CZ287334B6

CZ287334B6 - Homocysteine analysis method

Info

Publication number: CZ287334B6
Application number: CZ19941763A
Authority: CZ
Inventors: Erling Sundrehagen
Original assignee: Axis Biochemicals As
Priority date: 1992-01-22
Filing date: 1993-01-22
Publication date: 2000-10-11
Also published as: ES2094524T3; EP0726322B2; RU2121001C1; ATE142271T1; JP2870704B2; FI943462A; CA2128512A1; CZ176394A3; ATE237696T1; NO314946B1; DE69304511D1; FI106728B; EP0623174B1; EP0726322A1; DE69332891D1; DK0726322T4; EP0623174A1; GR3021365T3; SK281517B6; HU9402170D0

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu analýzy homocysteinu v klinických vzorcích.

Dosavadní stav techniky

Homocystein je aminokyselinou, vznikající jako meziprodukt při metabolizování methioninu na cystein. Obecně je homocystein, vznikající v těle, rychle metabolizován jednou ze dvou možných cest, (1) kondenzací se serinem za vzniku cystathionu anebo (2) přeměnou na methionin, a jeho koncentrace (a koncentrace jeho oxidové formy homocysteinu) je v živém organismu za normálních podmínek skutečně zanedbatelná.

Hladiny homocysteinu v biologických vzorcích však mohou být klinicky významné v mnoha situacích, neboť homocystein má významnou úlohu ve složité soustavě metabolických drah, které zajišťují metabolismus sulfhydrylových aminokyselin; jeho nahromadění pak může být známkou různých poruch, postihujících tyto metabolické dráhy, včetně zejména vrozených poruch metabolismu. Například homocysteinurie (abnormální zvýšení množství homocysteinu v moči) je známou poruchou metabolismu aminokyselin, zapříčiněnou deficiencí enzymů cyatathion-βsynthetasy nebo methyltransferasy kyseliny methyltetrahydrolistové (která katalýzuje methylaci homocysteinu na methionin).

Metabolismus sulfhydrylových aminokyselin je těsně spojen s metabolismem kyseliny listové a vitaminu B_l2 (kobalaminu), které se uplatňují jako substráty nebo kofaktory různých přeměn sulfhydrylových aminokyselin. Z tohoto důvodu bylo hromadění homocysteinu navrženo jako indikátor špatné funkce enzymů, závislých na kobalaminu či kyselině listové, nebo poruch či onemocnění, které se týkají metabolismu kobalaminu anebo kyseliny listové.

Kromě toho, vzhledem ke skutečnosti, že k přeměně homocysteinu na methionin dochází v reakci, využívající jako donor methylové skupiny kyselinu S-methyltetrahydrolistovou, může být metabolismus homocysteinu ovlivňován také léky, které působí proti kyselině listové, jako je methotrexát, a které se podávají v boji proti jiným nemocem, zejména rakovině. Podle návrhu je proto monitorování homocysteinu rovněž využitelné při řízení léčby maligních onemocnění pomocí látek, působících proti kyselině listové.

Mnohem později byly zvýšené hladiny homocysteinu v krvi dány do vzájemné souvislosti s vývojem arteriosklerózy (viz Clarke se spoluautory, New Engl. J. Med. 324, 1149-1155, 1991) a nyní je i mírná homocysteinemie považována u srdečních a cévních onemocnění za rizikový faktor. Sledování hladiny homocysteinu v plazmě či v krvi je tedy důležité pro diagnosu a léčení cévních chorob.

Ačkoli imunologické metody přímého stanovení homocysteinu nejsou dostupné, neboť nejsou k dispozici protilátky vůči homocysteinu, bylo navrženo mnoho jiných metod pro jeho stanovení v klinických vzorcích. Všechny tyto metody vyžadují chromatografické dělení a obecně jsou založeny na jednom ze tří následujících principů:

(1) klasická chromatografická analýza aminokyselin (2) reakce homocysteinu, obsaženého ve vzorku, s enzymem S-adenosyl-L-homocysteinhydrolázou za přítomnosti radioaktivně nebo jinak značeného S-adenosinu jako kosubstrátu, následovaná oddělením a kvantifikací vzniklého produktu (S-adenosyl-L-homocysteinu, SÁH). Obecně se používá chromatografického dělení (HPLC nebo TLC) a měření radioaktivity (viz

-1 CZ 287334 B6

Refsum se spol., Clin. Chem. 31. 624-628, 1985; Kredich se spol., Anal. Biochem. 116, 503510, 1981; Chui, Am. J. Clin. Path. 90(4). 446-449, 1988; Totani se spol., Biochem. Soc. 14(6). 1172-1179, 1988; a Schimizu se spol., Biotechnol. Appl. Biochem. 8, 153-159, 1986. Stanovení SAH je popsáno v Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer et al. (ed.), 3. vydání, díl VII, str. 403-409, VCH Weinheim, 1985.

(3) reakce homocysteinu, obsaženého ve vzorku, s fluoroforem, následovaná oddělením pomocí HPLC a fluorometrií (viz Refsum se spol., Clin. Chem. 35(9), 1921-1927,1989.

Tyto metody jsou časově náročné a těžkopádné a všechny jsou založeny na přímé kvantifikaci. Přesněji je společným rysem těchto metod chromatografické oddělení a vyžaduje velmi specializované a náročné vybavení.

Používání takového vybavení není obecně dobře přijímáno v rutinní klinické laboratorní praxi a takové procesy proto nelze automatizovat v typické klinické laboratorní postupy.

Je zřejmé, že existuje potřeba zlepšeného, zejména jednoduchého, specifického a rychlého způsobu analýzy homocysteinu, který by byl přizpůsobitelný pro klinické laboratoře a především se obešel bez nákladné a náročné chromatografie. Vynález si klade za úkol takový postup navrhnout.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob analýzy homocysteinu ze vzorku, při němž se vzorek uvádí do styku s enzymem S-adenosylhomocysteinhydrolázou a s alespoň jednou z látek S-adenosylhomocystein a adenosin, přičemž postup se provádí bez chromatografického oddělení neznačené látky ze skupiny adenosin a S-adenosylhomocystein.

Ve výhodném provedení se vzorek přivádí do styku s monoklonální protilátkou zmíněné analyzované látky a s furanoso-6-thioetherovým haptenem této protilátky, odlišným od uvedené neznačené analyzované látky a stanovení této analyzované látky se provádí nepřímo stanovením uvedeného haptenu, navázaného nebo nenavázaného na uvedenou protilátku.

Součást podstaty vynálezu tvoří také analytická sada přípravků pro použití k analýze homocysteinu ve vzorku svrchu uvedeným způsobem.

Enzymem, přeměňujícím homocystein, použitým ve způsobu analýzy podle vynálezu, je s výhodou zvláště SAH-hydroláza, ale mohou být využity i jiné enzymy. Zmínit lze například betain-homocysteinmethyltransferasu a jiné enzymy, účastnící se přeměny homocysteinu (popsané například Grahamem v Trends Cardiovasc. Med. 1, 244-249,1991.

Kosubstrátem homocysteinu, stanovovaným v postupu podle vynálezu, je sloučenina, která s homocysteinem reaguje v enzymem (například SAH-hydrolázou) katalyzované reakci, přeměňující homocystein.

Výrazem „stanovení“, jak je zde užíván, je míněno jak kvantitativní, tak i kvalitativní zjištění ve smyslu získání absolutní hodnoty, týkající se množství nebo koncentrace analyzované látky, například kosubstrátu homocysteinu, přítomné ve vzorku, a rovněž získání indexu, poměru, procentní, vizuální nebo jiné hodnoty, vyjadřující hladinu analyzované látky ve vzorku. Stanovení může být přímé nebo nepřímé a skutečně měřené chemické látky nemusí samozřejmě být analytickým činidlem samy o sobě, ale mohou být například jeho derivátem nebo nějakou další látkou, jak je uvedeno dále.

-2CZ 287334 B6

Způsob analýzy podle vynálezu s výhodou používá pro určení analyzované látky enzymových nebo imunologických metod. V enzymové metodě, které se dává přednost, se analyzovaná látka dostává do styku s dalším enzymem, jehož je substrátem, a stanovuje se buď kosubstrát, nebo přímý či nepřímý reakční produkt enzymové přeměny analyzované látky účinkem tohoto dalšího enzymu. V imunologické metodě, které se dává přednost, se analyzovaná látka stanovuje postupem, při kterém analyzovaná látka kompetitivně váže protilátku a další hapten (např. polyhapten nebo značený analog analyzované látky) a stanovuje se vázaný nebo nenavázaný hapten.

Enzymem, přeměňujícím homocystein, jemuž se dává přednost a používaným podle vynálezu, je S-adenosylhomocysteinhydroláza (SAH-hydroláza), katalyzující reakci homocysteinu:

adenosin + homocystein S-adenosyl-homocystein (SAH) v reakci s rovnovážnou konstantou K = 10⁶. NT¹.

Reakce může probíhat, v závislosti na reakčních podmínkách, koncentraci reagujících činidel apod., oběma směry.

V uvedeném schématu je adenosin kosubstrátem homocysteinu. Jiné kosubstráty, jako analogy adenosinu nebo příbuzné sloučeniny, mohou být rovněž použity v analytické metodě podle vynálezu.

