FI106728B - Menetelmä ja analyyttinen testipakkaus homokysteiinin määrittämiseksi - Google Patents

Menetelmä ja analyyttinen testipakkaus homokysteiinin määrittämiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI106728B
FI106728B FI943462A FI943462A FI106728B FI 106728 B FI106728 B FI 106728B FI 943462 A FI943462 A FI 943462A FI 943462 A FI943462 A FI 943462A FI 106728 B FI106728 B FI 106728B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
homocysteine
adenosine
enzyme
antibody
sample
Prior art date
Application number
FI943462A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI943462A0 (fi
FI943462A (fi
Inventor
Erling Sundrehagen
Original Assignee
Axis Biochemicals As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27266081&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI106728(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from NO920282A external-priority patent/NO920282D0/no
Priority claimed from GB929204922A external-priority patent/GB9204922D0/en
Application filed by Axis Biochemicals As filed Critical Axis Biochemicals As
Publication of FI943462A0 publication Critical patent/FI943462A0/fi
Publication of FI943462A publication Critical patent/FI943462A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI106728B publication Critical patent/FI106728B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/14—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to a sulfur, selenium or tellurium atom of a saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G01N33/5735—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Description

, 106728
Menetelmä ja analyyttinen testipakkaus homokysteiinin määrittämiseksi
Keksintö koskee menetelmää homokysteiinin määrittä-5 miseksi näytteistä sekä menetelmissä käytettävää analyyttistä testipakkausta.
Homokysteiini on aminohappovälituote, jota muodostuu metioniinin metaboloituessa kysteiiniksi. Elimistössä muodostunut homokysteiini metaboloituu yleensä nopeasti, 10 mikä tapahtuu jommallakummalla kahdesta reaktiotiestä, jotka ovat (1) kystationia muodostava kondensoituminen seriinin kanssa tai (2) muuttuminen metioniiniksi, ja sen (sekä sen hapettuneen muodon, homokystiinin) konsentraatio elimistössä on normaaleissa olosuhteissa käytännöllisesti 15 katsottuna merkityksettömän pieni.
Homokysteiinin pitoisuuksilla biologisissa näytteissä voi kuitenkin monissa tapauksissa olla kliinistä merkitystä, koska homokysteiinillä on tärkeä osa sulfhyd-ryyliaminohappoaineenvaihdunnan monimutkaisissa reaktio-20 teissä ja homokysteiinin kertyminen voi olla merkkinä monista erilaisista näissä reaktioteissä vallitsevista häiriöistä, mukaan lukien erityisesti synnynnäiset aineen-. vaihduntahäiriöt. Näin ollen esimerkiksi homokystinurian (homokysteiinin epänormaalin kertymisen virtsaan) tiede-25 tään olevan aminohappoaineenvaihdunnan häiriö, joka johtuu viallisesta kystationi-p-syntetaasi- tai metyylitetrahyd-rofoolihappometyylitransferaasientsyymistä (tämä katalysoi homokysteiinin metyloitumista metioniiniksi).
Sulfhydryyliaminohappoaineenvaihdunta liittyy lä-30 heisesti foolihapon ja B12-vitamiinin (kobalamiinin) ai neenvaihduntaan, jotka yhdisteet toimivat substraatteina tai kofaktoreina sulfhydryyliaminohappoaineenvaihduntaan liittyvissä monissa erilaisissa transformaatioissa. Tästä syystä homokysteiinin kertymisen on ehdotettu olevan myös 35 merkkinä kobalamiinista tai folaatista riippuvaisten ent- • · .
2 106728 syymien toiminnan häiriöstä tai merkkinä muista kobalamii-ni- tai folaattiaineenvaihdunnan häiriöistä tai sairauksista .
Lisäksi koska homokysteiinin muuttumiseen metio-5 niiksi tarvitaan reaktiota, jossa metyyliryhmän luovuttajan on oltava S-metyylitetrahydrofolaatti, niin homokysteiinin aineenvaihduntaan saattavat vaikuttaa myös folaa-tin toimintaa vastaan suunnatut lääkeaineet, kuten metot-reksaatti, jota annetaan muiden sairauksien, erityisesti 10 syövän, ehkäisemiseksi. Niinpä homokysteiinipitoisuuksien seurantaa on ehdotettu käytettäväksi folaatin toimintaa ehkäiseviin lääkeaineisiin perustuvissa pahanlaatuisten syöpätautien hoitojärjestelmissä.
Jo jonkin aikaa on ollut tiedossa, että veren kor-15 keat homokysteiinipitoisuudet korreloivat ateroskleroosin kehittymiseen [tätä on käsitelty julkaisussa Clarke, et ai., New Eng. J. Med 324 (1991) 1149 - 1155] ja lievääkin homokysteinemiaa pidetään nykyisin sydän- ja verisuonitautien riskitekijänä. Veren tai veriplasman homokysteiini-20 pitoisuuden määrittäminen on siten myös tärkeää verisuonitautien diagnoosissa ja hoidossa.
Vaikka homokysteiinin suoraan määrittämiseen ei ole käytettävissä immunologisia menetelmiä, mikä johtuu siitä, että homokysteiiniä vastaan suunnattua vasta-ainetta ei ·· 25 ole ollut saatavilla, niin homokysteiinin määrittämiseen kliinisistä näytteistä on ehdotettu käytettäväksi useita muita menetelmiä. Näihin kaikkiin on kuulunut kromatografisia erotusvaiheita ja yleensä ne ovat perustuneet johonkin kolmesta periaatteesta, jotka ovat: 30 (1) klassinen kromatografinen aminohappoanalyysi, (2) näytteessä olevan homokysteiinin saattaminen reagoimaan S-adenosyyli-L-homokysteiinihydrolaasient syy-min kanssa radioaktiivisella tai muunlaisella leimalla varustetun S-adenosiinikosubstraatin läsnäollessa, jonka 35 jälkeen muodostuneut tuote (S-adenosyyli-L-homokysteiini, • ♦« 106728 SAH) erotetaan ja kvantitoidaan. Yleensä käytetään kroma-' tografista erottamista (HPLC tai TLC) ja radioaktiivisuus-määrityksiä [näitä kysymyksiä on käsitelty julkaisuissa Refsum, et ai., Clin. Chem. 31 (1985) 624 - 628; Kredich, 5 et ai., Anal. Biochem. 116 (1981) 503 - 510; Chui, Am. J. Clin. Path. 90(4) (1988) 446 - 449; Totani, et ai., Biochem. Soc. 14(6) (1988) 1172 - 9; ja Schimizu, et ai., Biotechnol. Appi. Biochem. 8 (1986) 153 - 159], (3) näytteessä olevan homokysteiinin saattaminen 10 reagoimaan fluoroforin kanssa, minkä jälkeen näyte erotetaan HPLCrtä ja fluorometriaa käyttäen [tätä kysymystä on käsitelty julkaisussa Refsum, et ai., Clin. Chem. 35(9) (1989) 1921 - 1927].
Nämä menetelmät ovat aikaa vieviä ja hankalia ja 15 kaikissa niissä käytetään suoraa kvantitointia. Tarkemmin sanottuna kromatografinen erottaminen on tavanomainen piirre tekniikan tasoa edustavissa menetelmissä ja niissä tarvitaan erittäin erikoistuneita ja pitkälle kehitettyjä laitteita.
20 Tällaisia laitteita ei yleensä mielellään käytetä jokapäiväisessä kliinisessä laboratoriotyöskentelyssä, mistä syystä nämä menetelmät eivät ole tavallisesti automatisoitavissa 'tyypillisissä kliinisissä laboratoriomenetelmissä .
25 Näin ollen on olemassa tarvetta saada käyttöön sel lainen parannettu homokysteiinimääritys, joka on yksinkertainen, spesifinen, nopeasti suoritettava, helposti sovellettavissa käytettäväksi kliinisissä laboratorioissa ja jossa ennen kaikkea ei tarvitse käyttää kallista ja aikaa 30 vievää kromatografista erottamista. Tässä keksinnössä on ' ... pyritty saattamaan käyttöön tällainen määritys.
Tämän keksinnön kohteina ovat menetelmä ja testi-pakkaus homokysteiinin määrittämiseksi. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patentti-35 vaatimuksessa 1 esitetään ja testipakkaukselle se, mitä • 4 4 106728 patenttivaatimuksessa 31 esitetään. Keksinnön mukainen menetelmä käsittää vaiheet, joissa näyte saatetaan kosketukseen homokysteiiniä muuttavan entsyymin, esimerkiksi S-adenosyylihomokysteiini (SAH) -hydrolaasin, kanssa ja ai-5 nakin yhden mainitun entsyymin substraattina toimivan yhdisteen kanssa, joka ei ole homokysteiini, ja analysoitava aine, jota ei ole varustettu leimalla ja joka on homokys-teiinin kosubstraatti tai jokin niistä tuotteista, jotka muodostuvat homokysteiinin muuttuessa entsymaattisesti 10 mainitun entsyymin avulla, määritetään kromatografista erottamista (eli reagenssien tai reaktiotuotteiden erottamista) suorittamatta (edullisesti fotometrisesti).
Sitten kun näyte on saatettu kosketukseen homokysteiiniä muuttavan entsyymin ja substraatin kanssa, sitä 15 inkuboidaan ennen määrityksen seuraavien vaiheiden suorittamista edullisesti vähintään 30 sekunnin ajan ja erityisesti vähintään 5 minuutin ajan.
Tämän keksinnön mukaisessa määrityksessä käytetty homokysteiiniä muuttava entsyymi on erityisen edullisesti 20 SAH-hydrolaasi, mutta siinä on mahdollista käyttää muitakin entsyymejä. Mainitsemisen arvoisia entsyymejä ovat siten esimerkiksi betaiini-homokysteiinimetyylitransferaa-si ja muut homokysteiinin muuttumisreaktioihin liittyvät entsyymit [näitä on kuvattu esimerkiksi julkaisussa ·· 25 Graham, Trends in Cardiovasc. Med. 1 (1991) 244 - 249].
Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä määritettävä homokysteiinin kosubstraatti on yhdiste, joka reagoi homokysteiinin kanssa entsyymin katalysoimassa homokysteiinin muuttumisreaktiossa, esimerkiksi SAH-hydrolaasin 30 katalysoimassa reaktiossa.
... Tässä keksinnössä termi "määrittäminen" tarkoittaa m sekä kvantitatiivista että kvalitatiivista määrittämistä siinä mielessä, että tämä tuottaa näytteessä olevan analysoitavan aineen, esimerkiksi homokysteiinin kosubstraatin, 35 määrää tai pitoisuutta osoittavan absoluuttisen arvon ja • « 5 106728 että tämä tuottaa myös kertoimen, suhdeluvun, prosenttiosuuden tai visuaalisen tai jonkin muunlaisen näytteessä olevan analysoitavan aineen pitoisuuteen viittaavan arvon. Määrittäminen voi tapahtua suoraan tai epäsuorasti ja var-5 sinaisen havaitun kemiallisen yhdisteen ei luonnollisestikaan tarvitse olla itse analysoitava yhdiste vaan se voi olla esimerkiksi analysoitavan aineen johdannainen tai jokin muu yhdiste, kuten tuonnempana olevasta tarkastelusta käy ilmi.
10 Tämän keksinnön mukaisessa määrityksessä analysoi tavan aineen määritykseen käytetään tarkoituksenmukaisia menetelmiä, jotka ovat joko entsymaattisia tai immunologisia. Yhdessä edullisessa entsymaattisessa menetelmässä analysoitava aine saatetaan kosketukseen sellaisen toisen 15 entsyymin kanssa, jonka substraattina analysoitava aine toimii, ja määrityksessä määritetään joko kosubstraätti tai sellainen suora tai epäsuora reaktiotuote, joka on muodostunut tutkittavan yhdisteen entsymaattisesta muuttumisesta tämän toisen entsyymin avulla. Edullisessa immuno-20 logisessa menetelmässä analysoitava aine määritetään käyttäen menetelmää, jossa käytetään analysoitavan aineen ja toisen hapteenin (esimerkiksi polyhapteenin tai analysoitavan aineen leimalla varustetun analogin) kilpailevaa sitoutumista vasta-aineeseen ja sitoutuneen tai sitoutu- ♦· 25 mattoman hapteenin määrittämistä.
Tämän keksinnön mukainen edullisesti käytettävä homokysteiiniä muuttava entsyymi on S-adenosyylihomokys-teiinihydrolaasi (SAH-hydrolaasi) , joka katalysoi homokys-teiinireaktiota, 30 joka on reaktio, jonka tasapainovakio K on 106 M"1.
• · S-adenosyyli-homo- adenosiini + homokysteiini kysteiini (SAH) joka on reaktio, jonka tasapainovakio K on 106 M'1.
35 • l 6 106728
Reaktio voidaan suorittaa kumpaan suuntaan tahansa reaktio-olosuhteiden, lähtöaineiden konsentraation, ja niin edelleen, mukaan.
Edellä kuvatussa kaaviossa homokysteiinin kosub-5 straattina on adenosiini. Tämän keksinnön mukaisessa määritysmenetelmässä on kuitenkin mahdollista käyttää muitakin kosubstraatteja, kuten adenosiinin analogeja tai niitä vastaavia yhdisteitä.
Tämän keksinnön mukaisessa määrityksessä voidaan 10 käyttää hyväksi erityisesti sitä tosiseikkaa, että homo-kysteiini toimii SAH-hydrolaasin inhibiittorina ja estää homokysteiiniä ja adenosiinia muodostavaa hydrolyysireak-tiota ja vie reaktiotasapainoa SÄH:n synteesin suuntaan.
Näytteessä oleva homokysteiinimäärä vaikuttaa siten 15 epäsuorasti SAH-hydrolaasin aikaansaamaan homokysteiinin kosubstraatin, esimerkiksi adenosiinin, muodostumiseen tai kulutukseen ja tämän välityksellä myös lopulliseen kosub-straattikonsentraatioon reaktioseoksessa. Tässä keksinnössä voidaan homokysteiinin kosubstraatin, esimerkiksi ade-20 nosiinin, lopullista konsentraatiota tai konsentraation muutosta reaktioseoksessa käyttää näytteessä alunperin olleen homokysteiinin konsentraation indikaattorina. Niinpä silloin kun analysoitavana aineena on kosubstraatti, niin tämän keksinnön mukainen määritys eroaa tekniikan ·· 25 tason mukaisista menetelmistä siinä, ettei homokysteiiniä määritetä suoraan vaan epäsuorasti määrittämällä sen kosubstraatin konsentraatio entsyymin katalysoimassa homokysteiinin muuttumisreaktiossa. Tällä on se välitön etu, että on mahdollista käyttää havaitsemismenetelmiä, esi-30 merkiksi fotometrisiä menetelmiä, jotka soveltuvat tyypil- lisiin kliinisessä laboratoriossa suoritettaviin toimen-piteisiin mutta joita ei ole voitu käyttää tekniikan tason mukaisissa menetelmissä, mikä tekee tämän keksinnön mukaisesta menetelmästä erityisen sopivan päivittäiseen kliini-35 seen käyttöön.
