FR2476129A1 - Procede de production d'un colorant pour detecter la presence de peroxyde d'hydrogene dans un milieu aqueux, procede de determination enzymatique de la quantite d'un composant dans un fluide corporel et systeme reactif a utiliser - Google Patents

Procede de production d'un colorant pour detecter la presence de peroxyde d'hydrogene dans un milieu aqueux, procede de determination enzymatique de la quantite d'un composant dans un fluide corporel et systeme reactif a utiliser Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR DETECTER LA PRESENCE DE PEROXYDE D'HYDROGENE DANS UN MILIEU AQUEUX. SELON L'INVENTION, ON AJOUTE A CE MILIEU AQUEUX, DE LA PEROXYDASE, UN ACIDE AMINOAROMATIQUE REPRESENTE PAR LA FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI) OU X EST UN GROUPE MONO- OU DIALCOYLAMINO ET ZH EST LE GROUPE CARBOXYLE OU LE GROUPE SULFO, ET UNE 4-AMINOANTIPYRINE REPRESENTEE PAR LA FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI) OU CHACUN DE R ET R, PRIS SEPAREMENT, EST UN ALCOYLE, R EST UN FRAGMENT AROMATIQUE, CHACUN DE R ET R, PRIS SEPAREMENT EST DE L'HYDROGENE OU UN ALCOYLE, ET Y EST DE L'OXYGENE ET DU SOUFRE; ET ENSUITE ON MESURE, PAR PHOTOMETRIE, TOUT CHANGEMENT RESULTANT DE COULEUR. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT AUX PROCESSUS ANALYTIQUES POUR LE PEROXYDE D'HYDROGENE, AINSI QUE DANS DES ANALYSES ENZYMATIQUES AVEC FORMATION DE PEROXYDE D'HYDROGENE.

Description

La présente invention concerne un réactif et un procédé utiles pour la
détermination analytique du peroxyde d'hydrogène. Plus particulièrement, elle concerne un nouveau réactif chromogène et son utilisation pour la détermination analytique,couplée de façon enzymatique,de
peroxyde d'hydrogène.
On connait une grande variété de procédés pour la déterminat!on analytique du peroxyde d'hydrogène. Dans une classe de ces procédés, on util2e l'enzyme peroxydase pour catalyser la réaction d'un substrat avec du peroxyde d'hydrogène afin d'oxyder le substrat et de former de l'eau. Les déterminations enzymatiques de ce type ont trouvé une utilité particulière dans l'analyse de diverses substances comme le cholestérol, le glucose et l'acide urique, dans les fluides corporels tels que le sang. Dans de tels procéedeés, le fluide corporel est mélangé à un enzyme pouvant catalyser l'oxydation de la substance à
déterminer avec formation concurrente de peroxyde d'hydro-
gène. Le fluide est également mélangé à de la peroxydase et un substrat de la peroxydase qui, à l'oxydation, subit un changement de couleur. L'étendue du changement de
couleur est une mesure de la quantité de peroxyde d'hydro-
gène formé, qui, à son tour, est une mesure de la substance à déterminer. Par exemple, dans "Automated Determination of Glucose Using Glucose Oxidase and Potassium Ferrocyanide Analyt. Biochem. 26 12-17.(1968), Hall et autres décrivent ue méthode pour la détermination quantitative du glucose par oxydation avec du lose oxydase pour former de l'acide gluconique et du peroxyde d'hydrogène, et la réduction du Do peroxyde d'hydrogène par du ferrocyanure de potassium en prêsence de peroztdase pour former du ferricyanure. Dans nDetermination of Glucose in Blood Using Glucose Oxidase With an Alternative Oxygen Acceptor", Ann. Clin. Biochem. 6, 24-27 (1969), Trinder décrit l'utilisation du phénol et de 4aminophénazone(4-aminoantlpyrine) comme système de
formation de couleur à la place du ferrocyanure de potas-
sium. Dans ce système, on pense que le phénol est oxydé puis réagit avec la 4-aminoph6nazone pour former un colorant de quinonimine, une réaction qui a précédemment été décrite
par Emerson dans "The Condensation of Aminoantipyrine II.
A New Color Test for Phenolic Compounds", J. Org. Chem. 8, 417-28 (1943) et dans le brevet U.S. N 2 194 201 accordé le 19 Mars 1940. Plus récemment, Meiattini, dans le brevet U.S. N 3 866 045 accordé le 27 Mai 1975 a appliqué les
réactifs décrits par Emerson à la réaction de Trinder.
Ce type de processus peut être employé pour déterminer d'autres constituants du sang ou d'autres fluides corporels en remplaçant le glucose oxydase par un enzyme pouvant catalyser l'oxydation d'un autre composant comme le cholestérol oxydase ou l'acide urique oxydase (uricase) avec formation concurrente de peroxyde d'hydrogène
Par exemple, l'adaptation de ce processus A la détermina-
tion de l'acide urique du sérum est décrite par Trivedi et autres dans "New Enzymatic Method for Serum Uric Acid at 500 nm", Clin. Chem. 24 (11) 1908-11 (1978). Cependant, le chromophore du type Trinder n'est pas aussi sensible qu'on le souhaite pour la détermination des métabolites comme l'acide urique, qui sont habituellement présents dans le sang & de trbs faibles concentrations, c'est-à-dire de l'ordre de 4 à 9 mg/100 ml de sang, en comparaison avec des concentrations de 80-100 mg/'100 ml pour le glucose et
de 150-250 mg/100 ml pour le cholestérol.