Zvláštní výhodou způsobu analýzy podle vynálezu může být skutečnost, že homocystein působí jako inhibitor SAH-hydrolázy tlumením hydrolytické reakce, ve které vzniká homocystein a adenosin, a posunuje tak rovnovážný stav reakce v prospěch syntézy SAH.

Množství homocysteinu ve vzorku tedy nepřímo ovlivňuje tvorbu nebo spotřebu kosubstrátu homocysteinu, například adenosinu, v reakci SAH-hydrolázy a tím i jeho výslednou koncentraci v reakční směsi. V tomto vynálezu může být výsledná koncentrace, nebo změna koncentrace homocysteinového kosubstrátu v reakční směsi, např. adenosinu, využita jako indikátor počáteční koncentrace homocysteinu ve vzorku. V takovém případě, kdy je analyzovanou látkou kosubstrát, se způsob analýzy podle vynálezu od dřívějších metod liší tím, že homocystein je spíše než přímým způsobem stanovován nepřímo, měřením koncentrace svého kosubstrátu při enzymově katalyzované přeměně. Výhodou tohoto způsobuje, že detekční metody, které vyhovují typickým klinickým laboratorním postupům, ale nebyly vhodné pro dříve užívané způsoby analýzy homocysteinu, např. fotometrické metody, mohou být nyní využity, čímž se způsob analýzy podle vynálezu stává zvláště vhodným pro rutinní klinické použití.

V analytické metodě podle vynálezu, které se dává přednost, může být reakce SAH-hydrolázy použita v obou směrech. Jestliže se tedy testovaný vzorek dostane do styku s adenosinem a SAHhydrolázou, množství spotřebovaného adenosinu odpovídá množství spotřebovaného homocysteinu a původní množství homocysteinu ve vzorku tak může být stanoveno z rozdílu v koncentraci adenosinu. Namísto samotného adenosinu mohou být použity jeho analogy a/nebo sloučeniny, vytvářející adenosin.

V jiném provedení podle vynálezu, jemuž se dává přednost, může být použit opačný směr reakce. K testovanému vzorku může být přidán SAH (obvykle v přebytku) a SAH-hydroláza. Homocystein a adenosin potom vznikají hydrolýzou SAH. Jakýkoli homocystein, přítomný v testovaném vzorku, bude negativně ovlivňovat samotnou reakci a inhibovat tvorbu adenosinu, jehož množství je sledováno.

Substráty SAH-hydrolázy, použité v postupu podle vynálezu, mohou být tedy SAH nebo adenosin či jeho analogy a prekurzory.

-3CZ 287334 B6

Ve složité soustavě metabolických drah sulfhydrylových aminokyselin a transmethylačních reakcí v organismu je zapojeno mnoho enzymů. Tyto dráhy a reakce byly podrobně studovány a byla zjišťována regulační úloha zúčastněných enzymů. Úloha jednoho z těchto enzymů, SAHhydrolázy, je diskutována Uelandem v přehledném článku v Pharmacological Reviews 34, 223253, 1982. Trewyn se spoluautory popisuje vBiochem. Biophys. Met. 4, 299-307, 1981, zkoumání regulační role SAH-hydrolázy a poskytuje způsob analýzy enzymové aktivity tohoto enzymu. Garras se spoluautory popisuje v Anal. Biochem. 199, 112-118, 1991, jinou reakční dráhu homocysteinu a zejména stanoví způsob analýzy přeměny homocysteinu, zprostředkované methioninsynthasou. Jak bylo uvedeno dříve, Graham (ad str. 4) popisuje další enzymově zprostředkované přeměny homocysteinu. Kosubstráty a produkty přeměny různých těchto reakcí mohou být použity jako analyzované látky ve způsobu analýzy podle vynálezu, zvláště v případě využití imunologických prostředků stanovení.

Klinické vzorky, v nichž se provádí stanovení podle vynálezu, mohou vycházet z kterékoli biologické tekutiny nebo tkáňového extraktu a mohou být před analýzou upravovány. Obecně se však užívají vzorky moči nebo plazmy.

V plazmě nebo moči může být významná část přítomného homocysteinu vázána disulfidickým můstkem na cirkulující bílkoviny, jako je albumin, a homocystein může být přítomen také ve formě jiných disulfidových derivátů (obvykle konjugátů homocystein-cystein). Pro odhad celkového množství homocysteinu, přítomného ve vzorku, může být žádoucí ovlivnění vzorku redukčním činidlem, čímž dojde k rozštěpení disulfidových vazeb a uvolnění volného homocysteinu.

Disulfidy lze snadno a specificky redukovat pomocí thiolů (například dithiothreitolu, DTT, dithioerythritolu, DTE, 2-merkaptoethanolu, cysteinthioglykolátu, thioglykolové kyseliny, glutathionu a podobných sloučenin). Přímé chemické redukce může být dosaženo použitím borohydridů (například borohydridu sodného) nebo amalgámů (např. amalgámu sodného), případně specializovanějších reagencií jako jsou fosfiny, nebo lze použít fosforothioáty. Redukci disulfidů shrnuje Jocelyn vMethods of Enzymology 143, 243-256, 1987, kde uvádí širokou škálu vhodných redukčních činidel.

Adenosin či jiné kosubstráty homocysteinu mohou být stanoveny známými metodami. Metody obecně spočívají ve fotometrické (například kolorimetrické, spektrofotometrické či fluorometrické) detekci a přednost se dává imunologickým metodám, které mohou být zvláště snadno upraveny k užití v klinických laboratořích. Zvláštní přednost se dává metodám, využívajícím enzymovou reakci nebo reakci smono- či polyklonálními protilátkami, neboť jsou jednoduché a rychlé a jejich provedení může být relativně méně finančně nákladné. Tak například lze analyzovanou látku stanovit monitorováním její reakce s enzymem, který ji přímo nebo nepřímo přeměňuje na produkty, které mohou být detegovány fotometricky, například spektrofotometricky. Mezi vhodné enzymy, které by samozřejmě neměly reagovat s jinými substráty enzymu, přeměňujícího homocystein, zvláště se samotným homocysteinem, patří adenosindeaminasa (přeměňující adenosin na inosin) a adenosinkinasa (která převádí adenosin a ATP na ADP a fosforylovaný adenosin). Takové enzymy mohou být následně spojeny s dalšími enzymy, které vzniklé produkty přemění na další, detegovatelné produkty.

K příkladům imunologických metod patří metody, zakládající se na reakci analyzované látky s jejími specifickými protilátkami, které je možno stanovit buď samotné, anebo mohou dále reagovat za vzniku detegovatelných produktů, například v „sendvičovém stanovení“. Jedna zvláště přitažlivá imunologická metoda zahrnuje použití fluoroforem značeného analogu analyzované látky, nejlépe kosubstrátu, například fluoresceinem značeného adenosinu, který se může spolu s neznačenou analyzovanou látkou dostat do kontaktu s protilátkou analyzované látky. Pokud je výsledný produkt podroben analýze polarizace fluorescence za použití polarizovaného excitačního záření, může být určení koncentrace neznačené analyzované látky odvozeno ze stupně depolarizace fluorescenčního záření. Protilátky vůči adenosinu jsou komerčně dostup

-4CZ 287334 B6 né, (například od firem Paessel & Lorei GmbH, Frankfurt, SRN a Serotech Ltd., Oxford, Velká Británie) a postupy imunoanalýzy polarizace fluorescence (FPIA) jsou dobře zavedené (viz například US-A-4420568 a US-A-4593089 a jiné publikace Abbott Laboratories, týkající se jejich techniky TDx).

Příklady detekčních schémat, použitých ve způsobu analýzy podle vynálezu tedy zahrnují:

protilátka (1) adenosin + adenosin, značený fluoresceinem detekce FPIA (2) adenosin

---------------> inosin + NH₃adenosindeaminasa (3) adenosin * inosin

hypoxanthin xanthin adenosindeaminasa purinnukleosidfosforylasa xanthinoxidasa

* kyselina močová xanthinoxidasa adenos inkinasa (4) adenosin + ATP ---------------► adenosin-5'-P + ADP spolu s kompetující chemiluminiscentní reakcí ATP, např. luciferasa

ATP + luciferin + O₂ -----------► oxyluciferin + PPj_ + AMP + CO₂ + světlo anebo s fluoroforem značeným adenosinem, který kompetuje o ATP/adenosinkinasu, kde se stanovení provádí měřením fluorescenční polarizace.

Stanovení pro adenosina a ATP jsou uvedena v Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer et al. (ed.), 3. vydání, díl VII, str. 110-117 a 357-364, VCH Weinheim, 1985.

Jak je zřejmé ze schémat (2) a (3), inosin a kyselina močová mají zřetelné schopnosti UV absorpce a mohou tedy být sledovány spektrofotometricky, na základě kinetických měření.

Použití detekce kyseliny močové nebo inosinu v UV světle však podléhá jistým omezením, která snižují citlivost metody a rovněž nezbytný je zdroj UV světla a zásobník vzorků, propouštějící UV záření. Může tedy být výhodnější používat kolorimetrickou detekci nebo elektronické

-5CZ 287334 B6 senzory, a takové metody, zvláště kolorimetrie, jsou obvykle v klinických laboratořích upřednostňovány.