• i 7 106728 Tämän keksinnön mukaisessa edullisessa määritysmenetelmässä SAH-hydrolaasireaktiota voidaan käyttää kumpaankin suuntaan. Niinpä jos tutkittava näyte saatetaan kosketukseen adenosiinin ja SAH-hydrolaasin kanssa, niin 5 tässä kuluu kuluneen homokysteiinin määrää vastaava määrä adenosiinia ja näytteessä olleen homokysteiinin määrä voidaan siten määrittää adenosiinin konsentraation muutoksesta. Varsinaisen adenosiinin tilalla voidaan käyttää adeno-siinianalogeja ja/tai adenosiinia muodostavia yhdisteitä. 10 Muissa tämän keksinnön mukaisissa edullisissa so- vellutusmuodoissa voidaan käyttää vastakkaiseen suuntaan kulkevaa reaktiota. Tutkittava näyte voidaan saattaa kosketukseen SAH:n (jota on yleensä ylimäärin) ja SAH-hydrolaasin kanssa. SAH:n hydrolysoitumisesta muodostuu sitten 15 homokysteiiniä ja adenosiinia. Mikäli tutkittavassa näytteessä on pienikin määrä homokysteiiniä, se vaikuttaa tätä nettoreaktiota vastaan ja inhiboi siten adenosiinin muodostumista, jonka yhdisteen määrää seurataan.
Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäviä 20 SAH-hydrolaasin substraatteja voivat siis olla SAH tai adenosiini tai niiden analogit ja prekursorit.
Elimistön sulfhydryyliaminohappoaineenvaihdunnan ja transmetylaatioreaktioiden monimutkaisiin reaktiosarjoihin liittyy monia entsyymejä. Näimä reaktiotiet ja reaktiot ·· 25 ovat perusteellisesti tutkittuja, minkä ohella on tutkittu kyseessä olevien entsyymien osuutta reaktioiden säätelyssä. Yhden tällaisen entsyymin, SAH-hydrolaasin, osuutta on käsitelty Uelandin laatimassa katsauksessa Pharmacological Reviews 34 (1982) 223 - 253. Julkaisussa Trewyn, et ai., 30 J. Biochem. Biophys. Met. 4 (1981) 299 - 307, on kuvattu ' tutkimus, joka koskee SAH:n osuutta säätelyssä ja siitä on * saatu käyttöön määritys SAH-hydrolaasin entsymaattisen aktiivisuuden määrittämiseksi. Julkaisussa Garras, et ai., Analytical Biochem. 199 (1991) 112 - 118, on kuvattu muita 35 homokysteiinin reaktioteitä ja tästä on saatu erityisesti • « j 8 106728 käyttöön määritys, jossa määritetään metioniinisyntaasin välityksellä tapahtuvaa homokysteiinin muuttumista. Kuten aikaisemmin mainittiin, Grahamin julkaisussa (edellä) on kuvattu muita entsyymin välittämiä homokysteiinin muuttu-5 misreaktioita. Näiden useiden erilaisten reaktioiden ko-substraatteja ja muuttumistuotteita voidaan käyttää analysoitavina aineina tämän keksinnön mukaisessa määrityksessä varsinkin immunologista määrityskeinoa käytettäessä.
Tämän keksinnön mukaisesti määritettävät kliiniset 10 näytteet voivat olla peräisin mistä tahansa biologisesta nesteestä tai kudosuutteesta ja ne voidaan esikäsitellä ennen määritystä. Yleensä kuitenkin käytetään veriplasma-tai virtsanäytteitä.
Merkittävä osa veriplasmassa tai virtsassa olevasta 15 homokysteiinistä voi olla sitoutuneena disulfidisidosten välityksellä kiertävän veren proteiineihin, kuten albumiiniin, ja homokysteiini voi esiintyä myös muiden disulfidi-johdannaisten muodossa (yleensä homokysteiini-kysteiini-konjugaatteinä). Näytteessä olevan homokysteiinin koko-20 naismäärän arvioimiseksi voi olla tarpeellista käsitellä näyte pelkistimellä disulfidisidosten pilkkomiseksi ja vapaan homokysteiinin vapauttamiseksi.
Disulfidit pelkistyvät helposti ja spesifisesti tioleilla [esimerkiksi ditiotreitolilla, (DTT), ditio- ·· 25 erytritolilla (DTE), 2-merkaptoetanolilla, kysteiinitio- glykolaatilla, tioglykolihapolla, glutationilla ja muilla näitä vastaavilla yhdisteillä]. Yhdisteet voidaan pelkistää suoraan kemiallisesti boorihydrideillä (esimerkiksi natriumboorihydridillä) tai amalgaameilla (esimerkiksi 30 natriumamalgaamilla) tai on mahdollista käyttää erityis-reagensseja, kuten fosfiineja tai fosforotioaatteja. Katsauksen disulfidien pelkistykseen on laatinut Jocelyn, Methods of Enzymology 143 (1987) 243 - 256, jossa jul kaisussa on lueteltu suuri määrä sopivia pelkistimiä.
35 Adenosiini tai muut homokysteiinin kosubstraatit voidaan määrittää tunnetuilla menetelmillä. Edullisia me- * i « 106728 netelmiä ovat yleensä fotometriseen (esimerkiksi kolori-metriseen, spektrofotometriseen tai fluorometriseen) havaitsemiseen perustuvat menetelmät ja immunologiset menetelmät, koska nämä menetelmät voidaan erityisen helposti 5 soveltaa kliinisissä laboratorioissa käytettäväksi. Entsy-maattiseen reaktioon tai mono- tai polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa tapahtuvaan reaktioon perustuvat menetelmät ovat erityisen edullisia, koska nämä ovat yksinkertaisia ja nopeita ja niitä voidaan käyttää suhteellisen pie-10 nin kustannuksin. Analysoitava aine voidaan siten esimerkiksi määrittää seuraamalla analysoitavan aineen reaktiota käyttäen entsyymejä, jotka muuttavat tämän suoraan tai epäsuorasti fotometrisesti, esimerkiksi spektrofotometrisesti, havaittavissa oleviksi tuotteiksi. Sopivia entsyy-15 mejä, joiden ei luonnollisestikaan pidä reagoida muiden homokysteiiniä muuttavien entsyymin substraattien, erityisesti homokysteiinin, kanssa, ovat adenosiinideaminaasi (tämä muuttaa adenosiinin inosiiniksi) ja adenosiinikinaa-si (tämä muuttaa adenosiinin ja ATP:n ADP:ksi ja fosfory-20 loiduksi adeosiiniksi). Tällaisia entsyymejä voidaan lisäksi käyttää yhdessä toisten sellaisten entsyymien kanssa, joiden vaikutuksesta muodostuneet tuotteet muuttuvat muiksi havaittaviksi tuotteiksi.
Esimerkkeihin immunologisista menetelmistä voisivat - 25 kuulua menetelmät, joihin liittyy analysoitavan aineen saattaminen reagoimaan itselleen spesifisten vasta-aineiden kanssa, jotka ovat määritettävissä joko sellaisenaan tai jotka voidaan määrityksessä, esimerkiksi kerrosmääri-tyksessä, saattaa reagoimaan edelleen niin, että tästä 30 muodostuu havaittavia tuotteita. Yhdessä erityisen kiin-' * nostavassa immunologisessa menetelmässä käytetään kuiten kin analysoitavan aineen, edullisesti kosubstraatin, fluo-roforileimalla varustettua analogia, jollainen on esimerkiksi fluoreskeiinileimalla varustettu adenosiini - tämä 35 ja analysoitava aine, jota ei ole varustetu leimalla, voidaan saattaa kosketukseen analysoitavalle aineelle sovel- « 10 1C6728 tuvan vasta-aineen kanssa. Jos tulokseksi saadulle tuotteelle tehdään fluoresenssipolarisaatiomääritys käyttäen polaroitua virityssäteilyä, niin leimalla varustamattoman analysoitavan aineen konsentraatiota kuvaava tulos on joh-5 dettavissa fluoresoivan säteilyn depolarisaatioasteesta.
Adenosiinivasta-aineita on kaupallisesti saatavilla (esimerkiksi yhtiöistä Paessel & Lorei Gmbh, Frankfurt, Saksa, ja Serotech Ltd., Oxford, UK) ja fluoresenssipolarisaatio-immunomääritys (FPIA) -menetelmät ovat tunnettuja (näitä 10 on käsitelty esimerkiksi patenttijulkaisuissa US-A- 4 420 568 ja US-A-4 593 089 sekä muissa Abbot Laboratories -yhtiön julkaisuissa, jotka liittyvät yhtiön TDx-menetel-miin).
Esimerkkeihin tämän keksinnön mukaisessa määrityk-15 sessä käyttökelpoisista havaitsemiskaavioista kuuluvat kaaviot, jotka ovat: (1) adenosiini + vasta-aine fluoreskeiinilei- havaitseminen ^ U ^ maila varustet- FPIA:11a tu adenosiini (2) adenosiini -> inosiini + NH3 25 adenosiini-de-aminaasi 30 106728 (3) adeno- ino- siini -> siini -> adenosiini- piiriini— g deaminaasi nukleosidi- fosforylaasi hypo- 02 H202 02 H202 ksan- ksan- ^ r virtsa- tiini -> tiini -> happo 10 ksantiini- ksantiini- oksidaasi oksidaasi (4) adenosiini- kinaasi
-*-5 adenosiini + ATP -> adenosiini-5'-P + ADP
yhdessä kilpailevan kemiluminesenssi-ATP-reaktion kanssa, esimerkiksi 20 ATP + lusiferiini lusiferaasi oksilusiferiini + PPX+ + 02 -> AMP + C02 + valoa tai sellaisen fluoroforileimalla varustetun adenosiinin kanssa, joka kilpailee ATP/adenosiinikinaasista, määrityk-25 sen tapahtuessa fluoresenssipolarisaatiomäärityksellä.
Kaavioiden (2) ja (3) ollessa kyseessä on inosii-nilla ja virtsahapolla omat selvästi erottuvat UV-absorp-tio-ominaisuutensa ja tästä syystä niitä voidaan seurata spektrofotometrisesti kineettisillä määrityksillä.
30 Virtsahapon tai inosiinin havaitsemiseen UV:llä liittyy kuitenkin tiettyjä rajoituksia siinä mielessä, että menetelmän herkkyys on melko heikko ja siinä vaaditaan UV-valon lähdettä ja UV-säteilyä läpäisevä näyteastia. Näin ollen saattaa olla tarkoituksenmukaisempaa käyt-35 tää kolorimetristä havaitsemista tai elektronisia anturei- 12 106728 ta ja tällaisten menetelmien, erityisesti kolorimetrian, käyttö on yleensä suosittua kliinisissä laboratorioissa.
Tässä yhteydessä on reaktiokaavio (2) erityisen käyttökelpoinen, koska adenosiinideaminaasireaktiossa muo-5 dostunut ammoniakki voidaan helposti tunnistaa tunnetuilla kolorimetrisillä menetelmillä. Näytteessä muodostunut ammoniakki voidaan siten esimerkiksi saattaa reagoimaan sillä tavoin, että tästä muodostuu värillisiä tuotteita, joiden muodostuminen voidaan havaita spektrofotometrisesti. 10 Yksi tällainen menetelmä, joka on kuvattu teoksessa Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer) 1 (1970) 1049 -1056, perustuu ammoniakin reaktioon fenolin kanssa hypokloriitin läsnäollessa aikalisissä olosuhteissa, jolloin muodostuu värillistä indofenoliväriainetta: 15 NH, . OC , ,0-OH __
Ne2|F*{CN)sNO) 20 Katalyyttinä voidaan käyttää natriumnitroferrisya- nidia. Voidaan myös käyttää menetelmästä tehtyjä muunnelmia, joissa käytetään esimerkiksi useita erilaisia fenoli-j ohdannaisia.
Värillistä lopputuotetta muodostuu määrinä, jotka . · 25 ovat suoraan verrannollisia ammoniakin konsentraatioon ja siten siis adenosiinin konsentraatioon näytteessä.
Kaavion (3) ollessa kyseessä on ksantiinioksidaasi-reaktio omiaan fluorogeenisten tai kromogeenisten yhdisteiden, esimerkiksi hapettuspelkistysindikaattorien, avul-30 la tapahtuvaan havaitsemiseen, joka tapahtuu hapetuspel-kistyspotentiaalin määrityksen avulla, 02:n kulumisen määrityksen tai tarkemmin sanottuna H202:n muodostumisen määrityksen avulla käyttäen esimerkiksi elektronisia antureita. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää monia redoks-indi-35 kaattoreita ja tämän alan ammattikirjallisuudessa on kuvattu monia erilaisia menetelmiä H202:n ja 02:n määrittämi- 13 106728 seksi liuoksesta. H202:n havaitsemista käytetäänkin usein kliinisissä määrityksissä.
Sopivia hapettuspelkistysindikaattoreita ovat mety-leenisini, 2,6-dikloorifenoli, indofenoli ja monet erilai-5 set redoks-indikaattorit, joita on lueteltu julkaisun Kodak Laboratory & Research Products, tuoteluettelon nro 53 taulukossa 1, vaikka luonnollisesti voidaan käyttää muitakin indikaattoreita. Hapetuspelkistysreaktioiden nopeuttamiseksi voidaan seoksiin lisätä entsyymejä, joilla on per-10 oksidaasiaktiivisuutta, esimerkiksi piparjuuriperoksidaa- sia.
Jos halutaan käyttää saostuvaa kromogeeniä, niin MTT-tetratsoliumia voidaan käyttää yhdessä ksantiinioksi-daasin tai muiden samanlaisten entsyymien kanssa. Käyttä-15 mällä saostuvaa kromogeenistä tai fluorogeenista yhdistettä voidaan saada lukema immobilisoituneesta väristä tai fluoresenssista visuaaliseksi osoitukseksi homokysteiini-konsentraatiosta.