Un autre système chromogène-chromophore qui a été employé comme détecteur du peroxyde d'hydrogène dans des
processus analytiques de ce type est le système 3-méthyl-
2-benzothiazolinone hydrazone/N,N-dimêthylaniline, o les deux réactifs se lient par oxydation pour former un colorant d'indamine liée de covalente. L'application de ce processus à l'analyse de l'acide urique et du glucose est indiquée par Gochman et autres dans 'Automated Deteramination of Uric Acid, With Use of a Uricase-Peroxidase System', Clin. Chem., 17,(12), 1154-59 (1971) et 'Application of a New Peroxide Indicator Reaction to the Specific, Automated
Determination of Glucose with Glucose Oxidase', Clin. Chez.
18, (9); 943-50 (1972).
La présente invention concerne un nouveau système chromogène-chromophore pour la détermination enzymatique du peroxyde d'hydrogène. Plus particulièrement, elle se rapporte à un nouveau système chromogènechromophore pouvant être utilisé dans la détermination enzymatique de composants du sang par la formation intermédiaire de
peroxyde d'hydrogène et qui, par le coefficient inhabituel-
lement élevé d'extinction du chromophore, présente la sensibilité requise pour la détermination de- composants, comme l'acide urique, qui sont normalement présents à une
faible concentration.
En conséquence, la présente invention a pour objet
un nouveau réactif et un nouveau procédé pour la détermina-
tion du peroxyde d'hydrogène.
Elle a pour autre objet un nouveau réactif et un nouveau procédé pour la détermination liée de façon
enzymatique du peroxyde d'hydrogène.
Elle a pour autre objet un nouveau réactif et un nouveau procédé pour la détermination de composants de fluides corporels par formation enzymatique de peroxyde d'hydrogène comme intermédiaire, suivie d'une détermination liée de façon enzymatique du peroxyde d'hydrogène ainsi formé. Ces objets de l'invention et d'autres encore, qui
deviendront mieux apparents à la lecture de la description
qui suit, sont athints en mettant le peroxyde d'hydrogène en contact avec, comme chromogène, un mélange d'un acide 3-aminoaromatique qui sera défini ci-après et d'une 4-aminoantipyrine qui sera décrite ci-après, dans des conditions suffisantes pour former un nouveau colorant ou chromophore.
L'acide aminoaromatique qui et employé selon 1 'inven-
tion est soit un acide 3-aminobenzolque ou un acide 3 -
aminobenzène sulfonique. De tels acides peuvent être repré-
sentés par la formule structurelle qui suit: X
X WZH (I)
ZH o X est un groupe mono- ou dialcoylamine et ZH est le - groupe carboxyle (-C02H) ou sulfo (-SO3H). La nature du groupe alcoyle du groupe alcoylamine n'est pas critique, à condition qu'elle permette la formation du colorant souhaité. En conséquence, pour des raisons qui deviendront mieux apparentes ci-après, il ne faut pas employer de groupes encombrants tels que des groupes alcoyle tertiaires
ou cycloalcoyles. On préfère des groupes alcoyles primaires.
La longueur du groupe alcoyle n'est pas critique, tant que 1 'acide aminoaromatique et le colorant résultant sont solubles dans des milieux aqueux. Cependant, on préfère des groupes alcoyles inférieurs c'est-àdire des groupes alcoyles ayant de l'ordre de 1 & environ 6 atomes de carbone comme du méthyle, de l'éthyle, du propyle, du butyle, du pentyle et de l'hexyle. On préfère des groupes
dialcoylamino, en particulier le groupe diméthylamino.
Les acides aminoaromatiques peuvent être substitués sur la partie aromatique (c'est-à-dire le noyau benzène), à condition-que le substituant n'interfère pas avec la formation du colorant. Par exemple, un ou plusieurs atomes d'halogène comme des atomes de chlore ou de brome peuvent être présents. On pense cependant qu'aucun substituant non-labile, comme un alcoyle, ne doit être présent en
position para du groupe amino.
Le second composant du réactif selon l'invention est une 4aminoantipyrine, qui peut être représenté par la formule: R2 (II) Y:= r y = -R1 R3R4N -_d== C- R
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Presence of Oxidizing Agents", J. Org. Chem., 3, 153-65 (1938), décrit également la réaction d'aminobenzènes, comme de l'aniline et de la diméthyl aniline avec de la 4-aminoantipyrine, mais il se forme de nouveau un colorant lié de façon covalente et le groupe 4-amino de la 4- amino-
antipyrine doit être non-substitué.
6H5 H
NH2 C5 f CH3 1 2N-o.CH3 H m+. CH3 H2N N CH
H2 CHU 3
2 3
Au contraire, le colorant selon l'invention se forme même si le groupe 4amino de l'aminoantipyrine est substitué. Par exemple, quand on fait réagir de l'acide 3-(diméthylamino)benzolque, en présence de peroxyde
d'hydrogène et de peroxydase, soit avec de la 4-amino-
antipyrine ou de la 4-(diméthylamino)antipyrine, il se forme un colorant bleu ayant une absorbance maximum à 550 nm. Quand l'acide 3-4im6thylamino) benzolque est remplacé par du phénol ou du p-hydroxybenzoate de sodium, il se forme un colorant rouge ayant une absorption maximum
à 500 nm avec la 4-aminoantipyrine, mais on ne voit sensi-
blement pas de réaction avec la 4-liméthylamino)antipyrine.
Selon Emerson (Eisenstaedt), la réaction de la N,N-
diméthylaniline avec de la 4-aminoantipyrine forme un
colorant imino tandis que la substitution de la 4-amino-
antipyrine par la 4-(N,N-diméthylamino)antipyrine ne conduit qu'à la formation de 4-(N,N-diméthylamino)antipyrire
oxydée et de coloration bleue.