V této souvislosti je zvláště užitečná reakce podle schématu číslo (2), ve které amoniak, vznikající za katalýzy adenosindeaminasy, může být snadno detegován známými kolorimetrickými technikami. Ve vzorku vzniklý amoniak tak může například dále reagovat za vzniku zbarvených produktů, jejichž tvorbu je možné sledovat spektrofotometricky. Jedna z těchto metod, popsaná vMethods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer), sv. 1, 1049-1056, 1970, je založena na reakci amoniaku s fenolem v přítomnosti chlornanu v alkalickém prostředí za vzniku barevného indofenolu:

Na₂[ Fe(CN)gNO]

Jako katalyzátor může být použit nitroprussid sodný. Uplatnit se mohou také modifikace této metody, využívající například různé deriváty fenolu.

Zbarvený konečný produkt vzniká v množství přímo úměrném koncentraci amoniaku, a tím i adenosinu, ve vzorku.

Reakce, katalyzovaná xanthinoxidasou podle schématu (3), je vhodná k detekci, využívající fluorogenů nebo chromogenů, například redoxních indikátorů, stanovení oxidačně redukčního potenciálu, nebo měření spotřeby O₂, či přesněji tvorby peroxidu vodíku H₂O₂, například pomocí elektronických senzorů. K tomuto účelu může být použito množství redoxních indikátorů a v literatuře, vztahující se ke stanovení H₂O₂ a O₂ v roztoku, je popsán široký výběr metod. H₂O₂je v klinických analýzách detegován skutečně velmi často.

Mezi vhodné redoxní indikátory patří methylenová modř, 2,6-dichlorfenol, indofenol a různé redoxní indikátory, uvedené v tabulce 1 katalogu č. 53, Kodak Laboratory & Research Products, i když samozřejmě lze použít i jiné. K usnadnění průběhu redoxních reakcí mohou být přidány enzymy s peroxidázovou aktivitou, například peroxidáza z křenu.

MTT tetrazolium v kombinaci s xanthinoxidasou nebo jinými podobnými enzymy může být použito v případě, že je žádoucí přítomnost precipitujícího chromogenů. Použitím takového chromogenů nebo fluorogenu lze získat odečet mobilizovaného zbarvení nebo fluorescence, umožňující visuální zjištění koncentrace homocysteinu.

Ve schématu (4) je ke stanovení koncentrace adenosinu použita chemiluminiscentní reakce ATP. Způsoby analýzy, založené na chemiluminiscenci, mají značný potenciál, daný nízkými dosažitelnými detekčními limity a relativní jednoduchostí nezbytného vybavení. Chemiluminiscentní reakce mohou být použity k detekci analyzovaných látek jako je ATP nebo H₂O₂ a jednou z nej účinnějších a nejlépe známých takových reakcí je bioluminiscentní reakce u světlušek luciferasa

ATP + luciferin + O₂ - — .......> oxyluciferin + PP£ + AMP + CO₂ + světlo

Luciferin světlušek má benzothiazolovou strukturu, ale dostupné jsou i luciferiny zjiných biologických zdrojů, které mají struktury odlišné. Pro analytické účely mohou být za použití této reakce ATP, luciferin nebo luciferasa přímo stanovovány. Jinou chemiluminiscentní reakcí,

-6CZ 287334 B6 kterou lze použít pokud vzniká H2O2, jako například ve schématu číslo (3), je reakce luminolu, tj. 5-amino-2,3-dihydroftalazin-l,4-dionu, s katalyzátorem hydrogenperoxidázy, poskytující emisi světla při 425 nm.

Peroxid vodíku, vzniklý například podle schématu (3), může být rovněž stanoven použitím neenzymových chemiluminiscentních reakcí peroxioxalátu a akridinových esterů, v případě esterů ve vodném roztoku při neutrálním pH.

Použití fluoroforem značeného adenosinu ve schématu (4) a stanovení měřením polarizace fluoresce je proveditelné díky poměrně široké substrátové specifitě adenosinkinasy. Tato široká specifita může být nadto využita ke kompenzaci endogenního adenosinu (nebo jiných nukleosidových substrátů adenosinkinasy) přidáním adenosinkinasy nejlépe spolu s redukčním činidlem (např. DTT) do vzorku a jeho preinkubací.

Taková enzymová preinkubace vzorku je žádoucí, pokud je, jako v mnoha provedeních podle vynálezu, analyzovaná látka (např. adenosin) již ve vzorku přítomna v různém množství a poskytuje tak možný zdroj chyby prováděné analýzy. Obsah analyzované látky, tvořící hodnotu pozadí, může být kompensován provedením analýzy v části vzorku bez přítomnosti enzymu, přeměňujícího homocystein (např. SAH-hydrolázy); takový postup je ovšem časově náročný a analýza se stává těžkopádnější. Jinou možností je preinkubace vzorku s činidlem, sloužícím k přeměně nebo odstranění endogenní analyzované látky, například s enzymem jako je adenosinkinasa nebo adenosindeaminasa, které odstraňují adenosin, tvořící pozadí. Jak již bylo zmíněno, k zabránění časového prodloužení průběhu analýzy může být taková preinkubace výhodně uskutečněna v době preinkubace s redukčním činidlem, uvolňujícím homocystein.

Kromě použití spektrofotometrických nebo kolorimetrických metod pro stanovení analyzované látky mohou být použity i jiné fotometrické metody. Mezi nejužitečnější patří aglutinace částic a imunoprecipitační metody. V případě použití polyklonálních protilátek může být využita přímá aglutinace částic anebo přímá imunoprecipitace, ačkoli takovému postupu se obvykle nedává přednost, pokud je jako enzym, přeměňující homocystein, aplikována SAH-hydroláza. Použity však mohou být metody, využívající inhibici precipitace nebo inhibici aglutinace částic. Ty spočívají v použití protilátky spolu s haptenem, jejichž konjugace vede ke srážení (precipitaci) shluku částic, jenž může být detegováno turbidimetrickým nebo nefelometrickým měřením. Pokud je vznik komplexu protilátky a haptenu inhibován analyzovanou látkou, například SAH, může být obsah této látky stanoven na základě redukování precipitace a/nebo agregace. Reakci lze znázornit následovně:

protilátka + hapten —... ·-► tvorba komplexu (obvykle vázaná (nejlépe (precipitace nebo agrena částice) polyhapten) gace (shlukování) částic)

Pokud je ve způsobu analýzy podle vynálezu použita SAH-hydroláza jako enzym, přeměňující homocystein, je výhodné buď SAH-hydrolázu skladovat v přítomnosti redukčního činidla, anebo ji redukčním činidlem ovlivnit před jejím použitím k analýze. Bylo zjištěno, že skladování jinak vyvolává inaktivaci tohoto enzymu a použití redukčního činidla buď zabraňuje inaktivaci během skladování, nebo reaktivuje enzym před použitím.

Použita mohou být různá redukční činidla (například DTT, cystein, merkaptoethanol, dithioerythritol, borohydrid sodný a pod.), zvláště vhodný je však DTT, např. v koncentraci přibližně 5 mM. Samotný DTT může být uchováván při nízkém pH a sada přípravků k provedení analýzy tedy s výhodou obsahuje roztok DTT o nízkém pH (např. asi 3), avšak s nízkou pufrační kapacitou, a oddělený roztok SAH-hydrolázy, která může být částečně nebo zcela inaktivní, o pH v zásadě neutrálním a zejména pufrovaný. Po spojení těchto roztoků se enzym reaktivuje při

-7CZ 287334 B6 neutrálním pH. Je-li to žádoucí, může k tomuto spojení dojít v přítomnosti testovaného vzorku, nebo může být vzorek přidán krátce poté, takže k uvolnění homocysteinu dochází současně. Podobně mohou být ke stabilizaci a/nebo aktivaci SAH-hydrolázy, stejně jako k redukci vzorku pro uvolnění homocysteinu, použita jiná redukční činidla, uvedená výše.

Použití redukčních činidel k reaktivaci inaktivované SAH-hydrolázy je dalším aspektem vynálezu. V ještě dalším ohledu vynález také předkládá sadu, obsahující v první části inaktivní SAHhydrolázu a v druhé části redukční činidlo, např. DTT v kyselém prostředí (o pH například 3). Při použití této sady může být SAH-hydroláza smíchána s redukčním činidlem a tím reaktivována bezprostředně před použitím v analýze. Ke zvýšení stability SAH-hydrolázy během skladování či samotné analýzy mohou být s výhodou použity i další přídavné látky. Patří mezi ně NAD⁺, glutathion, polyhydroxylované alkoholy a cukry (například inositol, sorbitol, xylitol, erythritol, glycerol, ethylenglykol, sacharóza, laktitol a podobně), rozpustné polymery jako některé dextrany, a bílkoviny (např. nosičové bílkoviny).

Pokud se ve způsobu analýzy podle vynálezu používají protilátky, mohou být polyklonální, ale přednost se dává monoklonálním. Pokud potřebné protilátky dosud nejsou komerčně dostupné, mohou být vyrobeny obvyklými technikami. Jak monoklonální, tak i polyklonální protilátky mohou být získány od zvířat nebo z hybridomů, jak popisuje např. James Gooding v kapitole 3 knihy „Monoclonal antibodies, principle and practice“, vydané v Academie Press, London, 1983. Monoklony musí být tříděny k získání takových klonů, které rozlišují požadovaný hapten od dalších substrátů enzymů (ů), například tedy rozlišují adenosin a SAH. Polyklonální protilátky, reagující pouze s analyzovanou látkou (např. SAH), musí být vyčištěny k odstranění křížově reagujících protilátek, tj. takových, které reagují kromě analyzované látky i s jinými substráty, např. s adenosinem i se SAH. Čištění může být provedeno afinitní chromatografií, například za použití imobilizovaného adenosinu, je-li analyzovanou látkou SAH.