Kaaviossa (4) adenosiinin konsentraation määrittä-20 miseen käytetään kemiluminesenssiin perustuvaa ATP-reak- tiota. Kemiluminesenssiin perustuvilla määrityksillä on suuret käyttömahdollisuudet niillä saavutettavan matalan havaitsemisrajän ja tarvittavien laitteiden suhteellisesta yksinkertaisuuden johdosta. Kemiluminesenssireaktioita .V 25 voidaan käyttää analysoitavien aineiden, kuten ATP:n tai H202:n, havaitsemiseen ja yksi näistä tehokkaimmista ja parhaiten tunnetuista reaktioista on tulikärpäsen biolumi-nesenssireaktio 30 ATP + lusiferiini lusiferaasi oksilusiferiini + PP* * + 02 -> + ATP + C02 + valoa
Tulikärpäsen lusiferiini on rakenteeltaan bentso-tiatsoli, mutta on saatavilla myös muista biologisista 35 lähteistä peräisin olevia lusiferiinejä, joilla on toisen- 14 106728 lainen rakenne. Analyyttisiä tarkoituksia varten ATP, lu-siferiini tai lusiferaasi voidaan määrittää suoraan tätä reaktiota käyttäen. Niissä tapauksissa, joissa syntyy H202:ta, kuten esimerkiksi kaavion (3) mukaisessa reaktios-5 sa, voidaan käyttää toista kemiluminesenssireaktiota, joka on vetyperoksidaasin katalysoima luminolireaktio (luminoli on 5-amino-2,3-dihydroftalatsiini-l,4-dioni), jossa syntyy 425 nm:n aallonpituista valoa.
Esimerkiksi kaavion (3) mukaisesta reaktiosta pe-10 räisin oleva vetyperoksidi voidaan myös määrittää käyttäen peroksioksalaatin ja akridiiniesterien ei-entsymaattisia kemiluminesenssireaktioita, joista viimeksi mainittujen yhdisteiden ollessa kyseessä reaktio tapahtuu vesipitoisessa liuoksessa neutraalissa pH:ssa.
15 Kaaviossa (4) kuvattu fluoroforileimalla varustetun adenosiinin käyttö ja sen määrittäminen fluoresenssipola-risaatiomäärityksellä on mahdollista, koska adenosiiniki-naasin substraattispesifisyys on suhteellisen laaja-alai-nen. Tätä laaja-alaista spesifisyyttä voidaan lisäksi 20 käyttää hyväksi endogeenisen adenosiinin (tai muiden ade-nosiinikinaasin nukleosidisubstraattien) vaikutuksen kompensoimiseen lisäämällä näytteeseen esikäsittelyvaiheeksi adenosiinikinaasia, joka lisätään edullisesti yhdessä pel-kistimen (esimerkiksi DTT:n) kanssa.
.« 25 Tällainen näytteen entsymaattinen esikäsittely on haluttua, koska monissa tämän keksinnön mukaisissa sovellut usmuodoi s sa analysoitavaa ainetta (esimerkiksi adeno-siinia) on ennestään näytteessä vaihtelevia määriä, mikä on siten määrityksen mahdollinen virhelähde. Analysoitavan 30 aineen taustaa voidaan kompensoida tekemällä määritys * osalle näytteestä käyttämättä homokysteiiniä muuttavaa entsyymiä (esimerkiksi SAH-hydrolaasia); tämä toimenpide-sarja on kuitenkin aikaa vievä ja se hankaloittaa määritystä.. Toisena vaihtoehtona on esikäsitellä näyte endogee-35 nista analysoitavaa ainetta muuttavalla tai sen poistavalla aineella, esimerkiksi entsyymillä, kuten adenosiini-kinaasilla, tai adenosiinitaustan poistavalla adenosiini- 15 106728 deaminaasilla. Jotta voitaisiin välttää suoritettavaan määritykseen vaadittavan ajan tarpeetonta pidentymistä, tämä näytteen käsittely voidaan, kuten edellä on jo mainittu, tehdä tarkoitustaan vastaavasti samalla kertaa kun 5 näytettä käsitellään pelkistimellä homokysteiinin vapauttamiseksi .
Analysoitavan aineen määritykseen voidaan spektro-fotometristen tai kolorimetristen menetelmien lisäksi käyttää muita fotometrisiä menetelmiä. Käytettäväksi sopi-10 vista menetelmistä käyttökelpoisimpiin kuuluvat partikkeli agglutinaatio- ja immunosaostusmenetelmät. Jos käytetään polyklonaalisia vasta-aineita, niin voidaan käyttää suoraa partikkeliagglutinaatiota tai suoraa immunosaostusta, vaikkakaan tämä menetelmä ei yleensä ole edullinen silloin 15 kun homokysteiiniä muuttavana entsyyminä käytetään SAH-hydrolaasia. On kuitenkin mahdollista käyttää saostumisen inhibitiomenetelmiä tai partikkeliagglutinaation inhibi-tiomenetelmiä. Nämä menetelmät perustuvat sellaisten vasta-aineen ja hapteenin muodostamien yhdistelmien käyttöön, 20 jotka yhteenliittymisen tapahduttua saavat aikaan saostumisen tai partikkelien aggregaation, joka voidaan havaita turbidimetrisellä tai nefelometrisellä määrityksellä. Kun analysoitava aine, esimerkiksi SAH, inhiboi vasta-aineen ja hapteenin kompleksin muodostumista, niin SAH-pitoisuus , ·; 25 voidaan määrittää saostumisen tai aggregoitumisen vähene misestä. Reaktio voidaan esittää seuraavalla tavalla
Vasta-aine hapteeni kompleksin-muo- (vaihtoehto!- (edulli- dostus (saostu- 30 sesti partikke- + sesti —> minen tai par- liin sitoutu- poly-hap- tikkelien aggre- neena) teeni) gaatio) .Silloin kun tämän keksinnön mukainen määritys teh-35 dään käyttäen SAH-hydrolaasia homokysteiiniä muuttavana entsyyminä, niin on edullista joko varastoida SAH-hydro-laasi yhdessä pelkistimen kanssa tai käsitellä se pelkis- 106728 timellä ennen sen käyttöä määrityksessä. On havaittu, että muunlainen varastointi saa aikaan SAH-hydrolaasin inakti-voitumisen ja tämä pelkistimen käyttö joko estää varastoinnin aikana tapahtuvan inaktivoitumisen tai saa aikaan 5 ennen käyttöä tapahtuvan uudelleen aktivoitumisen.
Voidaan käyttää useita erilaisia pelkistimiä (esimerkiksi DTTrtä, kysteiiniä, merkaptoetanolia, ditioery-tritolia, natriumboorihydridiä ja niin edelleen), joista kuitenkin DTT on erityisen sopiva esimerkiksi noin 5-mil-10 limolaarisessa konsentraatiossa käytettynä. Itse DTT on varastoitava matalassa pH-arvossa ja voi siten olla asiaankuuluvaa käyttää määrityspakkauksessa DTT-liuosta, joka pH on matala (esimerkiksi noin 3) mutta jossa on vähän puskurikapasiteettia, ja erillistä SAH-hydrolaasia 15 sisältävää liuosta, joka voi olla osittain tai kokonaan inaktiivista, jonka pH on olennaisesti neutraali ja joka on edullisesti puskuroitu. Kun nämä liuokset yhdistetään, niin entsyymi aktivoituu uudelleen neutraalissa pH:ssa. Osat voidaan haluttaessa yhdistää toisiinsa tutkittavan 20 näytteen läsnäollessa tai siten, että tutkittava näyte lisätään seokseen pian tämän jälkeen, jotta homokysteiini saadaan samalla vapautettua. Muita edellä mainittuja pelkistimiä voidaan käyttää samalla tavoin sekä SAH-hydrolaasin stabilointiin tai aktivointiin että näytteen pelkistä-25 miseen homokysteiinin vapauttamiseksi.
Pelkistimen käyttö inaktivoituneen SAH-hydrolaasin uudelleenaktivointiin on vielä yksi tämän keksinnön kohde. Lisäksi vielä yhdessä tämän keksinnön kohteessa siitä saadaan käyttöön testipakkaus, joka käsittää ensimmäisessä 30 osastossa olevan inaktiivisen SAH-hydrolaasin ja toisessa osastossa happamessa (esimerkiksi pH-arvossa 3) väliaineessa olevan pelkistimen, esimerkiksi DTT:n. Tätä testi-pakkausta käyttämällä voidaan SAH-hydrolaasi sekoittaa pelkistimeen ja aktivoida se tällä tavoin uudelleen välit-35 tömästi ennen sen käyttöä määrityksessä.
• 17 106728
On mahdollista käyttää hyödyksi muita lisäaineita edistämään SAH-hydrolaasin pysyvyyttä varastoinnin aikana tai varsinaisessa määrityksessä. Näitä aineita ovat NAD+, glutationi, polyhydriset alkoholit ja sokerit (esimerkiksi 5 inositoli, sorbitoli, ksylitoli, erytritoli, glyseroli, etyleeniglykoli, sakkaroosi, laktitoli ja niin edelleen), liukoiset polymeerit, kuten tietyt dekstraanit, sekä proteiinit (esimerkiksi kantajaproteiinit).
Silloin kun tämän keksinnön mukaisessa määritykses-10 sä käytetään vasta-aineita, niin ne voivat olla polyklo-naalisia mutta ne ovat edullisesti monoklonaalisia. Jos haluttuja vasta-aineita ei ole valmiiksi kaupallisesti saatavilla, niin niitä voidaan valmistaa tavanomaisilla menetelmillä. Eläimissä tai hybridoomissa voidaan siten 15 valmistaa joko monoklonaalisia tai polyklonaalisia vasta-aineita esimerkiksi James Gooding'in teoksen "Monoclonal Antibodies, principle and practice", Academic Press, Lontoo 1983, luvussa 3 kuvatulla tavalla. Monokloonaaliset muodot on lajiteltava sellaisten kloonien valikoimiseksi, 20 joilla on kyky erottaa haluttu hapteeni muista entsyymi (e) n substraateista, mikä tehdään esimerkiksi sellaisten kloonien valikoimiseksi, joilla on kyky erottaa adenosiini SAHrsta. Ainoastaan analysoitavan aineen (esimerkiksi SAH:n) kanssa reagoivat polyklonaaliset vasta-aineet on .1 25 puhdistettava ristireagoivien vasta-aineiden poistamisek si, eli sellaisten vasta-aineiden poistamiseksi, jotka reagoivat muiden substraattien kuin analysoitavan aineen, esimerkiksi sekä adenosiinin että SAH:n, kanssa. Tämä voidaan tehdä käyttäen affiniteettikromatografiaa, esimerkik-30 si käyttämällä immobilisoitua adenosiinia analysoitavan aineen ollessa SAH.
Vasta-aineen valmistuksessa käytetään kapteenina joko varsinaista analysoitavaa ainetta tai toista molekyyliä, joka sisältää sellaisen osan analysoitavasta ainees-35 ta, jonka on katsottava olevan kaikkein asianmukaisin si- « w 18 106728 toutuva alue, jollainen on esimerkiksi entsyymireaktioon osallistuvista alueista etäällä oleva alue. On asiaankuuluvaa konjugoida hapteeni makromolekyyliin, kuten BSA:han tai hemosyaniiniin. SAH:n kyseessä ollessa haluttu 5 epitooppi on edullisesti tioeetterisillan kohdalla tai sen läheisyydessä ja vaikka voidaankin käyttää varsinaista SAH:ta NH.
L 2
N-If^N
10 HOOCCHfNhycHjCHjSCHj
OH OH
15 makromolekyyliin konjugoituna, niin on edullista käyttää "yksinkertaistettua" molekyyliä, kuten molekyyliä, jolla on kaava (I) R3(CHj)aSCH2 R] 20 K» 'H/’ (I) H f—1 R2
OH OH
{jossa Rj ja R2, jotka voivat olla samanlaiset tai erilaiset, ovat vetyatomeja tai 0R4-ryhmiä [jossa R4 on alempi *’ 25 (esimerkiksi Cj. . 6, erityisesti Cx _ 4) alifaattinen ryhmä, kuten alkyyliryhmä, edullisesti metyyli- tai etyyliryhmä] tai Rx ja R2 edustavat yhdessä happiatomia ja R3 on amiini-tai karboksyyliryhmä}, tai sen suolaa tai esteriä (esimerkiksi esteröitynä Ct.4-alkanoliin), joka tässäkin tapauk- 30 sessa on liitetty makromolekyyliin.
r 19 106728
Esimerkkejä sellaisista kaavan I mukaisista yhdisteistä, joita voidaan käyttää hapteeneina, ovat siten h2N(CH2)3SCH2 h jcm
OH OH
h^ch^scHj, OCh8 10 JOi '
OH OH
H2N(CH2)3SCH2
15 .OH OH
HOOC(CH2)3sCH2 h fföi
OH OH
20 hooo(gh2)3sch2 o ja
OH OH
HOOCiCH^sCH,
25 I
\H IV00 OH OH
Tällaiset "yksinkertaistetut" rakenteet voidaan myös ottaa 30 käyttöön sellaisten edellä mainittujen leimalla varustet-tujen analogien kyseessä ollessa, joita käytetään määrityksissä, joissa analysoitava aine ja leimalla varustettu analogi osallistuvat kilpailevaan sitoutumisreaktioon vasta-aineen kanssa. Signaalia muodostava molekyyli R*, joka 35 voi olla jokin fluorofori, jokin kromofori, jokin radioak- 20 106728 tiivinen leima, jokin entsyymaattinen, jokin kemilumine-soiva tai jokin muunlainen immunomäärityksissä tavanomaisesti käytetty leima, voidaan siten konjugoida analysoitavaan aineeseen, mistä on esimerkkinä R*-SAH, tai yksinker-5 taistettuun epitoopin sisältävään molekyyliin, mistä on esimerkkinä R*CH2CH2CH2SCH2 r KH H> 10 ^ ΓΙ R2
OH OH
Nämä leimalla varustetut ryhmät voidaan luonnollisesti haluttaessa liittää partikkeleihin, polymeereihin, 15 proteiineihin tai muihin materiaaleihin.
Leimalla varustetut furanoosi-6-tioeetterit ja kaavan I mukaiset yhdisteet ovat uusia ja ne ovat vielä muita tämän keksinnön kohteita.
Vielä yhdeltä osin tarkasteltuna tästä keksinnöstä 20 saadaan käyttöön menetelmä kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, joka mainittu menetelmä käsittää ainakin yhden vaiheista, jotka ovat:
(a) saatetaan yhdiste, jolla on kaava II
25 hsch2 p ‘ θ"ΐ \H H/ (l!) H I-1 R2
R5 K
30 5 0
(jossa Rt ja R2 ovat edellä esitetyn kuvauksen'mukaiset ja kukin ryhmistä R5 on suojattu hydroksyyliryhmä tai molemmat R5-ryhmät ovat yhdessä alkyleenidioksiryhmä (eli suojattu bis-hydroksiryhmä, kuten -0C(CH3)20-), reagoimaan sellaisen 35 propyylihalogenidin kanssa, jolla on kaava III
« 21 106728 R6(CH2)3Hal (III) (jossa R6 on R3-ryhmä tai suojattu R3-ryhmä ja Hai on halo-geeniatomi, esimerkiksi bromiatomi), jonka jälkeen poiste-5 taan haluttaessa mitkä tahansa suojaavat ryhmät; (b) (sellaisen kaavan I mukaisen yhdisteen muodos tamiseksi, jossa R3 on aminoryhmä) saatetaan kaavan II mukainen yhdiste reagoimaan akryylinitriilin kanssa ja pelkistetään saatu propyylitioeetterituote ja poistetaan siilo tä suojaavat ryhmät; ja (c) esteröidään sellaisen kaavan I mukainen yhdiste, jossa R3 on karboksyyliryhmä.