Le produit coloré ou colorant formé avae l'acide 3-(dimêthylamino) benzolque selon l'invention, est plus soluble dans l'eau que ne le sont les colorants imines liés
de façon covalente formés à parfir de phénol, de p-hydroxy-
benzoate de sodium ou de diméthylaniline. Par ailleurs, il est moins soluble dans des solvants organiques comme H
H H1. -NH
H e oç
I 0:O:H Oú
H
H H /-H
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12:1, quand le groupe 4-amino est un groupe amine primaire.
Quand le groupe amino est un groupe amino tertiaire, cependant, le rapport optimal de l'acide (I) à l'antipyrine (II) est inférieur à 1:1 et il est de préférence de l'ordre de 0,25:1, c'est-à-dire de l'ordre de 0, 2:1 à environ
0, 3:1.
Les concentrations des deux chromogènes sont celles
suffisantes pour former une quantité mesurable du colorant.
En général, les concentrations de l'aminoantipyrine peuvent
être comprises entre environ 0,01 et environ 1.000 milli-
moles par litre, et mieux entre environ 0,1 et environ millimoles par litre. On préfère une concentration de
l'aminoantipyrine de l'ordre de 0,35 à environ 0,5 milli-
mole par litre. La concentration de l'aminoacide est celle requise pour donner un colorant dans la période de temps souhaitée, et elle peut varier entre une valeur aussi faible que 0,1 millimole par litre Jusqu'à la limite de
solubilité ou environ 50 millimoles par litre.
Comme on l'a noté ci-dessus, la réaction des deux chromogènes avec le peroxyde d'hydrogène est catalysée par l'enzyme peroxydase. Comme on le sait bien, cet enzyme est obtenu d'un grand nombre de sources, parmi lesquelles le raifort,le foie, le persil et certaines bactéries. Bien que la nature de la peroxydase obtenue des différentes sources varie, la source particulière de peroxydase n'est pas critique dans le cadre de l'invention. Cependant, la peroxydase du raifort est la forme la plus courante de peroxydase, et pour cette raison, on la préfère. La
quantité de peroxydase employée n'est pas une caractéris-
tique de l'invention, et les quantités employées dans l'art antérieur peuvent *tre utilisées. En général, cependant, on emploie au moins 50 unités de peroxydase par litre de solution, et de préférence au moins 500 unités par litre. En principe, il n'y a pas de quantité maximum; cependant, des quantités de permydase supérieures à environ 2.500 unités par litre sont inutiles, et des quantités comprises entre environ 1.200 et environ 1.600 unités par
litre sont préférées.
La température & laquelle a lieu la réaction, ainsi que le pH du mélange réactionnel affectent la vitesse de formation du colorant et sa stabilité. En général, la vitesse de la réaction augmente et la stabilité du colorant diminue avec la température, et l'on utilise généralement une température de l 'ordre de la température ambiante (c'est-à-dire entre environ 20 et environ 45 C et de préférence entre environ 25 et environ 30 C). Par ailleurs, comme on le sait bien, l'activité de la peroxydase est optimale à un pH de l'ordre de 6,8, c'est-à-dire entre
environ 6,5 et environ 7,0.
Si, cependant, l'invention est employée dans une partie d'une analyse enzymatique d'un composant d'un fluide corporel, alors la température et le pH peuvent devoir
être ajustés pour optimiser le schéma réactionnel total.
Par exemple, lors de l'analyse du cholestérol, on préfère une température de l'ordre de 30 C et un pH de l'ordre de
7,5; lors de l'analyse du glucose, on préfère une tempéra-
ture de l'ordre de 25 C et un pH de l'ordre de 7,0; et lors de l'analyse de l'acide urique, on préfère une
température de l'ordre de 25 C et un pH de l'ordre de 8,0.
Du fait de l'importance du pH pour les réactions enzymatiques, il est souhaitable d'employer un tampon étudié pour maintenir le pH souhaité pendant la période
requise pour effectuer l'analyse. De tels tampons compren-
nent le phosphate, le pyrophosphate, le borate et autres
tampons bien connus,comme le tris(hydroxyméthyl)amino-
méthane ("tris"), l'acide N,N,N-tris(2-hydroxyéthyl)-
méthyl-2-aminométhane sulfonique ("TES"), l'acide enb elqeBuTeqnos uawalee9 %se II *esuesodmoo saezne sap sanaTsnld no un oeAe e3ueIgm ue no 4uemaeuds sgileqme aS% lueAned Tnb 'seaTeueuIddns suesodwmoo ap eaxoj snos sgiodiooulT 4uo9 'eaqoqs exuo snos %ue0esn3e2%ueAe 4sa aTïi%3 - ueamgIddns seu&zue sep 'Sues np suesodwoo sap sIeus I v 9Ufsap 8 se eIqmesueI Ts 'eam aea 'sqasodmoo S3o0 ap xnep xne no unl y aqgueIw 4a: no 4ueuauedgs eagIequa ai% a ned esep/xoad ea vaedp9s s eiqme 4uamesnaeS - eUeAe %uos anbl4emoauouTme epToul %a eul4dpueouue1I qlmwesua 1sa un suea o'enbTemoieouTme ap-eUtI 4e euTxdTuu -ouTmuI 'esep&xoaed el ausauoa -Top IT 'euqeoip qip ep&xoiad np esAIeuelTguipsp 4meIQwe3ail PuenD *soas sapTIos op auxo, snos sglleqae IuewesneluueAe 4uos sam&zu i ssa saqwesua qIel ap sUca saelqes sePtloS sap xnep sno0 4u1xm (II) aUT údTUue -ouTme, Iae (I) enbTumo.4zeouTue epToeI enb uoTuaAuTI ap *20eUuAe un 4sa,3 s992uelm ea -4u iSAnald saneaTnId no xnep uaTq no %luompuedgs slleque ae% IaAnoad