Při výrobě protilátek se jako haptenu používá buď samotné analyzované látky, nebo jiné molekuly, která obsahuje tu část analyzované látky, jenž je považována za nejvhodnější vaznou oblast, například oblast vzdálenou od takových oblastí, které se účastní enzymové reakce. Hapten je s výhodou spojen s makromolekulou, jako je BSA (hovězí sérový albumin) nebo hemocyanin. Epitop požadovaný pro SAH je s výhodou v místě thioetherového můstku nebo v jeho blízkosti a i když je možné použít samotný SAH,

navázaný na makromolekulu, přednost se dává použití „zjednodušené“ molekuly, jako je molekula vzorce I

(O

-8CZ 287334 B6 (kde R] a R?, které mohou být shodné nebo odlišné, jsou vodíkové atomy nebo skupiny OR4 (kde R4 je nižší (např. C]_6, zvláště Ci_4) alifatická skupina jako je alkylová skupina, s výhodou methylová nebo ethylová skupina) anebo Ri a R₂ společně představují kyslíkový atom a R₃ je aminová nebo karboxylová skupina) nebo její sůl či ester (například sC]_4 alkoholem), opět navázané na makromolekulu.

Dále jsou uvedeny příklady sloučenin vzorce (I), které mohou být použity jako hapteny

OH OH

Takové „zjednodušené“ struktury mohou být rovněž zavedeny pro značené analogy uvedené dříve a užívané ve způsobech analýzy, v nichž se analyzovaná látka a značený analog účastní kompetitivní vazné reakce s protilátkou. Tak může být částice R’, poskytující signál, která může být zvolena z fluorofonů, chromoforů, radiových, enzymových, chemiluminiscentních a jiných označení, obecně používaných v imunologických analýzách, připojena na analyzovanou látku, jako například R-SAH, nebo na zjednodušenou, epitop obsahující molekulu, jako například

-9CZ 287334 B6

R’Ch₂ch₂ch₂sch₂

OH OH

Takové značené sloučeniny mohou být samozřejmě v případě potřeby připojeny i na částice, polymery nebo jiný materiál.

Značené 6-thioethery furanosy a sloučeniny podle vzorce I jsou nové a tvoří další stránku vynálezu.

Nazíráno z jiné strany, vynález předkládá postup přípravy sloučenin podle vzorce I, a tento proces zahrnuje přinejmenším jeden z následujících kroků:

(a) reakce sloučeniny vzorce II

(kde Ri a R₂ odpovídají dřívější definici a každý zbytek R₅ je chráněnou hydroxylovou skupinou anebo oba zbytky R₅ tvoří dohromady alkylendioxyskupinu (tj. chráněnou bis-hydroxyskupinu, jako je -OC(CH₃)₂O-) s propylhalidem podle vzorce III

R6(CH₂)3 Hal (kde Ré je skupina R₃ nebo chráněná skupina R₃ a Hal je halogenový atom, např. bromu), následovaná, je-li to požadováno, odstraněním kteiýchkoliv ochranných skupin;

(b) (k přípravě sloučeniny vzorce I, kde R₃ je aminoskupina) reakce sloučeniny vzorce II s akrylonitrilem, redukce získaného cyanopropylthioetherového produktu a odstranění jeho ochranných skupin; a (c) esterifikace sloučeniny vzorce I, kde R₃ je karboxylová skupina.

Výchozí produkty vzorce III mohou být připravovány standardními postupy nebo jsou známé z literatury. Výchozí produkty podle vzorce II mohou být připraveny z odpovídajících 1hydroxymethylfuranosových sloučenin ochranou cis-hydroxyskupiny, hromováním a následnou reakcí s thiomočovinou a hydrolýzou. 1-hydroxymethylfuranosy mohou mít cis-hydroxyskupinu chráněnu činidly běžně užívanými k její ochraně, například acetonem.

Mezi příklady reakčních schémat pro přípravu sloučenin vzorce I patří následující (sloučeniny (1) a (3) jsou komerčně dostupné)

-10CZ 287334 B6

Aceton či(3))

(4)(př. (1)/(2)

^/PÍCeHsh bezv. ether

(D)

-11CZ 287334 B6 (E) (7)

CH₃O-/CH3OH

(F)

(G) (θ)

1. LiAlH^/bezv. ether

2. H⁺/H₂O

(H) (8)

BffCHjJaCOOCjHj

CjHsOCOÍCHjJoS—

(11)

2.H*7tyD

HOOCCCH^

I.OFť/dioxan

(12)

-12CZ 287334 B6 ^12) B-bydroxysukciniaid dicytLohexylkarbodiiaid difflethylformamid

Absorpce UV světla, absorpce viditelného světla nebo fluorescence látek v reakční směsi, obvykle vysrážených nebo jinak z reakční směsi oddělených, může být měřena v reakci typu „konečný bod“ (kdy je signál stabilní), nebo v jednom či více pevných časových bodech, anebo může být použito kinetického měření, kdy je několik měření uskutečněno v různých časových bodech.

K provedení analýzy podle vynálezu mohou být nezbytné reagencie do reakční směsi přidány postupně nebo současně. V mnoha provedeních, kterým se dává přednost, je však výhodné, aby jedna či více reakcí probíhaly určitý čas před přidáním reagencií pro následující reakci(e). Například při reakci testovaného vzorku s adenosinem a SAH-hydrolázou se dává přednost tomu, aby se tvorba SAH z adenosinu a homocysteinu uskutečnila nějaký čas před tím, než bude stanovován adenosin.

V klinické chemické analytice je běžnou praxí použití standardních křivek pro účely kalibrace. Při provádění metody podle tohoto vynálezu tedy mohou být vzorky o známém obsahu homocysteinu použity namísto klinických vzorků k sestrojení standardních křivek pro měřenou odpověď a/nebo signál a obsah homocysteinu v neznámých vzorcích může být vypočítán interpolací ze standardních křivek. Proto není potřebná exaktní kvantifikace molekul, poskytujících signál anebo redoxních potenciálů.

Metoda analýzy podle tohoto vynálezu může být použita k diagnose a sledování patologických a možných patologických podmínek, které ovlivňují obsah homocysteinu v tělních tekutinách či tkáních nebo se kněmu vztahují. Patří knim arterioskleróza, krevní onemocnění, nedostatek vitaminů a/nebo vrozené poruchy metabolismu. Tato metoda může být využita také ke stanovení účinku farmaceutik, jako jsou léky, působící proti kyselině listové.

V jiném ohledu poskytuje vynález volitelně ve formě sady přípravků analytický produkt, určený k analýze homocysteinu ve vzorku, který se skládá z: enzymu, přeměňujícího homocystein; ze substrátu tohoto enzymu, odlišného od homocysteinu; z činidla, poskytujícího měřitelný signál a volitelně z prostředků ke stanovení signálu.

V provedení, kterému se dává přednost, analytický produkt obsahuje:

enzym, přeměňující homocystein, např. S-adenosylhomocysteinhydrolázu; jeden či více substrátů tohoto enzymu, lišících se od homocysteinu; prostředky pro vytvoření detegovatelného derivátu analyzovaného činidla, vybraného z kosubstrátů homocysteinu a produktů jeho enzymové přeměny; a volitelně, prostředky pro spektrometrické nebo kolorimetrické stanovení uvedeného detegovatelného derivátu k indikaci obsahu homocysteinu ve vzorku.

V jiném provedení produkt obsahuje: adenosin; S-adenosinhomocysteinhydrolázu; enzym přeměňující adenosin; volitelně kosubstrát uvedeného enzymu, přeměňujícího adenosin; a prostředky pro vytvoření fotometricky detegovatelné odpovědi uvedeného kosubstrátu nebo produktu enzymové přeměny adenosinu zmíněným adenosin-přeměňujícím enzymem. Enzymem, přeměňujícím adenosin, může být například adenosinkinasa a prostředky pro vytvoření odpovědi mohou zahrnovat ATP, luciferin a luciferasu. Nebo může být enzymem, přeměňujícím adenosin,

-13CZ 287334 Β6 adenosindeaminasa a prostředky přeměny mohou obsahovat nukleosidfosforylasu, xanthinoxidasu a peroxidázu.

V ještě dalším provedení sada obsahuje adenosin; S-adenosylhomocystein; protilátku proti Sadenosylhomocysteinu, volitelné vázanou na částice matrixu; polyhapten uvedené protilátky; a podle volby prostředky pro fotometrické stanovení aglutinace nebo precipitace komplexu protilátka:polyhapten. V tomto provedení může být polyhapten s výhodou tvořen základním řetězcem polymeru, na nějž je připojeno množství 6-thioetherů furanosy, například navěšených zbytků o vzorci

OH OH

Tyto látky mohou vznikat například reakcí karbocyklické kyseliny vzorce I (nebo anhydridu či kyselého halidu takové kyseliny) s polymerem, majícím množství navěšených aminů (například s polylysinem) nebo reakcí aminu podle vzorce I s polymerem, obsahujícím navěšené karboxylové skupiny.