Kaavan III mukaisia lähtöaineita voidaan valmistaa tavanomaisilla menetelmillä tai ne ovat tunnettuja ämmät-15 tikirjallisuuden perusteella. Kaavan II mukaisia lähtöaineita voidaan valmistaa vastaavista 1-hydroksimetyylifura-nooseista menetellen niin, että suojataan cis-hydroksiryh-mä, suoritetaan bromaus, minkä jälkeen tuote saatetaan reagoimaan tiourean kanssa ja tuote hydrolysoidaan. 1-hyd-20 roksimetyylifuranoosien cis-hydroksiryhmä voidaan suojata saattamalla ne reagoimaan tavanomaisten hydroksiryhmää suojäävien aineiden, esimerkiksi asetonin, kanssa.
Esimerkkeihin kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistukseen käytetyistä reaktiokaavioista (yhdisteet (1) ja ·· 25 (3) ovat kaupallisesti saatavilla olevia yhdisteitä) kuu luvat kaaviot, jotka ovat: 22 106728
(A) HO—j 0 OCH3 HO—, H
<M H> (CH^SiOSQ2CH3 ^ ^
H - H ^^3-(^2^5)2^ H^-j H
OH OH OH OH
5 ^ ' (2) HO~| °
Ch η>=0 hN—/ OH OH (3) 1.0 (B) HO— n R, HO— 0 R1 ^°\J H* ' i5 -=~ °HOH (5) °^° (4) (esimerkiksi (1) , * ·
(2) tai (3)) X X
(°) CBr4/p(CeH5)3 Brn^°\|Rl 20 (5) -- |\H H/
Kuiva eetteri H N-Y R„ <Κ/0 te) /\
LIO_ P
25 (°) Ä 1. SC(Nl·^) / / EtOH n^°\J1 (6) -- |Ch H/ 2.^0/OH H j-\ r2
(7, X
30 (E) S* XL ' R1 CHgO'/CHgOH ^ ^ ^ h>4V' 35 S^0 (8) /\ 23 106728 (F) NC(CH^3s—, o Π, <8, CH*CHCN-- O. o
5 «9 X
(G) H2N(CH*S—| 0 R, 1.UAJH,/kuiva eetteri 'jX? (9) - ► hN—Y\
10 (10) OH OH
(H) C2H5OCO(CH2)3S—| 0 R, 15 (8) Br(CH3>3CQOC*"s .
°\/°
(1.) X
(I) HoocfcH^s—| _ n, 20 1. OH / dioksaani \H H/j (11) -1-- H |-Y R2
2.H^/H,0 OH OH
(12)
/j\ O
' ' N-hydroksi- Jj ’·; 25 sukkinimidi __ (12) -- [ n_oco(ch2)3s— n R,
Disykloheksyyli- X/ karbodi-i”*i<3i 1¾1 v H Ηχ|
Dimetyyliformamidi O H N-K
(13) OH OH
30 Reaktioseoksessa olevien aineiden, jotka on mahdollisesti saostettu tai erotettu muilla keinoilla reaktioseoksesta, aikaansaama UV-absorptio, näkyvän valon absorptio tai fluoresenssi voidaan määrittää reaktion päätepisteessä (kun signaali on pysyvä) tai yhden tai useamman kiinteäksi 35 valitun aikavälin kohdalta tai vaihtoehtoisesti voidaan • 24 106728 ottaa käyttöön kineettinen määritys, jossa tehdään useita määrityksiä eri ajankohtina.
Tämän keksinnön mukaisen määrityksen suorittamiseksi tarvittavat reagenssit voidaan lisätä reaktioseokseen 5 peräkkäin tai yhtä aikaa. Kuitenkin monissa edullisissa sovellutusmuodoissa yhden tai useamman näistä reaktioista voidaan edullisesti antaa edistyä jonkin aikaa ennen jäljempänä tulevaan(iin) reaktiooniihin) tarvittavien rea-genssien lisäämistä. Esimerkiksi silloin kun tutkittava 10 näyte saatetaan reagoimaan adenosiinin ja SAH-hydrolaasin kanssa, niin SAH:n muodostumisen homokysteiinistä ja ade-nosiinista annetaan edullisesti tapahtua jonkin aikaa ennen adenosiinin määritykseen kuuluvien toimenpiteiden aloittamista.
15 Standardikäyrän käyttö kalibrointitarkoituksiin on tavanomainen käytäntö kliinisen kemian analyyseissä. Tämän keksinnön mukaista menetelmää käytettäessä voidaan siten kliinisten näytteiden tilalla käyttää homokysteiinipitoi-suudeltaan tunnettuja näytteitä standardikäyrän valmista-20 miseksi määritettävälle vasteelle/signaalille ja tuntemattomien näytteiden homokysteiinipitoisuus voidaan sitten selvittää interpoloimalla standardikäyrän perusteella. Signaalia muodostavien molekyylien tai hapetuspelkistyspo-tentiaalien tarkka kvantitointi ei siten ole välttämätön-” 25 tä.
Tämän keksinnön mukaista määritysmenetelmää voidaan käyttää sellaisten patologisten tai potentiaalisesti patologisten sairaustilojen diagnosointiin ja seurantaan, jotka liittyvät elimistön nesteiden tai kudosten homokysteii-30 nipitoisuuteen tai joissa tämä esiintyy oireena. Näitä sairaustiloja ovat ateroskleroosi, veritaudit, vitamiinien puutokset ja/tai synnynnäiset aineenvaihduntahäiriöt. Tätä menetelmää voidaan käyttää myös farmaseuttisten aineiden, kuten folaatin, toimintaa estävien lääkeaineiden vaikutus-35 ten arviointiin.
♦ 25 106728
Toisessa tämän keksinnön kohteessa siitä saadaan käyttöön analyyttinen tuote, joka on mahdollisesti testi-pakkauksen muodossa, käytettäväksi näytteessä olevan homo-kysteiinin määrityksessä, joka mainittu tuote käsittää: 5 homokysteiiniä muuttavan entsyymin; mainitun entsyymin substraatin, joka ei ole homokysteiini; signaalia muodostavan aineen; ja mahdollisesti keinon signaalin määrittämiseen.
Yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa analyyttinen 10 tuote käsittää: homokysteiiniä muuttavan entsyymin, esimerkiksi S-adenosyylihomokysteiinihydrolaasin; mainitun entsyymin yhden tai useamman substraatin, joista mikään ei ole homokysteiini; keinon sellaisen analysoitavan aineen havaittavan johdannaisen muodostamiseksi, joka on homo-15 kysteiinin kosubstraatti tai jokin homokysteiinin entsy-maattisesta muuttumisesta peräisin oleva tuote; ja mahdollisesti keinon mainitun havaittavan johdannaisen määrittämiseksi spektrometrisesti tai kolorimetrisesti osoitukseksi näytteen homokysteiinipitoisuudesta.
20 Toisessa sovellutusmuodossa tämä tuote käsittää: adenosiinin; S-adenosyyli-homokysteiinihydrolaasin; adeno-siinia muuttavan entsyymin; mahdollisesti mainitun ade-nosiinia muuttavan entsyymin kosubstraatin; ja keinon fo-tometrisesti havaittavissa olevan vasteen muodostamiseksi ' ; 25 mainitusta kosubstraatista tai adenosiinin entsymaattises- ta muuttumistuotteesta, joka on syntynyt mainitun adeno-siinia muuttavan entsyymin vaikutuksesta. Esimerkiksi ade-nosiinia muuttava entsyymi voi siten olla adenosiinikinaa-si ja muodostamiskeino voi käsittää ATP:n, lusiferiinin ja 30 lusiferaasin. Adenosiinia muuttava entsyymi voi vaihtoehtoisesti olla adenosiinideaminaasi ja muuttamiskeino voi käsittää nukleosidifosforylaasin, ksantiinioksidaasin ja peroksidaasin.
, Vielä yhdessä sovellutusmuodossa testipakkaus kä-35 sittää adenosiinin; S-adenosyylihomokysteiinin; mahdolli- 26 106728 sesti matriksipartikkeliin siodotun anti-S-adenosyylihomo-kysteiini-vasta-aineen; mainitun vasta-aineen polyhaptee-nin; ja mahdollisesti keinon vasta-aineen ja polyhapteenin muodostamien kompleksien agglutinaation tai saostumisen 5 määritämiseksi fotometrisesti. Tässä sovellutusmuodossa voi olla tarkoituksenmukaista, että polyhapteenin muodostaa runkopolymeeri, johon on konjugoitu useita furanoosi- 6-tioeettereitä, esimerkiksi ryhmiä, joiden liittämisestä runkoon jää siitä ulos pistäviä ryhmiä, joilla on kaava 10 "(^2)3$ o R-1 <h
H\-/R
15 OH OH
Näitä voidaan valmistaa esimerkiksi saattamalla kaavan I mukainen karboksyylihappo (tai sen anhydridi tai happohalogenidi) reagoimaan sellaisen polymeerin kanssa, 20 johon on liittynyt useita rungosta esiin pistäviä amiineja (esimerkiksi polylysiini), tai saattamalla kaavan I mukainen amiini reagoimaan sellaisen polymeerin kanssa, johon on liittynyt rungosta esiin pistäviä karboksyyliryhmiä.
Testipakkauksissa voivat kaikki reagenssit tai osa ' : 25 niistä olla kuivassa muodossa, mikä voi myös pitää paik- kansa reaktioseoksen reaktioiden suorittamiseen tarkoitetun muotin/matriksin suhteen. Kuten edellä on mainittu, voi testipakkaus samalla tavoin sisältää havaittavan analysoitavan aineen tai sen johdannaisen määrittämiseen tar-30 koitettuna keinona suhteellisen halvan spektrometrisen tai kolorimetrisen laitteen, esimerkiksi valonlähteen ja detektori j ärj estelmän, joka on ennakolta säädetty havaitsemaan valon voimakkuuden havaittavalle analysoitavalle ai- 27 106728 neelle ja niin edelleen, ominaisella aallonpituudella, tai jopa yksinkertaisen kolorlmetrlsen kallbrolntlliuskan.
Tätä keksintöä kuvataan seuraavlen tätä keksintöä rajoittamattomien esimerkkien avulla. Esimerkin 19 mukai-5 nen määritys on erityisen edullinen.
Esimerkki 1 Näyte (kalibrointiin tarkoitettu vesipitoinen homo-kysteiiniliuos tai kliiniseen määritykseen tarkoitettu veriplasma tai virtsa) esikäsiteltiin pelkistimellä (esi-10 merkiksi 10-millimolaarinen ditiotreitoli). Tätä näytettä lisättiin edullisesti sellainen määrä, että homokysteiinin lopulliseksi konsentraatioksi saatiin 10"6 - 10'5 mol/1, 37 eC:ssa olevaan liuokseen, jonka koostumus oli 5 mg/ml kaniinin lgG:tä, 20 mU/ml adenosiinideaminaasia, 20 mU/ml 15 nukleosidifosforylaasia, 20 mU/ml ksantiinioksidaasia, 500 mU/ml piparjuuriperoksidaasia, 10 mmol/1 ditiotreito-lia, 100 mmol/1 natriumfosfaattia ja jonka pH oli säädetty arvoon 7,40 ja joka sisälsi 100 mU S-adenosyyli-l-homokys-teiinihydrolaasia. Reaktioseokseen lisättiin joko näiden 20 kanssa samanaikaisesti tai jälkeenpäin sellainen määrä adenosiinia, että sen lopulliseksi konsentraatioksi tuli 5 x 10-6 mol/1, vaikka se on edullista lisätä 10 minuutin inkuboinnin jälkeen, jotta näytteessä oleva adenosiini ehtisi muuttua. UV-absorptio määritettiin 10 minuutin jak- • 25 son aikana ja vaste määritettiin 292 nm kohdalta kineetti- • Δα sessä toimintamuodossa ja tuloksista laskettiin
Kliinisissä kokeissa homokysteiinikonsentraatio voidaan laskea interpoloimalla tunnetuista standardeista valmistetulta standardikäyrältä.
30 Esimerkki 2 Näyte (kuten esimerkin 1 mukainen näyte) esikäsiteltiin pelkistimellä (esimerkiksi 10-millimolaarisella ditiotreitolilla). Tätä näytettä lisättiin sellainen määrä, että homokysteiinin lopulliseksi konsentraatioksi tuli 35 edullisesti 10"6 - 10‘5 mol/1, liuokseen, jota pidettiin
• I
^ · V
28 106728 37 °C:ssa ja jonka koostumus oli 5 mg/ml kaniinin IgG:tä, 20 mU/ml adenosiinideaminaasia, 20 mU/ml ksantiinioksidaa- sia, 20 mU/ml nukleosidifosforylaasia, 500 mU/ml piparjuu- riperoksidaasia, 10 mmol/1 ditiotreitolia, 100 mmol/1 nat- 5 riumfosfaattia ja jonka pH oli säädetty arvoon 7,40, ja johon oli lisätty 20 mU S-adenosyyli-l-homokysteiinihydro- laasia. Seokseen lisättiin sitten edullisesti 10 minuutin inkuboinnin jälkeen, minä aikana näytteessä oleva adeno- siini ehtii muuttua, sellainen määrä S-adenosyyli-l-homo- 10 kysteiiniä, että sen lopulliseksi konsentraatioksi tuli 5 x 10'5 mol/1, ja UV-absorptio määritettiin 10 minuutin Δα ajanjaksolta. -— laskettiin kineettisessä toimintamuodossa J Ät 292 nm kohdalta.
Kliinisissä kokeissa homokysteiinikonsentraatio 15 voidaan laskea interpoloimalla standardikäyrältä, joka on tehty käyttäen tunnettuja standardeja.
Esimerkki 3 Määrityspuskuri: 0,1 M fosfaattipuskuri, jonka pH on 7,4 ja joka 20 käsittää 1 mg/ml kaniinin IgG:tä ja 10 mmol/1 ditiotreitolia.