s4ua!pp92uW saq * 58euTuaa4pgad SUOT4OdOJd sep s9e-Fos saeppasuT sl U8eT4uoo Tnb aelquesue no anb0lebIeu emsis un amo, UO UOT4UaAUTsI p UOT4STITea op apom Un su3e U0TV1.U&&UT am-Wsisd ei ep enbsTiouj alleAnou eun vnd eaOu au e ro snbiuoo jed %a anuuoo 4e asspúxo e;eo asp î4Tuenb el oarT.n epTOe,il p asepxo,1e 4o8 %4se0loqo np aspXepTXo eS0TonTI np asep&xo,1 ueuueJdmoo sit %a usesepLxou ep mou ai snos snuuoo 4-ueeIlJeu9S %uo0 samIzue sla% ea uoosa[4 b ue 4uesodwoo np uoI4epúxo;ed au2ojpÀqp ep/xoied ip uo'g -eumaoj et laesAs eo 4ueAnod aemàzue un %ua8mera9 Toldume uo taJodJoo apTnl$ unp anbt;$opds %umsodmoo un,p as IeueI inod uoTueAuT eluasegd e aeTolIdme uo pueno ser2oleue 40 (USSE[u) enbIuojIns aueq9ouTWe-Z-( I q%9.xo.pq-z) slF-H'N apToe&I (#SadIau) (anbTuojlns auuq49-z aPTOU)sTq-N'N-auTzeuadTd UI (KaUToTJala) UUTTCti>t{9E( I 49XXT4q) 9TJ4-'N' Nt (#auoTqul) aumolIXq49uX %goupLt-z)9Tq-g)N et o(u-îeu) anbuo; $ns aUe4%9-g-.N-auTzeJ9dTd( t 4%Xo0p&R-E)-H ú1, 6Zl9LtZ l'ensemble contienne un tampon, qui peut être emballé séparément ou en mélange avec l'antipyrine, l'acide aminoaromatique et/ou la peroxydase. Alternativement, tous les composants solides peuvent être emballés en un seul mélange.Ben que oea soet moins souhaitable, un ou plusieurs des composants peut être emballé sous forme d'une solution aqueuse, soit sous forme d'un concentré ou à peu près à
la concentration d'utilisation.
Quand l'ensemble doit être employé dans une analyse, les composants sont mélangés ensemble, dissous ou dilués avec de l'eau si nécessaire, et employés pour effectuer
l'analyse voulue par des techniques généralement connues.
En effet, les divers ingrédients sont mélangés à la solution & analyser et le mélange résultant est maintenu à une température prédéterminée pour permettre au colorant selon l'invention de se former. La concentration du colorant
est alors déterminée, par exemple par une analyse photo-
métrique traditionnelle. De telles analyses peuvent être accomplies à la main ou automatiquement en utilisant un équipement et des techniques déjà bien connus, et en
conséquence, on ne les décrira pas mieux ici.
Les exemples qui suivent illustrent la présente invention et en particulier son utilisation pour la
détermination des composants des fluides corporels.
Exemple I Analyse de l'acide urique (manuelle) On prépara une solution aqueuse contenant 200 unités par litre d'uricase, 1.400 unités par litre de peroxydase,
0,35 millimole par litre de 4-aminoantipyrine, 100 milli-
moles par litre de tampon tris et 5,0 millimole par litre d'acide 3-(N,Ndiméthylamino)benzoique, et ayant un pH de 8. A une portion de 2,0 ml de ce réactif, on ajouta 50>A
d'un échantillon contenant de l'acide urique à 250C.
L'absorbance à 550 nm fut mesurée immédiatement après l'addition de l'échantillon au réactif, et elle fut de nouveau mesurée au bout de 6 minutes. La concentration en acide urique fut calculée par l'équation qui suit: Cu = A A(MWua) (o103) (TV) a (V (LP) (10) (SV) dans laquelle Cua: concentration en acide urique en mg/dl A: changement d'absorbance, ou différence entre l'absorbance au bout de 6 minutes et l'absorbance initiale MWua: poids moléculaire de l'acide urique (168,11 daltons) TV: volume réactionnel total, ml LP: traJet de lumibre, cm : coefficient d'extinction molaire du colorant produit (1,72 x 1041 mole1 cm-1)
SV: volume de l'échantillon, ml.
Dans le système employé, l'équation peut ne réduire à Cua = 40,0 A. On répéta le processus avec neuf échantillons standards différents d'acide urique. Pour chaque échantillon on effectua une autre détermination en utilisant un réactif "Statzyme Uric Acid", réactif commercialisé par Worthington Diagnostics Division de Millipore Corp., pour l'analyse de l'acide urique, et en mesurant l'absorbance & 293 nm, dans des buts de comparaison. Les résultats pour les diverses analyses sont résumés comme suit: \ Echantillon Standard aq., 2mg/dl Standard aq., 6 mg/dl Standard aq., 12 mg/dl Monitrol I Validate SHA référence 3 Sérum de référence Stattrol Monitrol II Validate A Concentration Art antérieur 1,9 ,9 11,8 4, 7 ,0 6,7 6,5 8,4 8,1 mesurée, mg/dl Présente invention 2,0 6,2 11,7 4,0 4, 1 6,6 7,3 9,2 8,9 A la lecture de ce qui précède, on peut voir que les analyses obtenues en utilisant le réactif selon l'invention sont comparables à celles obtenues en utilisant le réactif selon l'art antérieur. Les concentrations en réactif utilisées dans cet exemple sont optimales pour les produits chimiques spécif ques utilisés. Cependant, on peut obtenir des résultats efficaces avec les concentrations qui suivent: Uricase > 10 unités/litre Peroxydase >,50 unités/litre 4-aminoantipyrine 0,01 à 1000 millimoles/litre Tampon tris 10 à 1000 millimoles/litre
Acide 3-(N,N-
diméthylamino) benzo!que 0,1 à 50 millimoles/litre pH 6,2 - 9,5 L'analyse peut être effectuée à une température comprise entre 20 et 45eC, pendant environ 1 à environ 30 minutes, et de préférence 5 à environ 10 minutes, et
en mesurant l'absorbance sur l'étendue de 450 à 650 nm.