V sadě přípravků mohou být buď všechny, nebo jen některé reagencie v suché formě, jako složka a/nebo matrix pro provedení reakcí dané reakční směsi. Podobně může sada, jak bylo naznačeno, zahrnovat jako prostředek ke stanovení detegovatelné analyzované látky nebo derivátu, poměrně finančně méně nákladný spektrometrický či kolorimetrický přístroj, například světelný zdroj a detektor v předem nastaveném uspořádání k detekci intenzity světla při charakteristické vlnové délce detegovatelné analyzované látky atd., nebo třeba jen jednoduchou kolorimetrickou kalibrační tabulku.

Vynález bude nyní popsán následujícími příklady, jimiž však není omezen. Zvláštní přednost se dává způsobu analýzy podle příkladu 19.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vzorek (vodný roztok homocysteinu pro kalibraci nebo plazma či moč pro klinickou analýzu) byl ovlivněn redukčním činidlem (např. 10 mmol/1 dithiothreitolem). Tento vzorek byl přidán, nejlépe ve výsledné koncentraci homocysteinu v rozmezí 10^-6 až 10'⁵ mol/1, k roztoku, obsahujícímu při 37 °C 5 mg/ml králičího IgG, 20 mU/ml adenosindeaminasy, 20 mU/ml nukleosidfosforylasy, 20 mU/ml xanthinoxidasy, 500 mU/ml křenové peroxidázy, 10 mmol/1 dithiothreitolu a 100 mmol/1 fosforečnanu sodného, pH upraveno na hodnotu 7,4, a 100 mU S-adenosyl-Lhomocysteinhydrolázy. Adenosin ve výsledné koncentraci 5x10⁶ mol/1 byl přidán buď současně, nebo následně, přednost se však dává jeho přidání až po 10 minutách inkubace, aby byla umožněna přeměna adenosinu ve vzorku. Absorbance UV světla byla měřena v průběhu 10 minut, odpověď byla stanovena kinetickým způsobem při 292 nm a poté byl počítán poměr

ΔΑ At

-14CZ 287334 B6

U klinických testů může být koncentrace homocysteinu počítána interpolací ze standardní křivky, získané za použití známých standardů.

Příklad 2

Vzorek (jako v příkladu 1) byl ovlivněn redukčním činidlem (např. 10 mmol/1 dithiothreitolem). Tento vzorek, nejlépe s výslednou koncentrací homocysteinu v rozmezí 10^-6 až 10'⁵ mol/1, byl přidán k roztoku, obsahujícímu při 37 °C 5 mg/ml králičího IgG, 20mU/ml adenosindeaminasy, 20 mU/ml nukleosidfosforylasy, 20 mU/ml xanthinoxidasy, 500 mU/ml křenové peroxidázy, 10 mmol/1 dithiothreitolu a 100 mmol/1 fosforečnanu sodného, pH upraveno na hodnotu 7,4, a20mU S-adenosyl-L-homocysteinhydrolázy. Poté, přednostně po 10 minutách inkubace, aby mohlo dojít k přeměně adenosinu ve vzorku, byl přidán S-adenosyl-L-homocystein ve výsledné koncentraci 5x10“⁵ mol/1 a v průběhu 10 minut byla měřena absorpce UV světla. Za použití kinetické metody byl při 292 nm počítán poměr

ΔΑ

At

Příklad 3

Pufr pro analýzu:

0,1 mol/1 fosfátový pufr o pH 7,4, obsahující 1 mg/ml králičího IgG a 10 mmol/1 dithiothreitolu.

Postup analýzy:

Ke 150 μΐ pufru pro analýzu byly přidány 3 mU S-adenosyl-L-homocysteinhydrolázy a vzorek (s výhodou upravený podle popisu v příkladu 1 a 2). Enzymová reakce byla startována přídavkem adenosinu, rozpuštěného v pufru pro analýzu ve výsledné koncentraci 2,5 x 10’⁵ mol/1. Po 10 minutách inkubace bylo přidáno 750 μΐ roztoku pufru pro analýzu, který obsahoval 20 mU/ml adenosindeaminasy, 20 mU/ml nukleosidfosforylasy, 20 mU/ml xanthinoxidasy a 375 mU/ml křenové peroxidázy. UV absorpce při 292 nm byla měřena 5 minut kinetickou metodou a poté byl spočítán poměr

ΔΑ

At

Analýza byla paralelně opakována bez přídavku S-adenosyl-L-homocysteinhydrolázy. Po určení rozdílu obou hodnot poměru ^A byla koncentrace homocysteinu vypočítána interpolací ze standardní křivky.

Příklad 4

Až do první inkubace byla analýza prováděna tak, jak je popsáno v příkladu 3. Po 10 minutové inkubaci byl tedy přidán roztok pro analýzu, obsahující fluoresceinem značený adenosin a monoklonální protilátky vůči adenosinu. Zbytkový adenosin a fluoresceinem značený adenosin kompetovaly o vazbu na protilátku. Množství značeného adenosinu, vázaného na protilátky, se stanoví běžnou metodou polarizace fluorescence a koncentrace adenosinu je počítána interpolací ze standardní křivky.

-15CZ 287334 B6

Příklad 5

Pufr pro analýzu:

0,1 mol/1 fosfátový pufr o pH 7,4, obsahující 1 mg/ml králičího IgG a 10 mmol/1 dithiothreitol.

Roztok SAH-hydrolázy:

mU/ml S-adenosyl-L-homocysteinhydrolázy je rozpuštěno v pufru pro analýzu.

Roztok adenosinu:

Adenosin je v koncentraci 5x10~⁸ mol/ml rozpuštěn v pufru pro analýzu.

Roztok adenosindeaminasy:

200 mU/ml adenosindeaminasy je rozpuštěno v pufru pro analýzu.

Roztok fenol/nitroprussid:

Je tvořen fenolem (10 mg/ml a nitroprussidem sodným (50 pg/ml) ve vodě.

Roztok chlornanu:

mmol/1 NaOCl je rozpuštěn ve 125 mmol/1 NaOH.

Postup analýzy:

1. 75 μΐ roztoku adenosinu a 75 μΐ roztoku SAH-hydrolázy se smíchá se vzorkem (nejlépe předem upraveným podle popisů v příkladech 1 až 4) a 10 minut udržuje při 37 °C.

2. Přidá se 100 μΐ roztoku adenosindeaminasy a směs je 5 minut inkubována při 37 °C.

3. Přidá se 750 μΐ roztoku fenol/nitroprussid a 750 μΐ roztoku chlornanu. Po 30 minutové inkubaci při 37 °C je měřena extinkce při 628 nm. Analýza je paralelně opakována bez přídavku SAH-hydrolázy. Poté je spočten rozdíl mezi těmito dvěma hodnotami extinkce při 628 nm a koncentrace homocysteinu se vypočítá ze standardní křivky, získané pomocí známých standardů, interpolací tohoto rozdílu.

Příklad 6

Příprava fluoroforem značeného SAH

Roztok 10 mmol/1 SAH v dimethylformamidu je naředěn v poměru 1:10 pomocí 100 mmol/1 fosfátového pufru o pH 7,5. Do tohoto roztoku se přidá isothiokyanát fluoresceinu ve výsledné koncentraci 1 mmol/1. Po 60 minutách inkubace při laboratorní teplotě se konjugát SAHfluorescein čistí pomocí HPLC na koloně Chromasil C-l 8 při 260 nm za použití gradientního roztoku 25 mmol/1 octanu amonného (pH 7,0) a methanolu.

Příklad 7

Příprava protilátek vůči SAH

a) Příprava antigenu: K roztoku, tvořenému 1 mmol/1 SAH ve fosfátovém pufru (25 mmol/1, pH 7,4) a 125 mmol/1 NaCl, je přidán BSA ve výsledné koncentraci 5 mg/ml. K této směsi se přidá bis(sulfosukcinimidyl)suberát ve výsledné koncentraci 1 mmol/1 a směs je ponechána reagovat 60 minut. (pH této konjugační reakce je udržováno na nízké hodnotě, což podporuje konjugaci na aminu adenosylu spíše než na aminu homocysteinu). Bílkovinná frakce roztoku, která obsahuje také konjugáty BSA a SAH, je izolována gelovou chromatografií na sloupci

-16CZ 287334 B6 nosiče „Superose 12“ (Pharmacia) za použití fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku jako eluentu.

b) Příprava hybridomů: S popsaným antigenem jsou připravovány hybridomy podle postupu, popsaného Jamesem W. Goodingem v 3. kapitole knihy „Monoclonal antibodies: „Principle and Practice“, Academie Press London, 1983.

c) Výběr hybridomů:

(i) Protilátky vůči SAH, vytvářející hybridomy, jsou identifikovány následovně: Obsah IgG v supematantu hybridomů je měřen běžnou ELISA technikou. Poté je supematant smísen v kyvetě pufrem, obsahujícím 50 mmol/1 fosfát a 120 mmol/1 NaCl o pH 7,4, 1 mg/ml králičího IgG a myší IgG ve výsledné koncentraci 0,1 pmol/l. Fluoresceinem značený SAH, připravený podle výše uvedeného Příkladu 6, se přidá ve výsledné koncentraci 0,02 pmol/l. Po 10 minutách inkubace je stupeň polarizace měřen spektrofluorometrem, vybaveným jednotkou polarizace fluorescence, odečtením

A, tj. intenzity fluorescence, když je rovina polarizace dopadajícího světla rovnoběžná s polarizační rovinou filtru, použitého k filtraci emitovaného světla,

B, tj. intenzity fluorescence, když je rovina polarizace dopadajícího světla kolmá k polarizační rovině filtru, použitého k filtraci emitovaného světla, a za použití excitační vlnové délky 494 nm a detekce emitovaného světla při 517 nm.

