６５】

【発明の効果】以上から明らかなように、本発明の方法
によれば、検体中のタンパク質や糖類などの干渉物質が
簡単に除去でき、糖アルコール類の測定が極めて簡便に
なった。特定の糖アルコールに特異性は有るが、糖類と
幅広く反応する様な酵素であっても、本発明の糖類除去
の前処理法を組み合せれば、充分定量用に用い得ること
が明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ピラノースオキシダーゼを使用したＡＧの検
量線

【図２】 Ｌ−ソルボースオキシダーゼを使用したＡＧ
の検量線

【図３】 ミオイノシトールデヒドロゲナーゼを用いた
ＭＩの検量線

【図４】 第４のの発明により処理された血清をピラ
ノースオキシダーゼを用いて測定した値と、ガスクロ法
の相関

【図５】 第４のの発明により処理された血清をピラ
ノースオキシダーゼを用いて測定した値とガスクロ法の
相関

【図６】 第１の発明により処理された血清をピラノー
スオキシダーゼを用いて測定した値と、ガスクロ法の相
関

【図７】 実施例２−１の測定システムで血清中のＡＧ
を測定したときのＧＣ法との相関

【図８】 実施例２−２の測定システムで血清中のＡＧ
を測定したときの相関

【図９】 実施例２−３の測定システムで血清中のＡＧ
を測定したときのＧＣ法との相関

フロントページの続き (72)発明者 橋場 正 群馬県新田郡笠懸村阿左美804−12 (72)発明者 速水 宏 群馬県高崎市岩鼻町239 (72)発明者 竹澤 智子 群馬県藤岡市藤岡1906−５ (72)発明者 平山 正近 埼玉県大宮市奈良町136−51奈良町団地 ７−203 審査官 宮澤 浩 (56)参考文献 特開 昭58−109849（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−266071（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−31055（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−6756（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−79780（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−35231（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 30/88 G01N 27/416 G01N 30/14

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】糖アルコール、タンパク質、糖類を含有す
   る検体に、油状沈澱を生じさせるタンパク質不溶化剤
   を添加し、タンパク質を油状沈澱物として沈降させて上
   清液を得、次いでその上清液をタンパク不溶化剤吸着樹
   脂及び塩基性陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通す
   か又は、タンパク質沈澱剤及びタンパク質変性剤を添
   加し、タンパク質を水不溶化物として析出させ、得られ
   た析出液を塩基性陰イオン交換樹脂を充填したカラムに
   通し、次いで、得られた通過液中の糖アルコールを酵素
   法により定量することを特徴とする糖アルコールの定量
   方法。
2. 【請求項２】血中の１，５−アンヒドログルシトールを
   定量するにあたり、通液している干渉物質除去カラムと
   インジェクターとバイオセンサーを備えた装置に多数の
   検体を順次注入することを特徴とする１，５−アンヒド
   ログルシトールの定量法。