Dans ces conditions, la sensibilité de l'analyse est de 0,01 à 0,04 unité d'absorbance par milligramme pour cent, et dans l'exemple spécifique donné, elle était de 0,025
unité d'absorbance par milligramme pour cent.
Exemple II
Analyse du glucose (manuelle) On prépara une solution aqueuse contenant 14,042 unités par litre d'oxydase du glucose, 766 unités par litre
de peroxydase, 0,35 millimole par litre de 4-amino-
antipyrine, 109 millimoles par litre de tampon au phosphate
et 1,0 millimole par litre d'acide 3-(N,N-diméthylamino)-
benzoIque, et ayant un pH de 7. A une portion de 3,5 ml de ce réactif, on ajouta 10 A d'un échantillon contenant
du glucose à 25 C. On mesura l'absorbance à 550 nz immédia-
tement après addition de l'échantillon dans le réactif, et cette absorbance fut de nouveau mesurée au bout de 6 minutes. La concentration en glucose fut calculée par l'équation qui suit:
= AA(MW) (103) (TV)
g (t) (LP) (10) (sv) dans laquelle C: concentration en glucose en mg/dl g6A: changement d'absorbance, ou différence entre l'absorbance au bout de 6 minutes et l'absorbance initiale MWg: poids moléculaire du glucose (180, 16 gdaltons) TV: volume réactionnel total, ml LP: trajet lumineux, cm : coefficient d'extinction' molaire du colorant produit (1,72x1041 mole-1 cm-1)
SV: volume de l'échantillon, ml.
Dans le système employé, l'équation se réduit à Cg = 367,6 aA. La sensibilité de l'analyse était de
0,213 urnités dabsorbance par mg %.
On rép$ta le processus avec 9 échantillons standards differents de glucose. Pour chaque échantillon, on effectua une autre détermination en utilisant "Statzyme Glucose 500", réactif commercialisé contenant du phydroxybenzoate de sodium et de la 4-aminoantipyrine, vendu par Worthington Diagnostics Division de Millipore Corp.; et en mesurant i'absorbance à 500 nm, pour une comparaison. Les résultats des diverses analyses sont résumés comme suit: Concentration mesurée, mg/dl Echantillon A.rt antérieur Présente invention Standard aq.,100mg/dl 101 101 Standard aq.,200 mg/dl 201 205 Standard aq.,400 mg/dl 395 413 Monitrol I 85 88 Validate 85 87 SMA référence 5 215 193 Hyland II 189 190 Monitrol II 203 207 Validate A 237 238 On peut voir à la lecture de ce qui précède que les analyses obtenues en utilisant le réactif selon l'invention sont comparables à celles obtenues en utilisant
le réactif selon l'art antérieur.
Les concentrations du réactif utilisées dans cet
exemple sont optimales pour les produits chimiques utilisés.
Cependant, on peut obtenir des résultats efficaces avec les concentrations qui suivent: Oxydase du glucose e100 unités/litre Peroxydase > 50 unités/litre
4-aminoantipyrine 0,01 à 1000 milli-
moles/litre Tampon au phosphate 10 à 1000 millimoles/ litre
Acide 3-(N,N-diméthylamino)-
benzo!que 0,1 à 50 millimoles/ litre pH 4,0 - 9,5
Les analyses peuvent être effectuées à une tempéra-
ture comprise entre 20 et 45 C, pendant environ 1 à environ 30 minutes, et de préférence 5 à environ 10 minutes, et
en mesurant l'absorbance à 450-650 nm.
Exemple III
Analyse du cholestérol (manuelle) On prépara une solution aqueuse contenant 600 unité par litre d'estérase du cholestérol, 110 unités par litre d'oxydase du cholestérol, 1.400 unités par litre de peroxydase, 0,5 millimole par litre de 4-aminoantipyrine, millimoles par litre de tampon tris, 5,0 millimol6 par litre d'acide 3-(NN-diméthylamino)benzolque, et 0, 2% de Do triton X-100, et ayant un pH de 7,5. A une portion de 3,0 ml de ce réactif, on ajouta 10 À d'un échantillon contenant du cholestérol à 30 C. On mesura l'absorbance à 550 hm immédiatement après l'addition de l'échantillon au
réactif et on la mesura de nouveau au bout de 15 minutes.