Stupeň polarizace je počítán jako (A-B)/(A + B)

Nízký stupeň polarizace naznačuje, že myší monoklonální protilátky nevážou SAH.

(ii) Z hybridomů, zvolených podle (i), jsou následujícím způsobem určeny hybridomy, produkující protilátky, které reagují s adenosinem a/nebo homocysteinem: Monoklonální protilátky vůči SAH ze supematantu hybridomů jsou fixovány na povrch mikrotitračních jamek tak, jak je popsáno dále v Příkladu 9. Do jamek se v pufru o pH 7,4, který obsahuje 25 mmol/1 fosfát, 120 mmol/1 NaCl a králičí IgG (1 mg/ml), přidá uhlíkem ^I4C značený adenosin (nebo homocystein), výrobky britské firmy Amersham Ltd. Po 60 minutách inkubace se jamky třikrát promyjí stejným pufrem (ovšemže bez přídavku adenosinu či homocysteinu). Vysoké hodnoty radioaktivity, zachycené v jamkách, znamenají, že hybridomy produkují protilátky, které se vážou na adenosin (nebo homocystein) samovolně. Takové protilátky nejsou k analýze využívány.

(iii) Produkce monoklonálního IgG: Hybridomy, produkující protilátky, které se vážou na SAH, tak, jak bylo výše popsáno v (i), a současně se nevážou na adenosin nebo homocystein, jak bylo uvedeno v (ii), jsou vybrány k produkci monoklonálního IgG. Vybrané hybridomy se používají k tvorbě ascitu u myší či k vytvoření buněčných kultur in vitro za použití obvyklých postupů. Běžnými metodami jsou dále izolovány také monoklonální protilátky z ascitu nebo z média buněčných kultur, viz James W. Gooding „Monoclonal antibodies: Principle and Practice“, Academie Press, London, 1983.

-17CZ 287334 B6

Příklad 8

Imunoanalýza homocysteinu polarizací fluorescence

Enzymový roztok:

mmol/1 fosfátový pufr o pH 7,4, obsahující králičí IgG (0,2 mg/ml), 120 mmol/1 NaCl, 10mmol/l dithiothreitolu, S-adenosyl-L-homocysteinhydrolázu (10U/1) a 0,1 mmol/1 adenosinu.

Roztok fluoresceinem značeného SAH:

Konjugát SAH s fluoresceinem, připravený podle příkladu 6, je rozpuštěn ve výsledné koncentraci 1 pmol/l v 50 mmol/1 fosfátovém pufru o pH 7,4, obsahujícím 125 mmol/1 NaCl a 0,2 mg/ml králičího IgG.

Roztok protilátky:

Monoklonální protilátky vůči SAH (nereagující s adenosinem a s výhodou ani s homocysteinem), vytvořené například podle příkladu 7, rozpuštěné ve výsledné koncentraci 0,1 pmol/l v 50 mmol/1 fosfátovém pufru o pH 7,4, obsahujícím 125 mmol/1 NaCl a 0,2 mg/ml králičího IgG.

Provedení analýzy:

V kyvetě se smíchá 15 μΐ plazmy (nejprve ze série vzorků se známým obsahem homocysteinu) se 100 μΐ enzymového roztoku a inkubuje se 15 minut při 37 °C. Přidá se 100 μΐ roztoku fluoresceinem značeného SAH a poté 1,0 ml roztoku protilátky. Stupeň polarizace se měří, jak bylo dříve popsáno v příkladu 7(c)(i), spektrofluorometrem, který je vybaven jednotkou polarizující fluorescenci, a vynáší se proti koncentraci homocysteinu.

Analýza může být uskutečněna i za použití značených haptenů a protilátek podle příkladů 11 a 13, či 15 a 17, namísto těch, které popisují příklady 6 a 7.

Přiklad 9

Mikrotitrační enzymová imunoanalýza (a) Enzymový roztok je stejný jako v příkladu 8.

(b) Roztok peroxidázou značeného SAH: 0,5 mg křenové peroxidázy se rozpustí v 1 ml přečištěné vody. Přidá se 200 μΐ roztoku 0,02 mol/1 jodistanu sodného, směs je míchána 20 minut při laboratorní teplotě a přes noc dialysována pomocí 10 mmol/1 pufru octanu sodného o pH 4,4. Poté je přidán SAH do výsledné koncentrace 0,1 mmol/1 a pH je upraveno na 6,0. Směs je 4 hodiny míchána při laboratorní teplotě. Přidá se 100 μΐ čerstvě připraveného vodného roztoku (4 mg/ml) borohydridu sodného a roztok je inkubován 2 hodiny při 4 °C. Peroxidáza a její konjugáty se SAH jsou izolovány gelovou chromatografií na koloně sorbentu Superose 6“ (Pharmacia, Švédsko).

(c) Protilátky vůči SAH, zachycené v mikrotitračních jamkách: Polyklonální ovčí IgG, získaný z ovcí, imunizovaných myším IgG, je rozpuštěn ve výsledné koncentraci 1 mg/ml ve 100 mmol/1 borátovém pufru o pH 9,0. Do každé jamky polystyrénové mikrotitrační destičky je napipetováno 300 μΐ tohoto roztoku. Po 120 minutách inkubace při 37 °C jsou jamku pětinásobně promyty

-18CZ 287334 B6 fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem. Poté jsou ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku rozpuštěny monoklonální myší protilátky IgG vůči SAH ve výsledné koncentraci 50 pg/ml, vytvořené podle dříve zmíněného příkladu 7. Ke každé jamce se přidá 200 μΐ tohoto roztoku monoklonálního IgG a inkubuje 120 minut při 37 °C. Pak jsou jamky pětkrát promyty roztokem fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku, který obsahuje 0,1 mg/ml králičího IgG.

(d) Provedení analýzy: 25 μΐ vzorku plazmy (nejprve ze série vzorků se známou koncentrací adenosinu) se smíchá s 500 μΐ enzymového roztoku a inkubuje 15 minut při 37 °C. Přidá se 50 μΐ roztoku peroxidázou značeného SAH a po promíchání je na jamku mikrotitrační destičky s protilátkou vůči SAH, navázanou podle bodu (c), přidáno 250 μΐ vzniklého roztoku, přičemž všechny roztoky jsou pufrovány na pH 7,4. Po 60 minutách inkubace při 37 °C jsou jamky třikrát promyty fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem, který obsahuje 0,1 mg/ml králičího IgG. Do každé jamky je přidáno 100 μΐ roztoku (1 mg/ml) orthofenylendiaminu v 0,1 mol/1 citrátovém pufru o pH 6,0, který obsahuje 0,015% peroxid vodíku. Po 10 až 30 minutách je měřena absorbance každé jamky při 450 nm. Hodnoty absorbance se vynášejí proti koncentraci homocysteinu.

Příklad 10

Produkce haptenu

3-S-(l-anhydro-D-ribofuranosyl)-thiopropylamin

H₂N(CH₂)₃SCH₂

OH OH (a) aktivovaný merkaptan s chráněnými hydroxyskupinami (sloučenina (8) ve výše uvedené schématu (E))

Jeden ekvivalent methyl-p-D-ribofuranosidu dříve zmíněné sloučeniny (1), která je komerčně dostupná) reaguje se směsí pěti ekvivalentů sulfonátu trimethylsilylmethanu a jednoho ekvivalentu etherátu fluoridu boritého podle postupu Juna a spoluautorů (Carb. Res. 163, 247261, 1987). Po malých částech a za stálého míchání je 0,5 ekvivalentu produktu 1-anhydro-Dribosy (sloučeniny (2)) ve formě jemného prášku přidáno ke směsi acetonu a kyseliny sírové, připravené pomalým přidáním 6,3 ml koncentrované kyseliny sírové ke 100 ml čerstvě destilovaného acetonu v ledové lázni. Po odstranění ledové lázně probíhá reakce 8 hodin při

-19CZ 287334 B6 laboratorní teplotě. Získaná pevná bílá krystalická látka je rozpuštěna v chloroformu, promyta vodným hydroxidem sodným, zředěna kyselinou chlorovodíkovou a poté vodou, vysušena a nakonec odpařena za vzniku 2,3-isopropyldien-D-ribosového derivátu 1-anhydro-D-ribosy (sloučeniny (2)). Jeden ekvivalent tohoto derivátu a dva ekvivalenty tetrabrommethanu jsou 5 rozpuštěny v sušeném etheru a chlazeny v ledu. K nim jsou za stálého míchání a chlazení ledem přidány dva ekvivalenty trifenylfosfinu. Poté je ledová lázeň odstraněna a směs je ponechána ohřát na laboratorní teplotu za slabého vývoje bromovodíku ve vznikající reakci. Po doběhnutí reakce je přebytek reagentu neutralisován přídavkem methanolu. Bromidový derivát (sloučenina (6)) je izolován filtrací a odpařením filtrátu. K tomuto derivátu se přidá jeden ekvivalent thiomoío čoviny, rozpuštěné v horké vodě a naředěné rektifikovaným alkoholem. Tato směs je destilována pod zpětným chladičem a pravidelně dobře protřepávána, ještě asi 30 minut po rozpuštěné bromidového derivátu. Pak je reakční směs ochlazena v ledu a zfiltrována. K pevné látce je přidán alkalický vodný roztokem, čímž v organické fázi vznikne merkaptan s chráněnými hydroxyskupinami. Ten je přeměněn na aktivní formu (sloučenina (8)) působením methoxidu 15 v methanolu. Aktivní forma poté dále reaguje tak, jak je níže popsáno.