Määritysmenetelmä: 150 Ritaan määrityspuskuria lisättiin 3 mU S-adeno-syyli-l-homokysteiinihydrolaasia ja näytettä (tämä on • 25 edullisesti esikäsitelty esimerkeissä 1 ja 2 kuvatulla tavalla). Entsyymireaktio käynnistettiin lisäämällä seokseen sellainen määrä määrityspuskuriin liuotettua adeno-siinia, että sen lopulliseksi konsentraatioksi tuli 2,5 x 10~5 mol/1. 10 minuutin inkuboinnin jälkeen seokseen lisät-30 tiin 750 μΐ määrityspuskuria, joka sisälsi 20 mU adenosiinideaminaasia, 20 mU nukleosidifosforylaasia, 20 mU ksan-tiinioksidaasia ja 375 mU piparjuuriperoksidaasia. UV-absorptio määritettiin 292 nm:n kohdalta 5 minuutin ajan kineettisessä toimintamuodossa. Laskettiin Määritys 35 toistetaan rinnakkaismäärityksenä, jossa ei lisätä S-ade- • 29 106728 Δα nosyyli-l-homokysteiinihydrolaasia. Ero kahden -—arvon
At välillä määritetään ja homokysteiinin konsentraatio lasketaan interpoloimalla standardikäyrältä.
Esimerkki 4 5 Määritystoimenpiteet suoritetaan ensimmäiseen inku- bointiin asti esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. 10 minuutin inkuboinnin jälkeen lisätään sitten määritysliuosta, joka sisältää fluoreskeiinileimalla varustettua adenosiinia ja monoklonaalisia anti-adenosiini-vasta-aineita. Jäljelle 10 jäänyt adenosiini ja fluoreskeiinileimalla varustettu adenosiini kilpailevat vasta-aineeseen sitoutumisesta. Vasta-aineisiin sitoutuneen leimalla varustetun adenosii-nin määrä määritetään tavanomaisella fluoresenssi-polarisaatiomenetelmällä ja homokysteiinikonsentraatio 15 lasketaan interpoloimalla standardikäyrältä.
Esimerkki 5 Määrityspuskuri:
Fosfaattipuskuri, jonka konsentraatio on 0,1 M, jonka pH on 7,4 ja joka käsittää 1 mg/ml kaniinin IgG:tä 20 ja 10 mmol/1 ditiotreitolia.
SAH-hydrolaasiliuos: 40 mU/ml S-adenosyyli-l-homokysteiinihydrolaasia määrityspuskuriin liuotettuna.
Adenosiiniliuos: 25 5 x 10‘8 mol/ml adenosiinia määrityspuskuriin liuo tettuna .
Adenosiinideaminaasiliuos: 200 mU/ml adenosiinideaminaasia määrityspuskuriin liuotettuna.
- ; 30 Fenoli/nitroferrisyanidiliuos: 10 mg/ml fenolia ja 50 pg/ml natriumnitroferri-syanidia vedessä.
Hypokloriittiliuos: 11 mmol/1 NaOCl:ää 125-millimolaariseen NaOHrhon 35 1luotettuna.
• * c äo 106728 Määritysmenetelmä: 1. 75 μΐ adenosiiniliuosta ja 75 μΐ SAH-hydrolaasi-liuosta sekoitetaan näytteeseen (joka on edullisesti esi-käsitelty esimerkeissä 1-4 kuvatulla tavalla) ja seosta 5 pidetään 37 °C:ssa 10 minuutin ajan.
2. Lisätään 100 μΐ adenosiinideaminaasiliuosta ja seosta pidetään 37 °C:ssa 5 minuutin ajan.
3. Lisätään 750 μΐ fenoli/nitroferrisyanidiliuosta ja 750 μΐ hypokloriittiliuosta. Kun seosta on pidetty 10 37 °C:ssa 30 minuutin ajan, määritetään absorbanssi 628 nm:n kohdalta. Määritys toistetaan rinnakkaismäärityk-senä, jossa ei lisätä SAH-hydrolaasia. Määritetään kahden 628 nm:n kohdalta saadun absorbanssiarvon välinen ero ja homokysteiinikonsentraatio lasketaan interpoloimalla tämä 15 ero tehdyltä standardikäyrältä tunnettuja menetelmiä käyttämällä.
Esimerkki 6
Fluoroforileimalla varustetun SAH:n muodostaminen
Valmistetaan liuos, joka sisältää 10 mmol/1 SAH:ta 20 dimetyyliformamidissa, jonka jälkeen se laimennetaan suhteessa 1 : 10 fosfaattipuskuriin, jonka konsentraatio on 100 mmol/1 ja jonka pH on 7,5. Tähän liuokseen lisätään sellainen määrä fluoreskeiini-isotiosyanaattia, että sen lopulliseksi konsentraatioksi tulee 1 mmol/1. Ympäristön ' 25 lämpötilassa tehdyn 60 minuutin inkuboinnin jälkeen SAH- fluoreskeiini-konjugaatti puhdistetaan HPLC:n avulla Chromasil C-18-pylväässä 260 nm:n aallonpituutta ja 25-millimolaarisen ammoniumasetaatin (pH 7,0) ja metanolin gradienttiseosta käyttäen.
30 Esimerkki 7
Anti-SAH-vasta-aineiden muodostaminen a) Antigeenin muodostaminen:
Liuokseen, joka sisältää 1 mmol/1 SAH:ta fosfaatti-puskurissa, jonka konsentraatio on 25 mmol/1, jonka pH on 35 7,4 ja jossa on käytetty NaCl:ää, jonka konsentraatio on » 31 106728 125 mmol/ι, lisätään sellainen määrä naudan seerumin albumiinia, että sen lopulliseksi konsentraatloksl tulee 5 mg/ml. Tähän seokseen lisätään sellainen määrä bis(sul-fosukkinimidyyliJsuberaattia, että sen lopulliseksi kon-5 sentraatloksl tulee 1 mmol/1, ja seos jätetään reagoimaan 60 minuutin ajaksi. (Tässä konjugaatioreaktiossa pH-arvo pidetään matalana, minkä tarkoituksena on stimuloida kon-jugoitumista adenosyylin funktionaaliseen amiiniryhmään homokysteiinin funktionaalisen amiiniryhmän sijaan).
10 Liuoksen proteiinipitoinen fraktio, joka käsittää myös BSA:n ja SAH:n väliset konjugaatit, eristetään geelikroma-tografian avulla Pharmacian Superose 12 -pylväässä käyttäen eluointiaineena fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta.
15 b) Hybridoomien muodostaminen:
Hybridoomat muodostetaan kuvattua antigeeniä käyttäen James W. Gooding'in teoksen "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Academic Press, Lontoo, 1983, kolmannessa luvussa kuvatun menetelmän mukaisesti.
20 c) Hybridoomien valikointi: (i) Anti-SAH-vasta-aineita tuottavat hybridoomat tunnistetaan seuraavalla tavalla: Hybridoomista saadun supernatantin IgG-pitoisuus määritetään tavanomaisella ELISA-määrityksellä. Kyvetissä sekoitetaan sitten pusku-• 25 riin, jonka koostumus on 50 mmol/1 fosfaattia, 120 mmol/1
NaCl:ää ja jonka pH on 7,4 ja joka sisältää 0,1 mg/ml kaniinin IgG:tä, sellainen määrä supernatanttia, että hiiren lgG:n lopulliseksi konsentraatioksi tulee 0,1 pmol/l.
Seokseen lisätään sellainen määrä edellä kuvatun esimerkin 30 6 mukaisesti valmistettua fluoreskeiinileimalla varustet tua SAH:ta, että sen lopulliseksi konsentraatioksi tulee 0,02 pmol/l. Fluoresenssipolarisaatioyksiköllä varustetulla spektrof luorometrillä määritetään 10 minuutin inkuboin-nin jälkeen polarisaatioaste määrittämällä w 32 106728 A = fluoresenssin voimakkuus tulevan valon polarisaatiotason ollessa yhdensuuntainen emissiosäteilyn suodattamiseen käytetyn suodattimen polarisaatiotason suhteen, 5 B = fluoresenssin voimakkuus tulevan valon polarisaatiotason ollessa kohtisuorassa emissiosäteilyn suodattamiseen käytetyn suodattimen polarisaatiotason suhteen, olosuhteissa, joissa eksitaatioaallonpituutena käy-10 tetään 494 nm ja emissiosäteilyn havaitsemista 517 nm kohdalta.
Polarisaatioaste lasketaan kaavasta (A - B) / (A + B)
Pieni polarisaatioaste merkitsee, etteivät monoklo-15 naaliset hiiren vasta-aineet sitoudu SAHihon.
(ii) Kohdan (i) mukaisesti valikoiduista hybridoo-mista tunnistetaan ne hybridoomat, jotka tuottavat adeno-siinin ja/tai homokysteiinin kanssa reagoivia vasta-aineita, seuraavalla tavalla: Mikrotiitterilevyn kuoppien sei-20 nämät päällystetään hybridoomista saadusta supernatantista peräisin olevilla monoklonaalisilla anti-SAH-vasta-aineil-la tuonnempana esitetyssä esimerkissä 9 kuvatulla tavalla. Mikrotiitterilevyn kuoppiin lisätään yhtiöstä Amersham, Ltd., UK, saatavilla olevaa hiili-14-leimalla varustettua 25 adenosiinia (tai hiili-14-leimalla varustettua homokys-teiiniä) puskurissa, jonka koostumus on 25 mmol/1 fosfaattia, 120 mmol/1 NaClrää ja 1 mg/ml kaniinin IgG:tä ja jonka pH = 7,4. 60 minuutin inkuboinnin jälkeen kuopat pestään 3 kertaa samalla puskurilla (joka ei luonnollisesti 30 sisällä adenosiinia tai homokysteiiniä). Kuopista saadut suuret radioaktiivisuusarvot osoittavat, että hybridoomat tuottavat vasta-aineita, jotka omien ominaisuuksiensa perusteella sitoutuvat adenosiiniin (tai homokysteiiniin). Näitä vasta-aineita ei käytetä määrityksessä.
♦ 33 106728 (lii) Monoklonaalisen IgG:n valmistus:
Monoklonaalisen IgG:n valmistukseen valikoidaan ne hybridoomat, jotka tuottavat edellä mainitun kohdan (i) mukaisesti SAH:hon sitoutuvia vasta-aineita, mutta jotka 5 eivät edellä mainitun kohdan (ii) mukaisesti sitoudu ade-nosiiniin eivätkä homokysteiiniin. Valikoituja hybridoomia käytetään askitesnesteen tuottamiseen hiiressä tai soluviljelmien muodostamiseen in vitro -olosuhteissa tavanomaisten menetelmien mukaisesti. Lisäksi monoklonaaliset 10 vasta-aineet eristetään askitesnesteestä tai soluviljelmissä käytetyistä kasvatusmediumeista tavanomaisten menetelmien mukaisesti. Näitä kysymyksiä on käsitelty teoksessa James W. Gooding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Academic Press, Lontoo, 1983.
15 Esimerkki 8 L-homokysteiinin fluoresenssipolarisaatioimmuno-määritys
Entsyymiliuos: 50 mmol/1 fosfaattipuskuria, jonka pH = 7,4 ja joka käsittää 0,2 mg/ml kaniinin IgG:tä, 20 120 mmol/1 NaCl:ää, 10 mmol/1 ditiotreitolia, 10 U/l S-adenosyyli-l-homokysteiinihydrolaasia ja 0,1 mmol/1 ade-nosiinia.
Fluoreskeiinileimalla varustettu SAH-liuos: sellainen määrä esimerkin 6 mukaisesti valmistettua fluoreskeii-25 niin konjugoitua SAH:ta liuotetaan fosfaattipuskuriin, jonka konsentraatio on 50 mmol/1, jonka pH = 7,4 ja joka sisältää 125 mmol/1 NaCl:ää ja 0,2 mg/ml kaniinin IgG:tä, että SAH:n lopulliseksi konsentraatioksi tulee 1 pmol/l.
Vasta-aineliuos: sellainen määrä esimerkiksi esi-30 merkin 7 mukaisesti valmistettuja monoklonaalisia anti-SAH-vasta-aineita (nämä eivät reagoi adenosiinin kanssa eivätkä ne edullisesti myöskään reagoi homokysteiinin kanssa), että niiden lopulliseksi konsentraatioksi tulee 1 pmol/l, liuotettuna fosfaattipuskuriin, jonka konsen-35 traatio on 50 mmol/1, pH = 7,4, ja joka sisältää 125 mmol/1 NaCl:ää ja 0,2 mg/ml kaniinin IgG:tä.
„ 106728 34 Määrityksen suoritus: kyvetissä sekoitetaan keskenään 15 μΐ veriplasmaa (aluksi sarja näytteitä, joiden homokysteiinipitoisuus on tunnettu) ja 100 μΐ entsyymi-liuosta ja seosta pidetään 37 celsiusasteessa 15 minuutin 5 ajan. Tähän lisätään 100 μΐ fluoreskeiinileimalla varustettua SAH:ta sisältävää liuosta, jonka jälkeen seokseen lisätään 1,0 ml vasta-aineliuosta. Polarisaatioaste määritetään fluoresenssipolarisaatioyksiköllä varustetulla spektrofluorometrillä edellä olevan esimerkin 7 kohdassa 10 (c)(i) kuvatulla tavalla ja tuloksista laaditaan kuvaaja homokysteiinin konsentraation funktiona.
Määritys voidaan suorittaa myös käyttäen esimerkkien 6 ja 7 mukaisten vasta-aineiden ja hapteenien tilalla esimerkkien 11 ja 13 tai 15 ja 17 mukaisia leimalla varus-15 tettuja hapteeneja ja vasta-aineita.
Esimerkki 9
Entsyymivälitteinen mikrotiitteri-immunomääritys (a) Entsyymiliuos on esimerkin 8 mukainen entsyymiliuos.
20 (b) Peroksidaasileimalla varustettua SAH:ta sisäl tävä liuos: 0,5 mg piparjuuriperoksidaasia liuotetaan 1 ml:aan puhdistettua vettä. Tähän lisätään 200 μΐ liuosta, joka sisältää 0,02 mol/1 natriumperjodaattia, seosta sekoiteli' 25 taan 20 minuutin ajan ympäristön lämpötilassa, jonka jälkeen se dialysoidaan yön yli 10-millimolaarista natrium-asetaattipuskuria, jonka pH « 4,4, vastaan. Liuokseen lisätään sellainen määrä SAH:ta, että sen lopulliseksi kon-sentraatioksi tulee 0,1 mmol/1 ja pH säädetään arvoon 6,0. 30 Liuosta sekoitetaan 4 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Siihen lisätään 100 μΐ juuri valmistettua vesipitoista liuosta, joka sisältää 4 mg natriumboorihydridiä millilit-rassa, jonka jälkeen liuosta inkuboidaan 4 celsiusasteessa 2 tunnin ajan. Peroksidaasi ja sen SAH-konjugaatit eriste- 35 106728 tään geelikromatografian avulla Superose 6 -pylväässä (Pharmacia, Ruotsi).