La concentrationmE cholestérol fut calculée par l'équation qui suit: sud u 1,u II 'aneTa %ue %1-9 uoles jToe? ai %uugsTiTn ue senuaqo salleo selqsisdmoo luemw[eigug duos uoçue*&u-I 5ú uoies $Topax el %uesTsTn ue sanueqo sesXluue sel enb aToA %nad uo 'apqzod Tnb ao ap aenoal ul y LZI 9Z Io %%ugS aouagjg9 ap mni9S úL 5ú1 TumjLOUB 0qq^10 817 861 Z gleoS Oú 176 101 1 luos ú55 ú17 TIp/Smw 005 ' by paepusi s z0ú 05Z [/Iu /N I 0úby pzepu^si 18 ú6 Ip/Sa ook '*by pvpUv!Qs uoTIugAUT eluesaid inaTiqque 1^wv UO 11%6eqo3 5Z Ip/zu $ apnsom uoTieiluaouo :;Tns aemmoo sgwnsga duo8 seuXlvue seslaaTp sep sel.l.nsai sel -uosTeaudzoo el inod 'nu OO 1V eoueqbosqutl l.ueinsom ue 4d:oo 91o0ClIT op uoTsTATa soT;sougiTa uoeauTljoK jid npuaA ' auTidTueouTme-. s1 ap 4a joug'd oz np Iueueluoo 99TIUOennaoo ZT%Qvpa aloilgaloRD emúZlvlsu jTl-oup el %uesTITn ua UOg^BuTmajp oaqnt>aun lanioaj:ja uo guo1lTIuvqop enbvqo inod aloiqsoloqo ap eluaapjjTp Spluipune suotÉlEIuelqo L oeAu snsisaooid ai l 9epzdo 4Tv9Tnppa es uoTIenbl 'pXoldua aIaqs s el suoa *la 4 uoggluaol: op fanoA6: AS (; lllI al1 I,7x01=Zi)!1Tnpoxd lule01oo np ejTVIom v MOIOUTIxa#,p IMO3TJJ00 a:3 mo 0xneuTan[ Ie ezl: d- 01 m il -l0/n TuuoTloga" bmnIA:pAl ( OUOI ÉBp 9 998ú) goiseloqo np aTvlno0lo b spTod:OAK oaTueTuT aoueqeos n 9'l ua sar.nufa g op qnoq ne aoueqeosqvl UaOuaç eoueapZp no s'aUOeoo oo uequosq wI: Ip/Sa ue onsaelo-q ua uoo e iuaouooT so) llnbol suep
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apToe,p ailTi aed saloaTIOTT 0'g %ueueuoo aeoqtdumoaqo ap uodme. uoTInlos aun (z)!sTa! uodme. Bp al.TI JedsoulmTllTm OOL %e auT:XdTueouTme-V 3p aJITI Jed atow -TTIITa 5ú'0 'asap.xoJad ap aJTI a ed s9.Tun 00Q9L 'BSeoTan,p ç a:l.TI aed s9%un OOZ %ueuauoo samXzuep ATzOu9gJ UOTnlos aun (1): sasnenbe sUOTnlos STOal 9Jed9ad e uo (apspemo.ne) anbTan apToes,l ap as&IeuY AI aIcmax S
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eJTI/SOoTTtTTT QOOOL OL ail.Ti/salomTITml OO V O aJà t/2aiOmTIT1u 0001 V 01 ail-Ti/salomtlTmIT 000u V Ok aizl-T sTjl uoduel uollTueqo, l ap uodJ; enblozuaq ( ouTue -Xlq%.mTp-N'N)- aepoy eaoiaomoqot op uome&j sal. uoduMzj, /sealmiETlT 000 I O' eUTJXdT%.UouTau-7 aTl/s.Tun oe agsep/xoadl eJ;TT/a9pTun ObI/s<Ta semAzuap,T%1B0gu : %uaTns Tnb suoTITsodwoo sae %uexe s;$ToIp sap %ueoldume ua 9sT.emozne snssoooid ao oaAe snuaeqo aa4g uaanad saooTj;a s iqensg sea laenuem snssaooid un suBp uoTuaaUT&I uoles 1$Toe9J eT SuesrIlin u3 snueqo xnaeo oAB aTqeuuoslea aouapxoouoo ua %uos esTequone snssaoood un suSp uoT.uaaUTr uotas Toa el oaiAe snue:qo s1elTnsp sel '1ieiug ua gL 6' y eV ePTItA 6 '9 Z6 II lol.TUO ç'2 úoJ44e4gS eoueaxj9. op ïMugs g'99'9 ú SOuS.199J VMS 919 eoueapjg VNg
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o î J1:.11TUON ZsL A1z'L' Ip/2w ZM''bV paepueS O'L Z'9 lP/fm 9 ''by paepue% z'z Ogz tp/Sw Z *bv papueS 9sT Io1.ny( I eafuimsx>) uoIITueqoa allanufe enbTan apToe,p UoT4ea;ueouoo : eIanuem snssaooad ael %uoldma ua I aIdmeaxgi e uoTuteAuaT auasiJd ml oaAu snuaqo seinspa sae enb TsuTe 'snossap-To spmnsgaJ uos se;lnsga sel * enbTn apToe,p anuuoo uolIeuaouoo aun oaae aSeaqTleo ap paepues 6ZL9iZZ U Le processus peut être effectué à une température de 20 à 45 C, un pH de 6,2 à 9,5 et une durée de la réaction de 1 à 30 minutes, en mesurant l'absorbance à 450-650 nm, à une sensibilité de 0,01 à 0,4 unité d'absorbance par milligramme pour cent. Comme cela est évident à la lecture des exemples qui précèdent, de faibles quantités d'agents tensioactifs
peuvent employées. Les agents tensioactifs sont particuliè-
rement souhaitables pour accomplir des analyses automatisées
comme cela est illustré par l'Exemple IV.
Bien entendu,l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le
cadre de la protection comme revendiquée.

Claims (27)

REVENDICATIONS R. E V E N D I C A T I O N S
1.- Procédé de production d'un colorant caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact, dans un milieu aqueux contenant du peroxyde d'hydrogène, (1) de la peroxydase, (2) un acide aminoaromatique représenté par la formule: X w ZH o X est un groupe mono- ou diaclcoylamino,. et ZH est le
groupe carboxyle ou le groupe sulfo, et (3) une 4-amino-
antipyrine représentée par la formule:
R2
yR Y c çN.> R o chacun-de R et R, pris séparément, est un alcoyle, R2 est un fragment aromatique, chacun de R3 et R4, pris séparément)peut être de l'hydrogène ou un alcoyle, et Y
est de l'oxygène ou du soufre.