(b) 3-S-( l-anhydro-D-ribofuranosyl)thiopropylamin

Jeden ekvivalent čerstvě připravené sloučeniny podle příkladu 10(a), tj. sloučeniny (8), reaguje 20 s jedním ekvivalentem akrylonitrilu za vzniku thioetheru (sloučeniny (9)). Ten je pak redukován prostřednictvím L1AIH4 vbezvodém etheru a volný nechráněný amin (sloučenina (10)) je izolován účinkem kyseliny chlorovodíkové.

Odpovídající aminopropylthioethery, jejichž Ri a R₂ nejsou tvořeny vodíkem, se připravují 25 analogicky, například za využití komerčně dostupných sloučenin (1) a (3) jako výchozího materiálu.

Příklad 11

Značení haptenu mmol/1 roztok sloučeniny podle Příkladu 10 v dimethylformamidu (DMF) je v poměru objemů 1:5 naředěn 0,1 mol/1 roztokem hydrouhličitanu (pH 9,2). Do takto získaného roztoku je 35 přidán isothiokyanát fluoresceinu o výsledné koncentraci 12 mmol/1. Po 60 minutách inkubace při laboratorní teplotě se fluoresceinový konjugát se sloučeninu podle příkladu 10 čistí chromatografíí na reversní fázi (RPC) za použití kolony Kromasil 100 Á C-18 a gradientního roztoku 20 mmol/1 acetátu amonného (pH 7,0) a methanolu.

Příklad 12

Příprava antigenu

K 1 mmol/1 roztoku sloučeniny podle příkladu 10 v pufru, složeném z 50 mmol/1 fosfátu a 125 mmol/1 NaCl o pH 7,4, se přidá hovězí sérový albumin (BSA) o výsledné koncentraci 5 mg/ml. K. této směsi je přidán bis(sulfosukcinimidyl)suberát o výsledné koncentraci 1,2 mmol/1 a směs je ponechána reagovat 60 minut. Bílkovinná frakce, obsahující konjugát hapten-BSA je izolována gelovou chromatografíí na koloně sorbentu „Superose 12“ (Pharmacia) za použití 50 fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku jako eluentu.

-20CZ 287334 B6

Příklad 13

Příprava protilátky

Protilátky vůči sloučenině podle příkladu 10 jsou připravovány analogicky jako v příkladu 7 za použití antigenu, získaného podle příkladu 12. Protilátky, nereagující se SAH a protilátky, které reagují s adenosinem, jsou odstraněny, neboť přednost se dává protilátkám, reagujícím s homocysteinem.

Příklad 14

Produkce haptenu

N-hydroxysukcinimidyl-3-S-(l-anhydro-D-ribofuranosyl)thiobutanoát

Jeden ekvivalent čerstvě připravené sloučeniny podle příkladu 10(a) reaguje s jedním ekvivalentem ethyl-4-brombutyrátu za vzniku esterové sloučeniny (11). Ta je bazickou hydrolýzou vodným hydroxidem sodným v dioxanu hydrolyzována na volnou kyselinu a zbavena ochranných skupin účinkem vodné kyseliny chlorovodíkové za vzniku nechráněné volné kyseliny (sloučeniny (12)). Jeden ekvivalent této látky je smísen se dvěma ekvivalenty N-hydroxysukcinimidu v ledovém dimethylformamidu a ke vzniklé směsi je za stálého míchání přidáno 1,2 ekvivalentu dicyklohexylkarbodiimidu. Reakce probíhá 18 hodin při laboratorní teplotě, poté je směs ochlazena a přidá se ledově studený ether. Vysrážený NHS-ester (sloučenina (13)) je rekrystalován ze směsi DMF/ether, vysušen a uchováván při 4°C spolu s prostředkem, pohlcujícím vlhkost.

Odpovídající NHS-estery, jejichž Rj a R₂ nejsou tvořeny vodíkovým atomem se připravují obdobně, například za použití komerčně dostupných sloučenin (1) a (3) jako výchozích látek.

Příklad 15

Značení haptenu mmol/1 roztok sloučeniny podle příkladu 14 v DMR je zředěn v poměru objemů 1:5 0,1 mol/1 hydrouhličitanovým pufrem o pH 9,2. Ke vzniklému roztoku se přidá 5-aminoacetamidoflorescein (glycinamid fluoresceinu) o výsledné koncentraci 12 mmol/1. Po 60 minutách inkubace při laboratorní teplotě je fluoresceinový konjugát 3-S-(l-anhydro-D-ribofuranosyl)thiobutanové kyseliny čištěn chromatografií na reversní fázi (RPC) za použití kolony Kromasil 100 A C-l 8 a gradientního roztoku 20 mmol/1 acetátu amonného (pH 7,0) a methanolu.

-21CZ 287334 B6

Příklad 16

Příprava antigenu

K roztoku hovězího sérového albuminu (BSA, 5 mg/1 v pufru, tvořeném 50 mmol/1 fosfátem a 125 mmol/1 NaCl o pH 7,4) se přidá sloučenina podle příkladu 14 o výsledné koncentraci 1 mmol/1. Směs je ponechána reagovat 60 minut a bílkovinná frakce, obsahující konjugát BSAhapten, je izolována gelovou chromatografií na koloně sorbentu „Superose 12“ (Pharmacia) za použití fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku jako eluentu.

Příklad 17

Příprava protilátky

Protilátky vůči sloučenině podle příkladu 14 se připravují obdobně jako v příkladu 7 za použití antigenu, získaného podle příkladu 12. Protilátky nereagující se SAH a protilátky, které reagují s adenosinem jsou odstraněny; přednost se dává protilátkám, reagujícím s homocysteinem.

Příklad 18

Imunoanalýza polarizací fluorescence

Enzymový roztok:

mmol/1 fosfátový pufr o pH 7,4, obsahující kasein (4 mg/ml), 120 mmol/1 NaCl a S-adenosylL-homocysteinhydrolázu (10 U/l).

Roztok dithiothreitolu (DTT):

Dithiothreitol je rozpuštěn ve vodě v koncentraci 50 mmol/1 a pH je pomocí HC1 upraveno na hodnotu 3,0.

Roztok adenosinu:

1,8 mmol/1 adenosin v 50 mmol/1 fosfátovém pufru o pH 7,4.

Roztok fluoresceinem značeného SAH:

mmol/1 fosfátový pufr o pH 7,4, obsahující SAH konjugovaný s fluoresceinem, připravený podle příkladu 6.

Roztok protilátky:

Monoklonální protilátky vůči SAH (např. připravené podle příkladu 7), rozpuštěné v konečné koncentraci 0,1 pmol/l v 50 mmol/1 fosfátovém pufru o pH 7,4, který obsahuje 120 mmol/1 NaCl a kasein v koncentraci 1 mg/ml.

Provedení analýzy:

Krokl:

V kyvetě se smíchá 15 μΐ vzorku, 10 μΐ enzymového roztoku a 10 μΐ adenosinu s 10 μΐ okyseleného roztoku DTT a výsledná směs je ponechána 15 minut stát při 37 °C.

-22CZ 287334 B6

Krok 2:

Do kyvety se přidá 100 μΐ roztoku fluoresceinem značeného SAH a 1,0 ml roztoku protilátky. Stupeň polarizace se měří na spektrofluorometru, vybaveném jednotkou polarizující fluorescenci, tak, jak již bylo popsáno v příkladu 7 (c)(i) a vynáší se proti koncentraci homocysteinu.

Příklad 19

Imunoanalýza, využívající polarizaci fluorescence

Enzymový roztok:

mmol/1 fosfátový pufr o pH 7,4, obsahující kasein (1 mg/ml), 120 mmol/1 NaCl a S-adenosylL-homocysteinhydrolázu (10 U/l).

Roztok dithiothreitolu (DTT):

Roztok fluoresceinem značeného SAH:

mmol/1 fosfátový pufr o pH 7,4, obsahující 10pmol/l SAH, konjugovaný s fluoresceinem, připravený podle příkladu 6, a adenosin v koncentraci 1,8 mmol/1.

Roztok protilátky:

Provedení analýzy:

V kyvetě se smíchá 10 μΐ plazmy, 100 μΐ enzymového roztoku a 10 μΐ roztoku značeného SAH s adenosinem spolu s 30 μΐ okyseleného roztoku DTT a směs se ponechá 15 minut stát při 37 °C.

Po inkubaci se přidá 1,0 ml roztoku protilátky a stupeň polarizace se měří na spektrofluorometru, vybaveném jednotkou polarizující fluorescenci, tak, jak již bylo popsáno v příkladu 7 (c)(i) a vynáší se proti koncentraci homocysteinu.