(c) Mikrotiitterilevyn kuoppiin päällystetyt anti-SAH-vasta-aineet: 5 Boraattipuskuriin, jonka konsentraatio on 100 mmol/1 ja jonka pH = 9,0 liuotetaan sellainen määrä hiiren lg6:tä vastaan immunisoiduista lampaista saatua poly-klonaalista lampaan IgG:tä, että sen lopulliseksi konsen-traatioksi tulee 1 mg/ml. Polystyreenistä valmistetun mik-10 rotiitterilevyn kuhunkin kuoppaan lisätään 300 μΐ tätä liuosta. Sitten kun maljoja on inkuboitu 37 celsiusasteessa 120 minuutin ajan, niin ne pestään 5 kertaa fosfaatilla puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella. Tämän jälkeen fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen 15 liuotetaan sellainen määrä edellä kuvatun esimerkin 7 mukaisesti valmistettuja hiiressä tehtyjä monoklonaalisia anti-SAH-IgG-vasta-aineita, että niiden lopulliseksi kon-sentraatioksi tulee 50 pg/ml. Kuhunkin kuoppaan lisätään 200 μΐ tätä monoklonaalisia IgG-vasta-aineita sisältävää 20 liuosta ja tätä inkuboidaan 120 minuutin ajan 37 celsiusasteessa. Tämän jälkeen kuopat pestään 5 kertaa fosfaatilla puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, joka sisältää 0,1 mg kaniinin IgG:tä millilitrassa.
(d) Määrityksen suoritus: I 25 25 μΐ veriplasmanäytettä (aluksi sarja näytteitä, joiden homokysteiinipitoisuus on tunnettu) ja 500 μΐ entsyymiliuosta sekoitetaan keskenään ja seosta pidetään 37 celsiusasteessa 15 minuutin ajan. Seokseen lisätään 50 μΐ peroksidaasileimalla varustettua SAH:ta sisältävää 30 liuosta ja sen sekoittamisen jälkeen 250 μΐ tätä liuosta .. lisätään yhteen anti-SAH-vasta-aineella päällystetyistä mikrotiitterilevyn kuopista, jotka on valmistettu edellä mainitun kohdan (c) mukaisesti ja jotka on kaikki puskuroitu pH-arvoon 7,4. Kun kuoppia on inkuboitu 60 minuuttia 35 37 celsiusasteessa, ne pestään kolme kertaa fosfaatilla • 4 36 106728 puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, joka sisältää 0,1 mg kaniinin IgG:tä millilitrassa. Kuhunkin kuoppaan lisätään 100 μΐ liuosta, joka sisältää 1 mg ortofeny-leenidiamiinia millilitrassa sitraattipuskurissa, jonka 5 konsentraatio on 0,1 mol/1, jonka pH = 6,0 ja joka sisältää 0,015 % vetyperoksidia. 10 - 30 minuutin kuluttua määritetään kustakin kuopasta valon absorbanssi 450 nm kohdalta. Laaditaan absorbanssia esittävä kuvaaja homokys-teiinikonsentraation funktiona.
10 Esimerkki 10
Hapteenin valmistus 3-S-( 1-anhydro-D-ribofuranosyyli )-tiopropyyliamiini H2N(CH2)3SCH2 h 15
HX-7 H
OH OH
20 (a) Aktivoitu hydroksilla suojattu merkaptaani (yhdiste (8) edellä olevassa kaaviossa (E)) δη ° « ... „ \H H>
'= 25 H ^-V H
°x° 30 Yksi ekvivalentti metyyli-β-D-ribofuranosidia (edellä olevaa yhdistettä (1), jota on kaupallisesti saatavilla) saatetaan reagoimaan sellaisen seoksen kanssa, joka sisältää 5 ekvivalenttia trimetyylisilyylimetaani-sulfonaattia ja yhden ekvivalentin booritrifluoridiete- 35 raattia käyttäen julkaisussa Jun, et ai., [Carb. Res. 163 37 106728 (1987) 247 - 261] kuvattua menetelmää. 0,5 ekvivalenttia hienojakoisen jauheeen muodossa olevaa 1-anhydro-D-riboo-situotetta (yhdistettä (2)) lisätään seosta jatkuvasti sekoittaen pienissä erissä asetonin ja rikkihapon seok-5 seen, joka on valmistettu lisäämällä hitaasti 6,3 ml väkevää rikkihappoa 100 ml:aan jäähauteessa olevaa juuri tislattua asetonia. Jäähaude poistetaan ja reaktion annetaan jatkua ympäristön lämpötilassa 8 tunnin ajan. Tästä saatu kiinteä valkoinen kiteinen massa liuotetaan kloroformiin, 10 pestään vesipitoisella natriumhydroksidilla, laimealla suolahapolla ja lopuksi vedellä, kuivataan ja haihdutetaan, mistä saadaan 1-anhydro-D-riboosin (yhdiste (2)) 2,3-isopropyylideeni-D-ribonihappojohdannainen. Yksi ekvivalentti tätä yhdistettä ja kaksi ekvivalenttia hiilitet-15 rabromidia liuotetaan kuivaan eetteriin ja seos jäähdytetään jäähauteessa. Seokseen lisätään hitaasti kaksi ekvivalenttia trifenyylifosfiinia sitä jatkuvasti sekoittaen ja jäähauteessa jäähdyttäen. Jäähaude poistetaan ja seoksen annetaan lämmetä ympäristön lämpötilaan, mikä mahdol-20 listaa reaktion käynnistymisen ja saa vetybromidin kehittymään tasaisesti. Reaktion mentyä loppuun tehdään yli jäänyt reagenssi tehottomaksi lisäämällä seokseen metano-lia. Bromidijohdannainen (yhdiste (6)) eristetään suodattamalla ja haihduttamalla suodos. Bromidijohdannaiseen :1 25 lisätään lämpimään veteen liuotettua tioureaa (yksi ekvi valentti) ja liuos laimennetaan väkevöidyllä alkoholilla. Seosta palautusjäähdytetään ja ravistellaan ajoittain perusteellisesti menetellen tällä tavoin siihen asti, kunnes noin 30 minuuttia on kulunut bromidijohdannaisen liukene-30 misesta. Reaktioseos jäähdytetään jäähauteessa ja suodatetaan, mistä saadaan kiinteää ainetta, jota käsitellään alkalisella vesiliuoksella, mistä orgaaniseen faasiin saadaan hydroksiryhmällä suoj attu merkaptaani (yhdiste (7)). Tämä muunnetaan aktivoiduksi muodoksi (yhdisteeksi (8)) 35 käsittelemällä sitä metoksidilla metanolissa. Tämän jäi- · · 33 106728 keen yhdiste saatetaan reagoimaan edelleen tuonnempana kuvattavalla tavalla.
(b) 3-S-(1-anhydro-D-ribofuranosyyli)tiopropyyli- amiini 5 Yksi ekvivalentti juuri valmistettua esimerkin 10(a) mukaista yhdistettä (yhdistettä (8)) saatetaan reagoimaan yhden akryylonitriiliekvivalentin kanssa, mistä saadaan tioeetteriä (yhdistettä (9)). Yhdiste pelkistetään sitten käsittelemällä sitä LiAlH4:llä kuivassa eetterissä 10 ja vapaa amiini (yhdiste (10)), josta suojaava ryhmä on poistettu, eristetään käsittelemällä vesipitoisella suolahapolla.
Vastaavat aminopropyylitioeetterit, joissa Rx ja R2 ovat jokin muu ryhmä kuin vety, valmistetaan vastaavalla 15 tavalla esimerkiksi käyttäen lähtöaineina kaupallisesti saatavilla olevia yhdisteitä (1) ja (3).
Esimerkki 11
Hapteenin varustaminen leimalla
Dimetyyliformamidiin (DMF) valmistettu liuos, joka 20 sisältää 50 mmol esimerkin 10 mukaista yhdistettä litrassa, laimennetaan 0,1-molaarisella bikarbonaattiliuoksella (pH 9,2) suhteessa 1 : 5 (tilavuussuhde). Tähän liuokseen lisätään sellainen määrä fluoreskeiini-isotiosyanaattia, että sen lopulliseksi konsentraatioksi tulee 12 mmol/1. 25 Kun seosta on inkuboitu 60 minuutin ajan ympäristön lämpötilassa, niin esimerkin 10 mukaisen yhdisteen fluoreske-iinikonjugaatti puhdistetaan RPC:n avulla 10 nm:n (100 Ä) Kromasil C-18-pylväässä käyttäen gradienttiseosta, joka koostuu 20-millimolaarisesta ammoniumasetaatista (pH 7,0) 30 ja metanolista.
Esimerkki 12
Antigeenin valmistus
Liuokseen, joka sisältää 1 mmol esimerkin 10 mukaista yhdistettä litrassa puskuria, joka sisältää 50 mmol 35 fosfaattia ja 125 mmol NaCl:ää (pH 7,4) litrassa, lisätään 39 106728 sellainen määrä naudan seerumin albumiinia (BSA), että sen lopulliseksi konsentraatioksi tulee 5 mg/ml. Tähän seokseen lisätään sellainen määrä bis( sulfosukkinimidyyli)-suberaattia, että sen lopulliseksi konsentraatioksi tulee 5 1,2 nunol/1, ja seoksen annetaan reagoida 60 minuutin ajan.
Hapteenin ja BSA:n muodostamaa konjugaattia sisältävä pro-teiinipitoinen fraktio eristetään geelikromatografiän avulla Pharmacian Superose 12 -pylväässä käyttäen eluoin-tiin fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta.
10 Esimerkki 13
Vasta-aineen valmistus
Esimerkin 10 mukaista yhdistettä vastaan suunnattuja vasta-aineita valmistetaan vastaavalla tavalla kuin edellä kuvatussa esimerkissä 7 käyttäen esimerkin 12 mu-15 kaista antigeeniä. .Hylätyiksi tulevat ne vasta-aineet, jotka eivät reagoi SAH:n kanssa, ja ne vasta-aineet, jotka reagoivat adenosiinin kanssa, kuten on myös edullisesti asianlaita homokysteiinin kanssa reagoivien vasta-aineiden suhteen.
20 Esimerkki 14
Hapteenin valmistus N-hydroksisukkinimidyyli-3-S- (1-anhydro-D-ribofura-nosyyli)tiobutanoaatti
;:· 25 _P
Xn_OCO(CH2)3SCH2 h OH OH 30
Yksi ekvivalentti juuri valmistettuä esimerkin 10(a) mukaista yhdistettä saatetaan reagoimaan yhden etyy-li-4-bromibutyraattiekvivalentin kanssa, mistä saadaan esteriyhdiste (11). Tämä hydrolysoidaan vapaaksi hapoksi 35 emäshydrolyysillä käyttäen vesipitoista natriumhydroksidia • · 40 106728 dioksaanissa ja suojaavat ryhmät poistetaan käsittelemällä vesipitoisella suolahapolla, mistä saadaan vapaa happo (yhdiste (12)), josta suojaavat ryhmät on poistettu. Yksi ekvivalentti tätä yhdistettä ja kaksi ekvivalenttia N-hyd-5 roksisukkinimidiä sekoitetaan keskenään jääkylmässä dime-tyyliformamidissa ja tähän lisätään 1,2 ekvivalenttia di-sykloheksyylikarbodi-imidiä seosta samalla jatkuvasti sekoittaen. Reaktion annetaan jatkua ympäristön lämpötilassa 18 tunnin ajan, jonka jälkeen seos jäähdytetään ja siihen 10 lisätään jääkylmää eetteriä. Saostunut NHS-esteri (yhdiste (13)) kiteytetään uudelleen DMF:n ja eetterin seoksesta, kuivataan ja varastoidaan sitten 4 °C:seen kuivausaineen päälle.
Vastaavat NHS-esterit, joissa Rj ja R2 ovat jokin 15 muu ryhmä kuin vety, valmistetaan vastaavalla tavalla, esimerkiksi käyttäen lähtömateriaaleina kaupallisesti häätävillä olevia yhdisteitä (1) ja (3).
Esimerkki 15
Hapteenin varustaminen leimalla 20 Liuos, joka sisältää 50 mmol/1 esimerkin 14 mukais ta yhdistettä DMF:ssä, laimennetaan 0,1-molaarisella bi-karbonaattipuskurilla (pH 9,2) suhteessa 1 : 5 (tilavuus-suhde) . Tähän liuokseen lisätään sellainen määrä 5-amido-asetamidofluoreskeiinia (fluoreskeinyyliglysiiniamidia), '.· 25 että sen lopulliseksi konsentraatioksi tulee 12 mmol/1.
Kun reaktioseosta on inkuboitu 60 minuutin ajan ympäristön lämpötilassa, niin 3-S-(1-anhydro-D-ribofuranosyyli)tio-butaanihapon fluoreskeiinikonjugaatti puhdistetaan RPC:n avulla 10 nm:n (100 Ä) Kromasil C-18 -pylväässä käyttäen 30 gradienttiseosta, joka on valmistettu 20-millimolaarisesta ammoniumasetaatista (pH 7,0) ja metanolista.
Esimerkki 16
Antigeenin valmistus
Liuokseen, joka sisältää BSArta (konsentraatiossa 35 5 mg/ml puskurissa, joka sisältää 50 mmol fosfaattia ja • i 106728 41 125 mmol NaCl:ää litrassa (tämän pH on 7,4)), lisätään sellainen määrä esimerkin 14 mukaista yhdistettä, että sen lopulliseksi konsentraatloksl tulee 1 mmol/1. Seoksen annetaan reagoida 60 minuutin ajan ja BSA-hapteeni-konju-5 gaattla sisältävä protelinlpitolnen fraktio eristetään geellkromatograflan avulla Pharmaclan Superose 12 '-pylväässä käyttäen eluolntlln fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta.
Esimerkki 17 10 Vasta-aineen valmistus
Esimerkin 14 mukaista yhdistettä vastaan suunnattuja vasta-aineita valmistetaan vastaavalla tavalla kuin edellä kuvatussa esimerkissä 7 käyttäen esimerkin 12 mukaista antigeeniä. Hylätyiksi tulevat ne vasta-aineet, 15 jotka eivät reagoi SAH:n kanssa ja ne vasta-aineet, jotka reagoivat adenosiinin kanssa, mikä pitää myös edullisesti paikkansa homokysteiinin kanssa reagoivien vasta-aineiden suhteen.
Esimerkki 18 20 Fluoresenssipolarisaatioimmunomääritys
Entsyymiliuos:
Fosfaattipuskuri, jonka konsentraatio on 50 mmol/1 (pH 7,4) ja joka sisältää 4 mg kaseiinia milllilitrassa, 120 mmol NaClrää litrassa ja 10 U S-adenosyyli-L-homokys- 25 teiinihydrolaasia litrassa.
Ditiotreitoli (DTT) -liuos:
Veteen liuotetaan sellainen määrä ditiotreitolia, että sen konsentraatioksi tulee 50 mmol/1, ja liuoksen pH säädetään arvoon 3,0 HCl:n avulla.