2.- Procédé pour détecter la présence de peroxyde d'hydrogène dans un milieu aqueux caractérisé en ce qu'il consiste à:(a) ajouter audit milieu aqueux (1) de la peroxydase,(2) un acide aminoaromatique représenté par la formule:
X
X ZH o X est un groupe mono- ou dialcoylamino, et ZH est le groupe carboxyle ou le groupe sulfo, et (3) une 9STsoeJWo 'j, UOTIeOTpUOAaJ e1 Uolas9 9P0ood -*01 * 1: 5Z uo-TAu9 1: 1. 'O ep eip.ol ap.se aeTOjd euT JdTueouTmel q %Topid enbT.emooeouTme ePTOeI ap eaTelOm,oddei al anb ao ua PSTigJ0voe ' UOTaoTpuOeaJ VI uolas pooJad -"6 eapTC m np sa e a ú ap unoeqo 'aqTogad auTjadTueouTmel suep enb eo ua 0i 99TJ DeUJeoD ' 9 UOeoTpUaGaJ e1 Uolas 9ppooJd -'9 **u2q>jpRlt op;Sa s 0 ú op unoeqo 'eT Topd aEsp enb o ua Ps gT oeeo 9 UOT%.oTPU i sT uoeois ppgooad -L *sanblozuasq ( OU6Wt.qE9UTP-N') -ç z OpTouiT ep use 9%Topid anblozuaqouTme gPTonl eb ao ue 9STaJ.o1jeo ' UOTUOTpUeAo@ el uolas P o od -9 eT*%a.np unoeqo juos LM %H 'e aTopaod euTJdTiueouTeal suep enb 0o ua 9Tpoeeo '1l UOTaeOTPUAeae UT uOles pp9ooi --g oz euQ2qxxo. 9p!S L %a eTxix9tqI np 1e0 z e0%TOid euTaJdlTUeOUTmeTI suvp enb eo ue a nTozuaqoueTme ePTOU un:se 91.Togd enbTemoaeouTmu aOPoT l snb ao ue 99Tl. %o9eeo 'ç uoT%.OTpueAaa el uolas gpgooad -.t 46 UOJTAUSe ç op eapaosI 9L
ep Hd un ea zeS17 uoio UOTAU B Coe 0axpao1à tp ae9dwal.
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2-476129
en ce que le rapport molaire de l'acide aminoaromatique précité à l'aminoantipyrine précitée est compris entre
environ 8:1 et environ 12:1.
11.- Composé caractérisé en ce qu'il comprend un complexe de transfert de charge de (1) un radical libre
de l'acide aminoaromatique représenté par la formule: -.
xs G z oh X' est un groupe mono- ou dialcoylimino et Z est le résidu formé par enlèvement d'hydrogène d'un groupe carboxyle ou sulfo; et (2) un radical libre d'une 4-aminoantipyrine représentée par la formule: y
N
R
R3R4HN R
o chacun de R et R1, pris séparément, est un alcoyle, chacun de R3 et R4, pris séparément, est de l'hydrogène
ou un alcoyle et Y est de lbxygène ou du soufre.
12.- Composé selon la revendication 11, caractérisé en ce que Y est de l'oxygène et Z est le résidu d'un
groupe carboxyle.
13.- Composé selon la revendication en ce que X' est un groupe dialcoylimino et
et R1 est du méthyle.
14.- Composé selon la revendication en ce que X' est un diméthylamino et chacun
est de l'hydrogène.
15.- Composé selon la revendication en ce que X' est un diméthylimino et chacun
est du méthyle.
12, caractérisé chacun de R 13, caractérisé de R3 et R4 13 caractérisé de R3 et R4 16.- Composé caractérisé en ce qu'il est formé
par le procédé selon la revendication 1.
17.- Composé selon la revendication 16, caractérisé en ce que Y est de l'oxygène, R2 est du phényle et Z est le résidu d'un groupe carboxyle. 18. - Composé selon la revendication 17, caractérisé en ce que Y est un groupe dialcoylamino et chacun de R
et R1 est du méthyle.
19.- Composé selon la revendication 18, caractérisé en ce que X est un diméthylamino et chacun de R3 et R4
est de l'hydrogène.
20.- Composé selon la revendication 18, caractérisé en ce que X est un diméthylamino et chacun de R3 et R4
est du méthyle.
21.- Procédé pour la détermination enzymatique de la quantité d'un composant dans un fluide corporel en mélangeant ledit fluide avec (a) un enzyme pouvant favoriser l'oxydation dudit composant et former du peroxyde d'hydrogène, (b) de la peroxydase,et (c) un chromogbne pouvant être oxydé par réaction catalysée par la peroxydase avec du peroxyde d'hydrogène pour former un chromophore, et en mesurant le changement de couleur résultant, caractérisé en ce que ledit chromogène est un mélange de (1) un acide aminoaromatique représenté par la formule:
X
&Z ZH
o X est un groupe mono- ou dialcoylamino et ZH est le groupe carbonyle ou sulfo et (2) une 4-aminoantipyrine représentée par la formule: R2 ! I
R3R4N R
R34 R
np UOTepLxop JatesTJoAus, q.ueA0nod aezue$T enb ao ua 9STJoewoe 'z nUOTeoTpueAa. elt uoles 9p90oozd -. k eseoT.nil - se 9,o9.Tzd, uesodmoo gS np uoT.epi co,-,esTOzo.xej: q m6nod eazzue1,[ enb eo ue 9STfioujzuo 'Lz UOTI:eOlpueaea el uoles 9p9oozcd -'0 1*:Zl, UO.ITAUa.a,:8 uo.TAUn ajue STdmOo 1.se eg.ogd auTadTusouTemil n qTouzd enbTemoiuouTms epTou,l ap eaTelom q;oddu et enb eao ue Oç 9sT'z9B uz UOJ pUA '9e el uoles gP9OO. d -'6Z 1:5Z uOTAU..e Ia 1:vo uOT.ue ae.q ue Tidwmoo.se q Teo9zd euT,,ZdT. ou*paeuT 9q.TO9,id enbT:l.vuoeoTeu epToel ep eaZTelom %.odduz el enb ao ue 9ST.J9geao '8z uoTeoTPUgAeJt uoltes 9P9oo.Z -'9z cz * 'eTqlm np *qse 1 e úH ep unou[o 'eaio.T d ea:euTdTTuoTwuT snmp enb eo ue 99TJP9.O-zeO ' Z UOTfuOTpuneez 't uoteg 9P9ppOJd -'LZ enuq2oapqtl ep.se / %e 1 ep Rnoerqo 'eaq.To.Zd auTCiXdTInUeoUTet suep enb ao ue oz PsTi,9oeieo 'çZ UOTeoTpueaea el uoles 9P9ooZlad -'9z eanb;ozueq ( ouTsetLql.ETp-M ' II)) ePTOeit ep 1.se 9q.TopJd enbozueqouTmu epTout enb eo ue 9sTZ?%oe.eo '1Z uOTTpupeAe.z 't1 uotes PPPoO*d -'5Z eTxLq.u np *.sa 1 5 ea e p unmoqo ':e9:TOgid euT;.ZldTuouTmalt suvp enb ao ue TaZ.fou.zuo'lç UoTeOTpueAe.z 't uoltes gpooad -'1s ÀeuqaCsxol ep;se. X e eTLu9l[d np %se Z1 l'epTop.id aunTadTnIuoouTeal suep eanb eo ue %e enblozuaqouTue apToel ep 1.sa,aTo.zd enbTIeuoavoUTnu epToe,l enb ao ue o0 STig.oejeo zz uoTeoTpueAe 'elt uotes 9pp9oo, -' Z *'6 uoiTAue ú ep e.1Po.t ep Hd un ? DO GS uoiTune 1e oz uoOTnue e.:.ue esTzdwoo ear4le9dme; eun ê seTdeilue jse TiTnb eo ue 9STa9%.oexeo ' I UOTeOTPUopee. Ut otes 9p9 poo.cT -'ZZ
eaznos inp no eau xco T ep 1.se.
e eaTootle unm no eu!ojpXq,L T p aie %ned 'qunepzaud9s sT.xd ' si1%e 1. ep moaqou 'ernbT^lemoze %ueage2z, n use 1 1 etaXoolte mun e.za ned ':. uema9udps sTad ' 1 e: ep munoeqo o 62L9ZtZ
composant précité est l'oxydase du glucose.
32.- Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'enzyme pouvant favoriser l'oxydation du composet
précité est l'oxydase du cholestérol.
33.- Système réactif pour détecter la présence de peroxyde d'hydrogène dans un milieu aqueux caractérisé en ce qu'il comprend: (1) de la peroxydase, (2) un acide aminoaromatique représenté par la formule: X ZH ô X est an groupe morn- ou dialcoyamino et ZH est le
groupe carboxyle ou le groupe sulfo, et (3) une 4-amino-
antipyrine représentée par la formule: R2
I 2
2 0 Y-- 'n 'E
20. R3R4N....-R
o chacun de R et R1, pris séparément, est un alcoyle, R est un fragment aromatique, chacun de R3 et R4, pris séparément, est de l'hydrogène ou un alcoyle et Y est de
l'oxygène ou du soufre.
34.- Système selon la revendication 33, caractérisé en ce que le rapport molaire de l'acide aminoaromatique précité à l'aminoantipyrine précitée est compris entre
environ 0,1:1 et eniron 25:1.
35.- Système selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'il contient de plus un tampon pour tamponner une solution aqueuse de la peroxydase, de l'acide aminoaromatiqoe et de l'aminoantipyrine précités à un pH compris entre
environ 3 et environ 9,5.
36.- Système selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il contient de plus un enzyme pouvant supporter l'oxydation d'un composant d'un fluide corporel pour former 3p
du peroxyde d'hydrogène.
37.- Système selon la revendication 36, caractérisé en ce que l'enzyme peut supporter l'oxydation de l'acide urique, du cholestérol ou du glucose pour former du e
peroxyde d'hydrogène.
38.- Système selon la revendication 36, caractérisé en ce que ZH est un carboxyle, R2 est du phényle et Y est
de 1 l'oxygène.
39.- Système selon la revendication 38, caractérisé.
en ce que X est un aminoalcoyle, R est du méthyle et R!
est du méthyle.
40.- Système selon la revendication 39,.caractérisé en ce que X est un diméthylamino et R3 et R4 représentent
chacun de l'hydrogène.
41.- Système selon la revendication 40, caractérisé en ce que X est un diméthylamino e R3 et R4 représentent
chacun du méthyle.
42.- Système selon la revendication 40, caractérisé en ce que le rapport molaire de l'acide aminoaromatique précité à l'aminoantipyrine précitée est compris entre
environ 8:1 et environ 12:1.
43.- Système selon la revendication 42, caractérisé en ce que l'enzyme pouvant supporter l'oxydation précité
est de l'uricase.
44.- Système selon la revendication 42, caractérisé en ce que l'enzyme pouvant supporter l'oxydation précité
est de l'oxydase du glucose.
45.- Système selon la revendication 42, caractérisé ence que l'enzyme pouvant supporter l'oxydation précité
-est de l'oxydase du cholestérol.
46.- Système selon la revendication 33, caractérisé
en ce qu'il est sous forme d'un ensemble.
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