Analýzy, uvedené v příkladech 18 a 19 mohou být provedeny také s využití značených haptenů a protilátek podle příkladů 11 a 13 nebo 15 a 17 namísto těch, které jsou uvedeny v příkladech 6 a 7.

Příklad 20

Luminiscenční analýza

Pufr pro analýzu I:

mmol/1 Pipes pufr o pH6,6, obsahující kasein v koncentraci 1 mg/ml, 10 mmol/1 DTT, 0,5 mmol/1 MgCl₂ a 30 mmol/1 KC1.

-23CZ 287334 B6

Pufr pro analýzu II:

mmol/1 Hepes pufr o pH 7,75, obsahující 4 mmol/1 EDTA, 20 mmol/1 MgCl₂ a 0,36 mmol/l DTT.

Pufr pro analýzu III:

mmol/1 Hepes pufr o pH 7,75, obsahující luciferasu zPhotinus pyralis (1,6 pg/l), 700 pmol/l D-luciferin, 20 mmol/1 MgCl₂, 4 mmol/1 EDTA, 0,36 mmol/1 DTT a 0,3 mmol/1 AMP.

Postup analýzy:

Ke 130 μΐ pufru pro analýzu I se přidají 3 U jednotky S-adenosyl-L-homocysteinhydrolázy a směs je doplněna 20μ1 vzorku. Po 15 minutách inkubace při 37 °C je přidán adenosin ve výsledné koncentraci 5χ1θΑηο1/1, rozpuštěný v pufru pro analýzu I. Po 5 minutách inkubace při 37 °C je přidáno 750 μΐ pufru pro analýzu I, který obsahuje 7xl0⁶mol/l ATP a 1 mU adenosinkinasy. Výsledný roztok je dále 5 minut inkubován při 37 °C. Poté je roztok zředěn v poměru objemů 1:100 pufrem pro analýzu II a 500 μΐ takto zředěného roztoku je neprodleně přidáno k 500 μΐ pufru pro analýzu III. Oba pufry pro analýzu II i III musí být temperovány na laboratorní teplotu (21 °C). Vzniklá luminiscence je odečítána fotometricky při 550 nm.

Souběžně je prováděna analýza bez přítomnosti S-adenosyl-L-homocysteinhydrolázy. Koncentrace homocysteinu může být pro klinické testy počítána z rozdílu luminiscence, vzniklé v přítomnosti a v nepřítomnosti S-adenosyl-L-homocysteinhydrolázy, interpolací ze standardní křivky.

Příklad 21

Příprava polyklonálních protilátek

Králičí polyklonální protilátky vůči antigenům podle příkladů 12 a 16 se získají podle protokolu firmy Dako Corporation, Kodaň, Dánsko. Podle stejného protokoluje ze shromážděného antiséra purifikován také polyklonální IgG. Polyklonální protilátky jsou takových protilátek, které samovolně (per se) reagují se zbytky adenosinu a homocysteinu, zbaveny průstupem přes kolonu sorbentu Recti-Gel s imobilizovanými adenosinovými a homocysteinovými zbytky (gel a postup poskytuje Pierce Chemical Company, Belfium). Odstraňují se i protilátky, které se SAH nereagují. Konečné vybrané protilátky mohou být použity v analýzách podle předchozích Příkladů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob analýzy homocysteinu ve vzorku, při němž se vzorek uvádí do styku s enzymem Sadenosylhomocysteinhydrolázou a s alespoň jednou z neznačených látek ze skupiny Sadenosylhomocystein a adenosin jako substrátem pro tento enzym, vyznačující se tím, že se neznačená analyzovaná látka ze skupiny adenosin a S-adenosylhomocystein stanoví bez chromatografického oddělení.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se vzorek přivádí do styku s monoklonální protilátkou proti neznačené analyzované látce a s furanoso-6-thioetherovým haptenem této protilátky, odlišným od neznačené analyzované látky a stanovení analyzované

-24CZ 287334 B6 látky se provádí nepřímo stanovením haptenu, navázaného nebo nenavázaného na uvedenou protilátku.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se jako hapten protilátky užije polyhapten.
4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se jako hapten protilátky užije značená molekula, mající epitopickou strukturní jednotku, která se vyskytuje i u neznačené analyzované látky.
5. Způsob podle některého z nároků 2až 4, vyznačující se tím, že se jako protilátka užije monoklonální protilátka, vázaná na matrici nosiče.
6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se vzorek přivádí do styku s druhým enzymem, sloužícím k přeměně neznačené analyzované látky a stanovení této látky se provádí nepřímo stanovením substrátu druhého enzymu, odlišného od neznačené analyzované látky nebo stanovením produktu enzymatické přeměny neznačené analyzované látky půsbbením uvedeného druhého enzymu, kterým je adenosindeaminasa nebo adenosinkinasa.
7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že neznačenou analyzovanou látkou je adenosin.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se vzorek dále přivádí do styku s enzymem přeměňujícím adenosin a odlišným od S-adenosylhomocysteinhydrolázy a stanovení adenosinu se provádí nepřímo stanovením kosubstrátu nebo reakčního produktu přeměny adenosinu uvedeným enzymem, přeměňujícím adenosin.
9. Způsob podle nároku 8, v y z n a Č u j í c í se t í m, že enzymem, přeměňujícím adenosin je adenosinkinasa.
10. Způsob podle nároku 8, v y z n a č u j í c í se t í m , že enzymem, přeměňujícím adenosin je adenosindeaminasa.
11. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že neznačenou analyzovanou látkou je S-adenosylhomocystein.
12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11,vyznačující se tím, že se stanovení provádí na vzorku krve, plazmy nebo moči, předem zpracovaném redukčním činidlem, štěpícím disulfidovou vazbu.
13. Způsob podle některého z nároků 1 až 11,vyznačující se tím, že se stanovení neznačené analyzované látky provádí fotometricky.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že se stanovení neznačené analyzované látky provádí spektrometricky nebo kolorimetricky.
15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že se stanovení neznačené analyzované látky provádí turbidimetricky nebo nefelometricky.
16. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že se stanovení neznačené analyzované látky provádí za použití polarizace fluorescenčního světla.
17. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, 11 až 14 a 16, vyznačující se tím, že se stanovení neznačené analyzované látky provádí nepřímo detekcí chromoforu nebo fluoroforu na značeném S-adenosylhomocysteinu nebo na značeném 6-thioetheru furanosy.

-25CZ 287334 B6
18. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vzorek krve, plazmy nebo moči upravuje působením redukčního činidla, pak se uvede do styku s adenosinem a S-adenosylhomocysteinhydrolázou, výsledná směs se inkubuje a pak se uvede do styku s ATP a adenosinkinasou, inkubuje se alespoň jednu minutu, načež se uvede do styku s luciferinem a luciferasou a vznikající světlo se detekuje.
19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se vzorek krve, plazmy nebo moči upravuje působením redukčního činidla, pak se uvede do styku s adenosinem a S-adenosylhomocysteinhydrolázou, výsledná směs se inkubuje a pak se uvede do styku s adenosindeaminasou, nukleosidfosforylasou, xanthinoxidasou a peroxidázou a stanovuje se UV absorpce směsi.
20. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se vzorek uvede do styku s adenosinem a S-adenosylhomocysteinhydrolázou, výsledná směs se inkubuje a pak se uvede do styku s S-adenosylhomocysteinem, značeným fluoroforem nebo s 6-thioetherem furanosy, značeným fluoroforem, výsledná směs se uvede do styku s monoklonální protilátkou proti Sadenosylhomocysteinu a fluoroforem značená sloučenina, která váže nebo neváže protilátku, se stanoví polarizací fluorescenčního světla.
21. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se vzorek uvede do styku s adenosinem a S-adenosylhomocysteinhydrolázou, výsledná směs se inkubuje a pak se uvede do styku se značeným S-adenosylhomocysteinem, nebo se značeným 6-thioetherem furanosy, výsledná směs se uvede do styku s monoklonální protilátkou proti S-adenosylhomocysteinu, vázanou na matrici nosiče, matrice nosiče se promyje a značená sloučenina, která váže protilátku, se stanoví fotometricky.
22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se označení značené sloučeniny, která váže protilátku, podrobí reakci, vytvářející chromofor, který se pak stanoví fotometricky.
23. Způsob podle nároku 3, vyznačující se t í m , že se stanovení provádí stanovením precipitace nebo aglutinace konjugátu protilátkaipolyhapten.
24. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se jako hapten užije sloučenina obecného vzorce I ^r ₃(CH2)₃S^^u (I)

OH OH kde R, a R₂, které mohou být shodné nebo rozdílné, označují vodíkové atomy nebo skupiny OR4, anebo R! a R₂ dohromady představují atom kyslíku, R₃ představuje aminoskupinu nebo karboxylovou skupinu a R4 představuje Ci_6 alifatickou skupinu, nebo její sůl či ester.
25. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se jako hapten užije značený 6thioether furanosy, značená sloučenina zahrnuje chromofor, fluorofor nebo radioaktivní atom a thioetherovou sloučeninou je trimethylenthiosíoučenina.
26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že se jako značený thioether užije značená sloučenina obecného vzorce I podle nároku 24.

-26CZ 287334 B6
27. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako enzym užije inaktivovaná S-adenosylhomocysteinhydroláza, aktivovaná stykem s redukčním činidlem.