30 Adenosiiniliuos: 1,8 mmol adenosiinia litrassa fosfaattipuskuria, jonka konsentraatio on 50 mmol/1 (pH = 7,4).
·· 42 106728
Fluoreskeiinileimalla varustettua SAH:ta sisältävä liuos:
Fosfaattipuskuri (pH 7,4), jonka konsentraatio on 50 mmol/1 ja joka sisältää esimerkin 6 mukaisesti valmis-5 tettua fluoreskeiiniin konjugoitua SAH:ta.
Vasta-aineliuos:
Sellainen määrä monoklonaalisia anti-SAH-vasta-aineita (nämä on valmistettu esimerkiksi esimerkin 7 mukaisesti ), että niiden lopulliseksi konsentraatioksi tulee 10 0,1 pmol/l liuotettuna fosfaattipuskuriin (pH 7,4), jonka konsentraatio on 50 mmol/1 ja joka sisältää 120 mmol NaCltää litrassa ja 1 mg kaseiinia millilitrassa.
Määrityksen suoritus
Vaihe 1: 15 Kyvetissä sekoitetaan keskenään seos, joka sisältää 15 μΐ näytettä, 10 μΐ entsyymiliuosta ja 10 μΐ adenosiini-liuosta, sekä 10 μΐ hapanta DTT-liuosta ja seosta pidetään 37 °C:ssa 15 minuutin ajan.
Vaihe 2: 20 Ryvettiin lisätään 100 μΐ fluoreskeiinileimalla varustettua SAH:ta sisältävää liuosta ja 1,0 ml vasta-aineliuosta.
Polarisaatioaste määritetään edellä kuvatun esimerkin 7 kohdassa (c)(i) kuvatulla tavalla käyttäen fluo-25 resenssipolarisaatioyksiköllä varustettua spektrofluoro-metriä ja määritystuloksista laaditaan kuvaajaa homokys-teiinin konsentraation funktiona.
Esimerkki 19
Fluoresenssipolarisaatioimmunomääritys 30 Entsyymiliuos:
Fosfaattipuskuri (pH 7,4), jonka konsentraatio on 50 mmol/1 ja joka sisältää 1 mg kaseiinia millilitrassa, sekä 120 mmol NaClrää ja 10 U S-adenosyyli-L-homokysteii-nihydrolaasia litrassa.
·« 43 106728
Ditiotreitoli (DTT) -liuos:
Veteen liuotetaan sellainen määrä ditiotreitolia, että sen konsentraatioksi tulee 50 mmol/1, ja liuksen pH sädetään arvoon 3,0 HCl:n avulla.
5 Fluoreskeiinileimalla varustettua SAH:ta sisältävä liuos/adenosiiniliuos:
Fosfaattipuskuri (pH 7,4), jonka konsentraatio on 50 mmol/1 ja joka sisältää 10 μτηοΐ esimerkin 6 mukaisesti muodostettua fluoreskeiiniin konjugoitua SAHrta litrassa 10 ja 1,8 mmol adenosiinia litrassa.
Vasta-aineliuos:
Sellainen määrä monoklonaalisia anti-SAH-vasta-ai-neita (nämä on valmistettu esimerkiksi esimerkin 7 mukaisesti) , että vasta-aineiden lopulliseksi konsentraatioksi 15 tulee 0,1 μτηοΐ/ΐ liuotettuna fosfaattipuskuriin (pH 7,4), jonka konsentraatio on 50 mmol/1 ja joka sisältää 120 mmol NaCl:ää litrassa ja 1 mg kaseiinia millilitrassa.
Määrityksen suoritus
Seos, joka sisältää 10 μΐ näytettä, 100 μΐ entsyy-20 miliuosta ja 10 μΐ leimalla varustetun SAH:n ja adenosii-nin seosta, sekä 30 μΐ happameksi tehtyä DTT-liuosta sekoitetaan keskenään kyvetissä ja seosta pidetään 37 °C:ssa 15 minuutin ajan.
Inkuboinnin jälkeen seokseen lisätään 1,0 ml vasta-25 aineliuosta. Polarisaatioaste määritetään edellä kuvatun esimerkin 7 kohdassa (c) (i) kuvatulla tavalla käyttäen fluoresenssipolarisaatioyksiköllä varustettua spektrofluo-rometriä ja määritystuloksista laaditaan kuvaaja homokys-teiinin konsentraation funktiona.
30 Esimerkkien 18 ja 19 mukaiset määritykset voidaan ‘ suorittaa myös käyttäen esimerkkien 6 ja 7 mukaisten lei- • · < maila varustettujen hapteenien ja vasta-aineiden tilalla esimerkkien 11 ja 13 tai 15 ja 17 mukaisia leimalla varustettuja hapteeneja ja vasta-aineita.
44 106728
Esimerkki 20
Luminesenss imääritys Määrityspuskuri I:
Pipes-puskuri (pH 6,6), jonka konsentraatio on 5 50 mM ja joka sisältäää 1 mg kaseiinia millilitrasa, 10-millimolaarista DTT:tä, 0,5-millimolaarista MgCl2:ta ja 30-millimolaarista KClrää.
Määrityspuskuri II:
Hepes-puskuri (pH 7,75), jonka konsentraatio on 10 40 mM ja jossa on 4 mmol EDTA:ta litrassa, 20-millimolaa- rista magnesiumkloridia ja 0,36 mmol DTT:tä litrassa.
Määrityspuskuri III:
Hepes-puskuri (pH 7,75), jonka konsentraatio on 40 mM ja joka sisältää 1,6 pg lusiferaasia (tämä on peräi-15 sin Photinus pyraliksesta) millilitrassa sekä 700 pmol D-lusiferiinia, 20 mmol magnesiumkloridia, 4 mmol EDTA:ta, 0,36 mmol DTT:tä ja 0,3 mmol AMPrta litrassa.
Määritysmenetelmä: 130 pl:aan määrityspuskuria I lisätään 3 U S-adeno-20 syyli-l-homokysteiinihydrolaasia, tähän seokseen lisätään 20 μΐ näytettä ja seosta inkuboidaan 15 minuutin ajan 37 eC:ssa. Tämän jälkeen seokseen lisätään sellainen määrä määrityspuskuriin I liuotettua adenosiinia, että sen kon-sentraatioksi saadaan 5 x 10’6 mol/1. Kun seosta on inku-'·' 25 boitu 5 minuutin ajan 37 °C:ssa, siihen lisätään 750 μΐ määrityspuskuria I, joka sisältää 0,7 x 10"5 mol ATP:tä litrassa ja 1 mU adenosiinikinaasia, ja tuloksena olevaa liuosta inkuboidaan vielä 5 minuutin ajan 37 °C:ssa.
Tämä liuos laimennetaan määrityspuskurilla II 30 suhteessa 1 : 100 (tilavuussuhde) ja 500 μΐ tätä laimen-.. nettua liuosta lisätään välittömästi 500 pl:aan määritys- puskuria III. Sekä määrityspuskuri II että III olivat tasapainotettuja ympäristön lämpötilaan (21 °C). Muodostunut luminesenssi määritetään fotometrillä 550 nm:n kohdalta.
• · 45 106728
Tehdään rinnakkainen määritys, jossa ei käytetä S-adenosyyli-l-homokysteiinihydrolaasia. Kliinisissä kokeissa homokysteiinikonsentraatiot voidaan laskea interpo-loimalla ilman S-adenosyyli-l-homokysteiinihydrolaasia ja 5 tätä käyttäen saatujen luminenenssiarvojen erotus standar-dikäyrältä.
Esimerkki 21
Polyklonaalisen vasta-aineen valmistaminen
Esimerkkien 12 ja 16 mukaisia antigeenejä vastaan 10 suunnattuja kaniinissa tehtyjä polyklonaalisia vasta-aineita valmistetaan Dako Corporation -yhtiön, Kööpenhamina, Tanska, julkaiseman suoritusohjeen mukaisesti. Polyklonaa-linen IgG puhdistetaan talteenotetusta antiseerumista saman suoritusohjeen mukaisesti. Polyklonaaliset vasta-ai-15 neet puhdistetaan sellaisista vasta-aineista, jotka ovat reaktiokykyisiä varsinaisten adenosiini- ja homokysteiini-ryhmien kanssa, käsittelemällä vasta-aineita sellaisissa Racti-Gel-pylväissä, joihin on immobilisoitu adenosiini-ja homokysteiiniryhmiä (geeli ja suoriutusohje on saatu 20 yhtiöstä Pierce Chemical Company, Belgia). Hylätyiksi tulevat myös SAH:n kanssa reagoimattomat vasta-aineet. Valikoituja vasta-aineita voidaan käyttää aiempien esimerkkien mukaisissa määrityksissä.
* s · 4 4 ' ··*

Claims (38)

46 106728
1. Menetelmä homokysteiinin määrittämiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että mainittu menetelmä 5 käsittää vaiheet, joissa mainittu näyte saatetaan kosketukseen homokysteiiniä muuttavan entsyymin kanssa ja ainakin yhden mainitun entsyymin substraatin kanssa, joka on muu kuin homokysteiini, ja analysoitava aine, joka on valittu ryhmästä homokysteiinikosubstraatti ja mainitun ent-10 syymin entsymaattisella konversiolla homokysteiinistä tuottamat homokysteiinikonversiotuotteet, ja jota ei ole varustettu leimalla, määritetään kromatografista erottamista käyttämättä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että mainittu näyte saatetaan kosketukseen mainittua analysoitavaa ainetta vastaan suunnatun vasta-aineen kanssa ja mainitun vasta-aineen sellaisen hapteenin kanssa, joka ei ole mainittu leimalla varustamaton analysoitava aine, ja siitä, että mainittu analysoita- 20 va aine määritetään epäsuorasti määrittämällä mainittu hapteeni, joka on tai ei ole sitoutunut mainittuun vasta-aineeseen.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä; että mainittu hapteeni on polyhap- 25 teeni.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu hapteeni on leimalla varustettu molekyyli, jossa on epitooppinen rakenneyksik-kö, joka esiintyy myös mainitussa leimalla varustamatto- 30 massa analysoitavassa aineessa.
5. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 2-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu vas ta-aine on monoklonaalinen vasta-aine.
6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 2-5 mukai- 35 nen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu vas ta-aine on kantaja-ainematriksiin sidottu vasta-aine. 106728
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu näyte saatetaan kosketukseen sellaisen toisen entsyymin kanssa, joka muuttaa mainittua analysoitavaa ainetta, ja siitä, että mainittu 5 analysoitava aine määritetään epäsuorasti määrittämällä joko mainitun toisen entsyymin sellainen substraatti, joka ei ole mainittu analysoitava aine, tai mainitun analysoitavan aineen entsymaattisen muuttumisen tuote, joka on syntynyt mainitun toisen entsyymin välityksellä.
8. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu analysoitava aine on mainittu kosubstraatti.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on S-adeno- 15 syylihomokysteiinihydrolaasi ja mainittu analysoitava aine on adenosiini.
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu näyte edelleen saatetaan vielä kosketukseen jonkin muun adenosiinia muutta- 20 van entsyymin kuin mainitun homokysteiiniä muuttavan entsyymin kanssa, mainittu analysoitava aine on adenosiini ja adenosiini määritetään epäsuorasti määrittämällä kosubstraatti tai reaktiotuote, joka on syntynyt adenosiinin muuttumisesta mainitun adenosiinia muuttavan entsyymin 25 välityksellä.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu adenosiinia muuttava entsyymi on adenosiinikinaasi.
12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että mainittu adenosiinia muuttava entsyymi on adenosiinideaminaasi.
13. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu analysoitava aine on mainittu konversiotuote. 106728
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on S-ade-nosyylihomokysteiinihydrolaasi ja mainittu analysoitava aine on S-adenosyylihomokysteiini.
15. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-14 mu kainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu näyte on veri-, veriplasma- tai virtsanäyte, jota on esi-käsitelty disulfidisidoksia pilkkovalla pelkistimellä.
16. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1 - 15 mu-10 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun analysoitavan aineen määrittäminen tapahtuu fotometrises-ti.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu määritys tehdään 15 spektrofotometrisesti tai kolorimetrisesti.
18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu määritys tehdään turbidimetrisesti tai nefelometrisesti.
19. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että mainittu määritys tehdään käyttäen fluoresenssipolarisaation havaitsemista.
20. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1 - 7, 13 -17 ja 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu analysoitava aine määritetään epäsuorasti havait- 25 semalla leimalla varustetussa S-adenosyylihomokysteiinissä tai leimalla varustetussa furanoosi-6-tioeetterissä oleva kromofori tai fluorofori.
21. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veri-, veriplasma- tai virt- 30 sanäyte käsitellään pelkistimellä; näyte saatetaan koske tukseen adenosiinin ja S-adenosyylihomokysteiinihydrolaa-sin kanssa; tuloksena olevaa seosta inkuboidaan, jonka jälkeen se saatetaan kosketukseen ATP:n ja adenosiiniki-naasin kanssa ja seosta inkuboidaan vähintään yhden minuu-35 tin ajan; tuloksena oleva seos saatetaan kosketukseen lu- 106728 siferiinin ja lusiferaasin kanssa ja muodostunut valo havaitaan .
22. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veri-, veriplasma- tai virt- 5 sanäytettä käsitellään pelkistimellä; näyte saatetaan kosketukseen adenosiinin ja S-adenosyylihomokysteiinihydro-laasin kanssa; tuloksena olevaa seosta inkuboidaan, jonka jälkeen se saatetaan kosketukseen adenosiinideaminaasin, nukleosidifosforylaasin, ksantiinioksidaasin ja peroksi-10 daasin kanssa ja seoksen UV-absorptio määritetään.
23. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu näyte saatetaan kosketukseen adenosiinin ja S-adenosyylihomokysteiinihydro-laasin kanssa; tuloksena olevaa seosta inkuboidaan., jonka 15 jälkeen se saatetaan kosketukseen fluoroforileimalla varustetun S-adenosyylihomokysteiinin tai fluoroforileimalla varustetun furanoosi-6-tioeetterin kanssa; tuloksena oleva seos saatetaan kosketukseen monoklonaalisen anti-S-adeno-syylihomokysteiinivasta-aineen kanssa; ja vasta-aineeseen 20 sitoutunut tai vasta-aineeseen sitoutumaton fluoroforileimalla varustettu yhdiste määritetään fluoresenssipolari-saation avulla, mikä antaa tuloksen, joka on osoituksena näytteen alkuperäisestä homokysteiinipitoisuudesta.
24. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että mainittu näyte saatetaan kosketukseen adenosiinin ja S-adenosyylihomokysteiinihydro-laasin kanssa; tuloksena olevaa seosta inkuboidaan, jonka jälkeen se saatetaan kosketukseen leimalla varustetun S-adenosyylihomokysteiinin tai leimalla varustetun fura- 30 noosi-6-tioeetterin kanssa; tuloksena oleva seos saatetaan kosketukseen kantaja-ainematriksiin sidotun monoklonaalisen anti-S-adenosyylihomokysteiinivasta-aineen kanssa; vasta-ainetta sisältävä kantaja-ainematriksi pestään; ja vasta-aineeseen sitoutunut leimalla varustettu yhdiste 35 määritetään fotometrisesti, mistä saadaan tulos, joka on 106728 osoituksena näytteen alkuperäisestä homokysteiinipitoisuu-desta.
25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineeseen sitoutuneen 5 leimalla varustetun yhdisteen leima saatetaan reagoimaan, jolloin muodostuu kromofori, joka tämän jälkeen määritetään fotometrisesti.
26. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään määrittämäl- 10 lä vasta-aineen ja polyhapteenin muodostamien konjugaat-tien saostuminen tai agglutinaatio.
27. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittuna hapteenina käytetään yhdistettä, jolla on kaava 15 ^(CHsfeSCH* Ri \H 'H/ Cl) OH OH 20 (jossa Rx ja R2, jotka voivat olla saman- tai erilaiset, merkitsevät vetyatomeja tai OR4-ryhmiä, tai R-l ja R2 merkitsevät yhdessä happiatomia, R3 merkitsee amino- tai karbok-syyliryhmää ja R4 merkitsee alifaattista C^g-ryhmää), tai 25 sen suolaa tai esteriä.
28. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittuna hapteenina käytetään leimalla varustettua furanoosi-6-tioeetteriä, jonka leimalla varustettu osa käsittää kromoforin tai fluorofo- 30 rin tai radioaktiivisen atomin, ja jonka tioeetteriosa käsittää trimetyleenitio-osan.
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittuna leimalla varustettuna tioeetterinä käytetään patenttivaatimuksessa 27 esi 106728 tetyn määritelmän mukaista leimalla varustettua kaavan I mukaista yhdistettä.
30. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittuna entsyyminä käyte- 5 tään inaktivoitunutta SAH-hydrolaasia, joka aktivoidaan saattamalla se kosketukseen pelkistimen kanssa.
31. Analyyttinen testipakkaus, joka on tarkoitettu käytettäväksi näytteessä olevan homokysteiinin pitoisuuden määrittämiseen patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetel- 10 mällä, tunnettu siitä, että mainittu testipakkaus käsittää: homokysteiiniä muuttavan entsyymin; substraatin, joka on muu kuin homokysteiini, mainitun entsyymin homokysteiiniä muuttavaa reaktiota varten; signaalia muodostavan aineen; ja mahdollisesti keinon signaalin määrittämi- 15 seen.
32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää: mainittuna homokysteiiniä muuttavana entsyyminä S-adenosyylihomokysteii-nihydrolaasin; mainittuna entsyymin signaalia muodostavana 2. substraattina leimalla varustetun S-adenosyylihomokysteii- nin; mahdollisesti kantaja-ainematriksiin sidotun anti-S-adenosyylihomokysteiinivasta-aineen; ja mahdollisesti mainittuna signaalin määrityskeinona sellaisen keinon, jonka avulla mainittu leimalla varustettu S-adenosyylihomokyste- 25 iini tai sen havaittava johdannainen voidaan määrittää fotometrisesti, mistä saadaan tulos, joka on osoituksena näytteen alkuperäisestä homokysteiinipitoisuudesta.
33. Patenttivaatimuksen 31 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää mainittuna homo- 30 kysteiiniä muuttavana entsyyminä S-adenosyylihomokysteii- nihydrolaasin; mainitun entsyymin substraattina adenosii-nin; adenosiinia muuttavan entsyymin, joka ei ole S-adeno-syylihomokysteiinihydrolaasi; mahdollisesti mainitun adenosiinia muuttavan entsyymin adenosiinikosubstraatin; 35 ja mainittuna signaalinmäärityskeinona sellaisen keinon, 106728 jonka avulla mainitusta kosubstraatista tai adenosiinin entsymaattisesta muuttumistuotteesta, joka on syntynyt mainitun adenosiinia muuttavan entsyymin välityksellä, voidaan saada aikaan fotometrisesti havaittava vaste.
34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että mainittu adenosiinia muuttava entsyymi on adenosiinikinaasi ja siitä, että mainittu ai-kaansaamiskeino käsittää ATP:n, lusiferiinin ja lusiferaa-sin.
35. Patenttivaatimuksen 33 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että mainittu adenosiinia muuttava entsyymi on adenosiinideaminaasi ja mainittu aikaansaamis-keino käsittää nukleosidifosforylaasin, ksantiinioksidaa-sin ja peroksidaasin.
36. Patenttivaatimuksen 31 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää: mainittuna homo-kysteiiniä muuttavana entsyyminä S-adenosyylihomokysteii-nihydrolaasin; mainitun entsyymin substraattina adenosiinin; mahdollisesti matriksipartikkeleihin sidotun anti-S- 20 adenosyylihomokysteiinivasta-aineen; mainitun vasta-aineen polyhapteenin; ja vaihtoehtoisesti mainittuna signaalin-määrityskeinona sellaisen keinon, jonka avulla voidaan fotometrisesti määrittää vasta-aineen ja polyhapteenin muodostamien kompleksien agglutinaatio tai saostuminen.
37. Patenttivaatimuksen 31 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää ensimmäisessä osastossa olevan inaktiivisen SAH-hydrolaasin ja toisessa osastossa olevan pelkistimen, jolloin aktivoitu SAH-hydro-laasi muodostetaan sekoittamalla mainitun ensimmäisen ja 30 toisen osaston sisällöt keskenään.
38. Patenttivaatimuksen 37 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että mainittu toinen osasto käsittää happamessa väliaineessa olevan ditiotreitolin. 53 106728
FI943462A 1992-01-22 1994-07-21 Menetelmä ja analyyttinen testipakkaus homokysteiinin määrittämiseksi FI106728B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO920282A NO920282D0 (no) 1992-01-22 1992-01-22 Fremgangsmaate ved proeving av cystein
NO920282 1992-01-22
US83311892A 1992-02-10 1992-02-10
US83311892 1992-02-10
GB9204922 1992-03-06
GB929204922A GB9204922D0 (en) 1992-03-06 1992-03-06 Assay
GB9300138 1993-01-22
PCT/GB1993/000138 WO1993015220A1 (en) 1992-01-22 1993-01-22 Homocysteine assay

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI943462A0 FI943462A0 (fi) 1994-07-21
FI943462A FI943462A (fi) 1994-09-14
FI106728B true FI106728B (fi) 2001-03-30

Family

ID=27266081

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI943462A FI106728B (fi) 1992-01-22 1994-07-21 Menetelmä ja analyyttinen testipakkaus homokysteiinin määrittämiseksi

Country Status (18)

Country Link
EP (2) EP0726322B2 (fi)
JP (1) JP2870704B2 (fi)
AT (2) ATE142271T1 (fi)
AU (1) AU676480B2 (fi)
BR (1) BR9305780A (fi)
CA (1) CA2128512C (fi)
CZ (1) CZ287334B6 (fi)
DE (2) DE69304511T2 (fi)
DK (2) DK0726322T4 (fi)
ES (2) ES2196116T5 (fi)
FI (1) FI106728B (fi)
GR (1) GR3021365T3 (fi)
HU (1) HU219607B (fi)
NO (1) NO314946B1 (fi)
PT (1) PT726322E (fi)
RU (1) RU2121001C1 (fi)
SK (1) SK281517B6 (fi)
WO (1) WO1993015220A1 (fi)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5478729A (en) * 1994-04-28 1995-12-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Immunoassay for homocysteine
GB9617683D0 (en) 1996-08-23 1996-10-02 Univ Glasgow Homocysteine desulphurase
DE19713088C1 (de) * 1997-03-27 1998-11-26 Reiner Dr Probst Verfahren und Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben für die Homocystein- und/oder Folatbestimmung
US6020206A (en) * 1997-06-23 2000-02-01 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Homocysteine assay
US6468762B1 (en) 1997-07-24 2002-10-22 Anticancer, Inc. High specificity homocysteinases
US6140102A (en) * 1997-07-24 2000-10-31 Anticancer, Inc. High specificity homocysteinases and genes therefor
US6066467A (en) * 1997-07-24 2000-05-23 Anticancer, Inc. High specificity homocysteine assays for biological samples
US5985540A (en) * 1997-07-24 1999-11-16 Anticancer, Inc. High specificity homocysteine assays for biological samples
CA2335588A1 (en) 1998-06-29 2000-01-06 Edwin F. Ullman Assay for homocysteine
GB9900159D0 (en) * 1999-01-05 1999-02-24 Axis Biochemicals Asa Assay
WO2000040746A1 (en) * 1999-01-08 2000-07-13 Medical Analysis Systems, Inc. Compositions and methods for stabilizing thiol-containing biomolecules
AU780804B2 (en) 1999-02-01 2005-04-21 Anticancer, Inc. Homogeneous enzymatic assay for vitamin B6 and improvements in H2S detection
US6376210B1 (en) 1999-07-06 2002-04-23 General Atomics Methods and compositions for assaying analytes
US7192729B2 (en) 1999-07-06 2007-03-20 General Atomics Methods for assaying homocysteine
WO2001002600A2 (en) * 1999-07-06 2001-01-11 General Atomics Detection of analytes using attenuated enzymes
US6610504B1 (en) 2000-04-10 2003-08-26 General Atomics Methods of determining SAM-dependent methyltransferase activity using a mutant SAH hydrolase
GB0008784D0 (en) 2000-04-10 2000-05-31 Axis Shield Plc Assay
ATE414786T1 (de) * 2000-06-30 2008-12-15 Alfresa Pharma Corp Verfahren zur erkennung eines ganzen homocysteins
EP1592813B1 (en) * 2003-01-30 2012-12-26 BellBrook Labs, LLC Assay method for group transfer reactions
JP2006149203A (ja) * 2003-02-19 2006-06-15 Alfresa Pharma Corp ホモシステインの測定方法
US7097968B2 (en) * 2003-07-10 2006-08-29 General Atomics Methods and compositions for assaying homocysteine
US8476034B2 (en) 2003-07-10 2013-07-02 General Atomics Methods and compositions for assaying homocysteine
US7384760B2 (en) 2004-04-30 2008-06-10 General Atomics Methods for assaying inhibitors of S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase and S-adenosylmethionine (SAM)-dependent methyltransferase
GB0503836D0 (en) * 2005-02-24 2005-04-06 Axis Shield Asa Method
JP2007170992A (ja) * 2005-12-22 2007-07-05 Abbott Japan Co Ltd ホモシステインの免疫学的測定方法
JP6056138B2 (ja) 2010-12-28 2017-01-11 東ソー株式会社 免疫学的測定方法
JP5803104B2 (ja) * 2010-12-28 2015-11-04 東ソー株式会社 安定化されたｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素調製物
JP5919914B2 (ja) * 2012-03-15 2016-05-18 東ソー株式会社 ホモシステイン測定用前処理試薬

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5811857A (ja) * 1981-07-15 1983-01-22 Yamasa Shoyu Co Ltd アデノシンの定量法
JPS6030679A (ja) * 1983-07-29 1985-02-16 Nippon Zeon Co Ltd Ｓ−アデノシル−ｌ−ホモシステインハイドロラ−ゼの製造法

Also Published As

Publication number Publication date
AU676480B2 (en) 1997-03-13
EP0623174B1 (en) 1996-09-04
FI943462A0 (fi) 1994-07-21
AU4340893A (en) 1993-09-01
CZ287334B6 (en) 2000-10-11
PT726322E (pt) 2003-09-30
ES2196116T5 (es) 2012-04-11
JPH08506478A (ja) 1996-07-16
JP2870704B2 (ja) 1999-03-17
SK87894A3 (en) 1995-04-12
DK0726322T3 (da) 2003-07-28
ATE237696T1 (de) 2003-05-15
RU2121001C1 (ru) 1998-10-27
ES2196116T3 (es) 2003-12-16
ES2094524T3 (es) 1997-01-16
HUT67550A (en) 1995-04-28
EP0726322B2 (en) 2011-12-07
CA2128512C (en) 1999-12-07
HU219607B (hu) 2001-05-28
NO942729L (no) 1994-09-15
EP0726322A1 (en) 1996-08-14
NO314946B1 (no) 2003-06-16
DE69304511T2 (de) 1997-01-23
FI943462A (fi) 1994-09-14
CZ176394A3 (en) 1994-12-15
SK281517B6 (sk) 2001-04-09
DE69332891T3 (de) 2012-06-14
DK0623174T3 (da) 1997-01-13
HU9402170D0 (en) 1994-09-28
DE69304511D1 (de) 1996-10-10
DK0726322T4 (da) 2012-03-19
ATE142271T1 (de) 1996-09-15
CA2128512A1 (en) 1993-08-05
WO1993015220A1 (en) 1993-08-05
NO942729D0 (no) 1994-07-21
BR9305780A (pt) 1997-02-18
GR3021365T3 (en) 1997-01-31
RU94038061A (ru) 1996-05-27
DE69332891D1 (de) 2003-05-22
DE69332891T2 (de) 2004-02-19
EP0726322B1 (en) 2003-04-16
EP0623174A1 (en) 1994-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI106728B (fi) Menetelmä ja analyyttinen testipakkaus homokysteiinin määrittämiseksi
US5958717A (en) Immunoassay for homocysteine
Hammond et al. Fluorometric assay of sialic acid in the picomole range: a modification of the thiobarbituric acid assay
US4380580A (en) Heterogenous chemiluminescent specific binding assay
US4383031A (en) Homogeneous chemiluminescent specific binding assay
US4318980A (en) Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
EP1644741B1 (en) Methods and compositions for assaying homocysteine
US4492751A (en) Heterogenous specific binding assay employing an enzyme substrate as label
Mudd Enzymatic cleavage of S-adenosylmethionine
JPS63501571A (ja) Ｄ−ルシフェリン誘導体、および生化学物質定量に当っての酵素標識リガンド検出へのその利用および利用法
JPS6052378B2 (ja) 液体中のハプテン又は抗原を分析するための不均一系免疫分析方法及び試薬
EP2235201A1 (en) Methods and compositions for assaying homocysteine
US4629688A (en) Homogeneous specific binding assay method
US4791055A (en) Homogenous specific binding assay reagent system and labeled conjugates
Churchich et al. Nucleoside phosphorothioates as probes of the nucleotide binding site of brain pyridoxal kinase.
US20050019937A1 (en) Assay and kit for homocysteine
JP4286371B2 (ja) ホモシステインの定量法
Matherly et al. Identification of the enol tautomer of imidazolone propionate as the urocanase reaction product
JPH0423999A (ja) カルシウムの定量法
EP0079489A1 (en) Methotrexate-labeled iodothyronine conjugates and method, reagent means and test device for the determination of iodothyronine in or iodothyronine uptake of a liquid sample
Johnston TRYPTOPHAN METABOLISM IN THE KIDNEY

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired