JP2001206900A - トリフェニルスズ化合物の抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、トリフェニルスズ化合物の抗体及
び測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明の抗体は、トリフェニルスズ又は
その部分にスペーサーアーム及び結合のための官能基を
共有結合させた構造を有するトリフェニルスズ誘導体を
ハプテンとして使用することにより得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】トリフェニルスズ化合物等の
有機スズ化合物のハプテン化合物、抗原、抗体及びその
フラグメントに関する。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫化学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】トリフェニルスズ化合物は、以下の式
（２）：

【０００４】

【化３】

【０００５】［式（２）中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒおよ
びＩからなるグループから選択されるハロゲン原子であ
るか、あるいは、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ₃ＣＯＯ、ＣｌＣＨ₂Ｃ
ＯＯ、（ＣＨ₃）₂−Ｎ−ＣＳ−Ｓ、（Ｃ₆Ｈ₅）₃−Ｓｎ
−Ｏ及びＣＨ₂＝ＣＨ−ＣＨ₂からなるグループから選択
される基である］で表される構造を有する、有機スズ化
合物に含まれる、一群の化合物である。トリフェニルス
ズ化合物は、式（２）中のＸによって、酢酸トリフェニ
ルスズ、塩化トリフェニルスズ、クロロ酢酸トリフェニ
ルスズ、Ｎ，Ｎ−ジメチルジチオカルバミン酸トリフェ
ニルスズ、フッ化トリフェニルスズ、水酸化トリフェニ
ルスズ、酸化ビス（トリフェニルスズ）、水素化トリフ
ェニルスズ、アリルトリフェニルスズ等が知られてい
る。（以下、これらのトリフェニルスズ化合物を総称し
て「トリフェニルスズ」ということがある。） トリフェニルスズ化合物を含む有機スズ化合物は、「外
因性内分泌攪乱化学物質（環境ホルモン）」の１種とし
て、着目されている。「外因性内分泌攪乱化学物質」
は、いわゆる「環境ホルモン」とも呼称され、「動物の
生体内に取り込まれた場合に、本来、その生体内で営ま
れている正常なホルモン作用に影響を与える外因性の物
質」を意味する。近年、内分泌学を始めとする医学、野
生動物に関する科学、環境科学等の研究者・専門家によ
って、環境中に存在するいくつかの化学物質が、動物の
体内のホルモン作用を攪乱することを通じて、生殖機能
を阻害したり、悪性腫瘍を引き起こすなどの悪影響を及
ぼしている可能性があるとの指摘がなされている。これ
が「外因性内分泌攪乱化学物質（環境ホルモン）問題」
と呼ばれているものであり、環境保全上の新たで重要な
課題の一つとなっている。外因性内分泌攪乱化学物質問
題に関しては、人や野生動物への影響を示唆する科学的
報告が数多くなされているものの、報告された異常と原
因物質との因果関係、そうした異常が発生するメカニズ
ム等に関してはいまだ十分には明らかにされていない状
況にある（「外因性内分泌攪乱化学物質問題への環境庁
の対応方針について −環境ホルモン戦略計画ＳＰＥＥ
Ｄ’９８」、１９９８年５月、環境庁）。

【０００６】トリフェニルスズ化合物を含む有機スズ化
合物は、船底や漁網への生物の付着を防止する船底防汚
塗料や漁網防汚剤などとして、１９６０年半ばより多用
されてきた。しかしながら、近年、これらの有機スズ化
合物の野生動物への影響を指摘する報告が多数なされて
いる。具体的には、最も多く報告され懸念されているの
は、海産巻貝のインポセックスの原因物質として、トリ
ブチルスズ（ＴＢＴ）、トリフェニルスズ（ＴＰＴ）な
どの有機スズ化合物があげられていることである。イン
ポセックスとは雌に雄の生殖器官（ペニスおよび輪卵
管）が形成されて発達する現象のことで、雄性生殖器が
産卵口をふさぐため、生殖能力低下あるいは生殖不能を
招く。現在では世界各地で報告がされており、その原因
は有機スズ化合物によることがわかっており、外因性内
分泌攪乱化学物質によるという因果関係が証明された数
少ないケースの一つである。作用メカニズムはよくわか
っていないが、抗アンドロゲン物質によってインポセッ
クスが低減することから、ホルモン様作用であると考え
られている。レセプターアッセイは陰性のため、有機ス
ズ化合物がステロイドホルモン代謝酵素のアロマターゼ
を阻害することにより、性ホルモンのバランスを乱すも
のと推測されている。有機スズ化合物は難分解性であ
り、蓄積性もあり、インポセックスの他にも、長期的な
毒性として成長阻害、リンパ球の減少、個体数の減少等
にも関与していると指摘されている。

【０００７】有機スズ化合物は、水生生物に対する急性
毒性が非常に強く（ＬＣ₅₀＝０．１−１０μｇ／ｌ）、
残留性や慢性毒性もあるため、１９９０年代に入って規
制の対象となった。日本では、トリブチルスズ化合物の
うちビス・トリブチルスズ・オキシド（ＴＢＴＯ）が１
９９０年１月に化学物質の審査および製造等の規制に関
する法律（化審法）の第一種特定化学物質に指定され、
トリフェニルスズ化合物の７物質およびトリブチルスズ
化合物の１３物質も、同法の第二種特定化学物質に指定
された（「環境ホルモン・環境汚染懸念化学物質」第４
５頁−第４６頁、第６０頁−第６１頁、１９９９年３月
１日 （株）シー・エム・シー発行）。

【０００８】化学物質による環境汚染の未然防止と汚染
の早期発見及び適切な化学物質環境安全対策を目的とし
て、環境庁では、毎年化学物質環境安全性総点検調査が
行われている。その結果、トリフェニルスズ化合物およ
びトリブチルスズ化合物は環境中に広範囲に残留してお
り、その汚染レベルは水質、底質そして生物（魚介類）
ともに横這いまたは改善といった状況になっている（環
境庁ホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｃ．ｏ
ｒ．ｊｐ、平成１１年１１月２９日）。環境や食品に関
する安全確保のためには、これらの環境に含有される、
トリフェニルスズ化合物等の有機スズ化合物の量を迅速
かつ正確に測定調査し、監視する必要がある。

【０００９】従来、トリフェニルスズ等の有機スズ化合
物は、例えば水質試料、魚介類等の生物試料から精製し
た後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）やガスクロマト
グラフィー質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により分析されてき
た。そして、法規制及び使用実績の関係から典型的には
トリフェニルスズは塩化トリフェニルスズ換算値、トリ
ブチルスズはＴＢＴＯ換算値によって分析値が表示され
ている。但し、有機スズ化合物は、そのままの形ではＧ
Ｃに適用できないため、Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬によるア
ルキル化、テトラエチルホウ酸ナトリウム（ＮａＢＥｔ
₄）によるエチル化、四水素化ホウ酸ナトリウム（Ｎａ
ＢＨ₄）による水素化などにより、アルキル化ないし水
素化してから分析する必要がある。即ち、例えば、試料
をヘキサンで抽出し、Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬によって誘
導体化した後に、フロリジルカラムクロマトグラフィー
で精製後、ＧＣで測定する方法等が採用されている
（「環境ホルモンのモニタリング技術−分析・測定法の
実際−」 第１０９頁−第１１４頁、１９９９．１１．
１５ （株）シー・エム・シー発行）。これらの方法
は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、
分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備等に
高額の費用を必要とする等の問題点がある。トリフェニ
ルスズ等の有機スズ化合物の測定は短時間で膨大な数の
試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、
簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が
要求されてきている。

【００１０】免疫化学的測定方法は、抗体が抗原を特異
的に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出
を行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、
経済性から近年注目を集めてきている。免疫化学的測定
方法においては検出方法として非常に多種の標識、例え
ば、酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物
質、金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファー
ジが適用されてきた。

【００１１】免疫化学的測定方法の中でも、酵素を使用
する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特
に優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素
免疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載され
ている。

【００１２】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、トリフェニルスズのような
低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き
出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する
高分子化合物（タンパク質や多糖類など）に結合させる
ことによって初めて一団のエピトープとして行動し、Ｔ
細胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果、一
群のＢリンパ球により抗体が産生される。このように高
分子化合物と結合させて初めて免疫原性を生じる分子を
総称して「ハプテン」と言う。

【００１３】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１４】トリフェニルスズについては、その必要性
が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとよ
り、そのような抗体を作製するためのハプテンも本発明
前には得られていなかった。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、トリフェニ
ルスズ化合物に反応する新規な抗体若しくはそのフラグ
メント、及びその作製方法を提供することを目的とす
る。尚、本明細書において抗体の「フラグメント」と
は、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等
を意味する。

【００１６】本発明はその一態様において、トリフェニ
ルスズに反応性を有するモノクローナル抗体を提供す
る。本発明は、また、トリフェニルスズに反応性を有す
る新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン
化合物（トリフェニルスズハプテン）を提供することを
目的とする。

【００１７】本発明は、さらに、トリフェニルスズハプ
テンと高分子化合物との結合体を提供することを目的と
する。本発明は、さらにまた、前記抗体又はそのフラグ
メントを産生するハイブリドーマを提供することを目的
とする。

【００１８】本発明は、さらに、前記抗体若しくはその
フラグメント及び／又は前記トリフェニルスズハプテン
と高分子化合物若しくは標識物質との結合体を使用する
ことを含む、トリフェニルスズの免疫化学的測定方法を
提供することを目的とする。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、トリフェニルスズ又はその部分にスペー
サーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能
基を導入した、トリフェニルスズの誘導体をハプテンと
して使用することにより、前記化合物に反応性を有する
抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。

【００２０】本発明の対象となるトリフェニルスズ化合
物は、以下の式（２）：

【００２１】

【化４】

【００２２】［式（２）中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒおよ
びＩからなるグループから選択されるハロゲン原子であ
るか、あるいは、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ₃ＣＯＯ、ＣｌＣＨ₂Ｃ
ＯＯ、（ＣＨ₃）₂−Ｎ−ＣＳ−Ｓ、（Ｃ₆Ｈ₅）₃−Ｓｎ
−Ｏ及びＣＨ₂＝ＣＨ−ＣＨ₂からなるグループから選択
される基である］で表される構造を有する一群の化合物
である。

【００２３】本発明の抗体は、例えば、トリフェニルス
ズ化合物の一部分にスペーサーアーム及び結合に利用で
きる官能基を導入した誘導体をハプテンとして適当な高
分子化合物と結合させたものを抗原として用いることに
よって得ることができる。例えば、以下の式（１）：

【００２４】

【化５】

【００２５】［式（１）中、ｎは１−１０の整数であ
る］で表される構造を有する化合物を、抗体作製のため
のハプテンとして使用する。式（１）中、好ましくは、
ｎは２である。

【００２６】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、トリフェニルスズに
反応する抗体及びその作製方法、並びに該ハプテン化合
物又は該抗体を用いるトリフェニルスズの免疫化学的測
定方法に関する。

【００２７】トリフェニルスズハプテンの作製 式（１）で表されるトリフェニルスズハプテンは、公知
の方法に従って製造することができる。限定するわけで
はないが、例えば以下のような方法を用いることができ
る。

【００２８】まず、例えば、式（１）においてｎが２の
化合物の場合、以下の式（Ｘ１）：

【００２９】

【化６】

【００３０】で表される構造を有するトリフェニルスズ
ヒドリドに、以下の式（Ｘ２）

【００３１】

【化７】

【００３２】［式（Ｘ２）中、Ｐはカルボキシル基の保
護基である］で表される構造を有するオレフィン化合物
を反応させて、以下の式（Ｘ３）：

【００３３】

【化８】

【００３４】［式（Ｘ３）中、Ｐは先に定義した通りで
ある］で表される構造を有する化合物を得る。反応は、
０℃から２００℃、好ましくは室温から１００℃で、５
分から１０時間、好ましく１から４時間行う。

【００３５】式（Ｘ３）の化合物の合成のための反応
は、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、過酸
化ベンゾイル、過酸化ジ−ｔｅｒｔ−ブチル等のラジカ
ル反応開始剤の存在下で行うのが好ましく、また例え
ば、四塩化炭素、クロロホルム、テトラヒドロフラン、
ベンゼン、トルエン等の不活性溶媒中で行うこともでき
る。

【００３６】Ｐで示されるカルボキシル基の保護基は公
知のものでよく、具体例として、例えば、メチル基、エ
チル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキ
シベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリク
ロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチル
ジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、
トリメチルシリルエチル基等を挙げることができる。

【００３７】さらに、式（Ｘ３）の化合物からＰで表さ
れるカルボキシル基の保護基を除去することにより、式
（１）の化合物を得ることができる。カルボキシル基の
保護基の除去は、アルカリ加水分解、酸加水分解等の公
知の方法で行うことができる。

【００３８】すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｘ
３）の化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジ
クロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に
溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエ
ーテル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンス
ルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃か
ら溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から５０℃で、５
分から１０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応
させることにより式（１）の化合物を得ることができ
る。

【００３９】また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｘ
３）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノール、
テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機溶媒
に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム
又は水酸化カリウム等の水溶液を加えて、０℃から溶媒
の沸点の温度、好ましくは０℃から８０℃で、５分から
１０時間、好ましくは１時間から２時間撹拌反応させる
ことにより式（１）の化合物を得ることができる。

【００４０】更に、Ｐがベンジル基の場合、反応加水分
解は水素による加水素分解によっても行うことができ
る。更にまた、Ｐがシリル原子を含む基の場合、反応加
水分解はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、
ピリジニウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生させ
る試薬によっても行うことができる。

【００４１】ｎが２以外の場合も公知の方法を用いて式
（１）の化合物を合成できる。上述したような製造方法
によって得られた化合物を、必要に応じシリカゲルクロ
マトグラフィー又は再結晶操作等を行うことにより、さ
らに高純度の精製品とすることができる。

【００４２】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００４３】トリフェニルスズハプテンと高分子化合物
との結合体の作製 上述のように合成されたトリフェニルスズハプテンを適
当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原若しくは
固相化用抗原として使用する。

【００４４】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及
びＢＳＡが好ましい。

【００４５】トリフェニルスズハプテンと高分子化合物
との結合は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌ
ａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２３４ １０９０‐１０９４（１９５４））、又は活性
化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．
Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．４２ ３０１−３０
９（１９９４））等の公知の方法によって行うことがで
きる。

【００４６】混合酸無水物法において用いられる酸無水
物は、通常のショッテン−バウマン反応により得られ、
これを高分子化合物と反応させることにより目的とする
ハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショッテ
ン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣
用の化合物を使用することができ、例えば、トリブチル
アミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メ
チルモルホリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリ
ン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カ
リウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素
ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通
常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１
００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、
好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水
物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から
１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、
反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時
間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。
溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれ
の溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエ
チルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン
等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジク
ロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トル
エン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢
酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリア
ミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸
無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとして
は、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロ
ロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチ
ル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻
酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から
適宜選択され得る。

【００４７】一方、活性化エステル法は、一般に以下の
ように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機
溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロ
キシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく
酸イミド活性化エステルを生成させる。

【００４８】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」と言う）、ジオキサン等が使用できる。
反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく
酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、
より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは
１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好まし
くは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃
で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分か
ら６時間、より好ましくは１時間から２時間である。

【００４９】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反
応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６
時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応物
を、透析、脱塩カラム等によって精製して、トリフェニ
ルスズハプテンと高分子化合物との結合体を得ることが
できる。

【００５０】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をトリフェニルスズハプテンに結合させたもの
を、免疫化学的測定方法において使用することができ
る。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ
（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ
等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン
等の蛍光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光
物質などがある。

【００５１】ポリクローナル抗体の作製 トリフェニルスズハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、常法により本発明のポリクローナル抗体を作
製することができる。例えば、トリフェニルスズハプテ
ンとＫＬＨとの結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以
下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジ
ュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン
等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に
免疫することによって得ることができる。免疫される動
物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用で
きるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ
等を挙げることができる。ただし、ヒトは含まれない。

【００５２】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問
隔で複数回行うことができる。

【００５３】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、トリフェニルスズと反応するポリ
クローナル抗体の存在を評価することができる。本発明
においてトリフェニルスズハプテンと高分子化合物との
結合体を免疫用抗原として得られた抗血清は、後述する
間接競合ＥＬＩＳＡ法においてとも約０．０１μｇ／ｍ
ｌの濃度でトリフェニルスズと反応できる（実施例５、
図１）。

【００５４】モノクローナル抗体の作製 トリフェニルスズハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗
体を作製することができる。

【００５５】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するトリフェニルスズハプ
テンと高分子化合物との 結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日
本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載さ
れている。

【００５６】以下、本発明のトリフェニルスズに対する
モノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制
限されないことは当業者によって明らかであろう。
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル抗体に関して
記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができ
る。

【００５７】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００５８】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１， １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６
５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由
来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７７，１３１−１３３，（１９７
９））等を使用できる。

【００５９】上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を
含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイス
コフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融
合当日に約１×１０⁶以上の細胞数を確保する。

【００６０】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３
（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も
一般的に行われているのはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例え
ば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されてい
る。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）によ
る方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医
学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を
適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公
知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して
脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００６１】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００６２】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、トリフェニルスズに対する抗体活性
を測定する。

【００６３】さらに、測定によりトリフェニルスズに反
応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの
細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法とし
ては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマ
が含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天
培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレ
ーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソータ
ーによって１個の細胞を分離する「ソータークローン
法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用
いられる。

【００６４】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗トリフェニルスズ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温
器中）で培養するのが好ましい。

【００６５】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００６６】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗トリフェニルスズモノクローナル抗体として
使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウム
による塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を
集め精製することにより抗トリフェニルスズモノクロー
ナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場
合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせ
ることにより実施できる。

【００６７】以上のようにして得られた抗トリフェニル
スズモノクローナル抗体は、例えばＥＬＩＳＡ法などの
公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定す
ることができる。

【００６８】抗体によるトリフェニルスズの測定 本発明で使用する抗体によるトリフェニルスズの測定法
としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、Ｅ
ＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９
８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般
に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラ
ニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００６９】トリフェニルスズの測定は、各種ＥＬＩＳ
Ａ法のうち例えば間接競合ＥＬＩＳＡ法により、以下の
ような手順により行うことができる。 （ａ）まず、固相化用抗原であるトリフェニルスズハプ
テンと高分子化合物との結合体を担体に固相化する。

【００７０】（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相
表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質によりブ
ロッキングする。 （ｃ）これに各種濃度のトリフェニルスズを含む試料及
び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びトリフェニ
ルスズに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体
及び、トリフェニルスズ−抗体複合体を生成させる。

【００７１】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のトリ
フェニルスズの量を決定することができる。 （ａ）工程において、固相化用抗原を固相化する担体と
しては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用
されるものをいずれも使用することができる。例えば、
ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレー
トが挙げられる。

【００７２】固相化用抗原を担体に固相化させるには、
例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、イ
ンキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のも
のが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることがで
きる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌが
適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタ
イタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェ
ル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度
が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に
制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーション
が適している。

【００７３】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体を作製したトリフェニルスズハプテンと高分子化合
物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他の
ハプテンと高分子化合物との結合体を固相化抗原として
使用することも可能である。例えば、式（１）において
ｎが抗体作製用と相違する化合物を、固相化抗原として
使用することもできる。さらに、式（１）に含まれない
他のトリフェニルスズ化合物を固相化抗原として使用す
ることも可能である。

【００７４】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（トリ
フェニルスズハプテンと高分子化合物との結合体）を固
相化した担体において、トリフェニルスズハプテン部分
以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する
場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロ
ッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液
を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋ‐Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５
Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使
用することもできる。具体的には、限定されるわけでは
ないが、例えば抗原を固相化した部分にブロッキング剤
を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ ＮａＣ
ｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］
を適量加え、約４℃で、１時間ないし５時間インキュベ
ーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われ
る。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、ＰＢＳ
を用いることができる。

【００７５】次いで（ｃ）工程において、トリフェニル
スズを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を
固相化抗原及びトリフェニルスズと反応させることによ
り、固相化抗原−抗体複合体及びトリフェニルスズ−抗
体複合体が生成する。

【００７６】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のトリフェニルスズに対する抗体を加え、更に第
二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体
を順次加えて反応させる。

【００７７】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、
好ましくは約２５℃で約１時間行えばよい。反応終了
後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかっ
た第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、ＰＢ
Ｓを用いることができる。

【００７８】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合したマウス抗体に対する抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終
吸光度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となる
ように希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希
釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反
応は室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。
以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。ま
た、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二
抗体は不要である。

【００７９】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からトリフェニルス
ズの量を算出することができる。

【００８０】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨ溶液
を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定
する方法が適している。

【００８１】トリフェニルスズを添加しない反応溶液の
吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶
液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃
度のトリフェニルスズを添加した反応液の阻害率により
予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のトリフェ
ニルスズの濃度を算出できる。

【００８２】あるいはトリフェニルスズの測定は、例え
ば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用
いた直接競合ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。 （ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固
相化する。

【００８３】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質により、ブロ
ッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のトリフェニルスズ
を含む試料に、トリフェニルスズハプテンと酵素を結合
させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。

【００８４】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のトリフェニルスズの量を決定する。

【００８５】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００８６】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のトリフェニ
ルスズ並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無
関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それ
を防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前
述の間接競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。

【００８７】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、トリフェニルスズハプテンを酵素に結合す
る方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行っても
よい。例えば、前述した活性化エステル法を採用するこ
とができる。調製した酵素結合ハプテンは、トリフェニ
ルスズを含む試料と混合する。

【００８８】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合ＥＬＩＳＡ法における固相化抗
原の場合と同様に、抗体作製に使用したトリフェニルス
ズハプテン自体のみならず、式（１）で表される他のハ
プテンと高分子化合物との結合体を標識用抗原として使
用することも可能である。例えば、式（１）においてｎ
が抗体作製用と相違する化合物を、標識用抗原として使
用することもできる。さらに、式（１）に含まれない他
のトリフェニルスズ化合物も、標識用抗原として使用可
能である。

【００８９】（ｄ）工程においてトリフェニルスズを含
む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、トリフェニルスズと酵素結合ハプテンとの競合阻害
反応により、これらと固相化抗体との複合体が生成す
る。トリフェニルスズを含む試料は適当な緩衝液で希釈
して使用する。限定されるわけではないが、反応は例え
ば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担
体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプ
テンを除去する。洗浄液は例えばＰＢＳを使用すること
ができる。

【００９０】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合Ｅ
ＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより
検量線からトリフェニルスズの量を算出することができ
る。

【００９１】本発明のモノクローナル抗体Ｓｎ２Ｉ１−
９−１は、直接競合ＥＬＩＳＡ法において約０．１ｎｇ
／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１ｎｇ／
ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でトリフェニルス
ズと反応する（実施例７、図２）。

【００９２】さらに、前述したように直接競合ＥＬＩＳ
Ａ法において抗体作製用と異なるハプテンを標識用抗原
として使用でき、その組み合わせによって直接競合ＥＬ
ＩＳＡ法において固有の反応性を示す。

【００９３】本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合ＥＬＩＳＡ法又は間接競合ＥＬＩＳＡ
法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を
調べることができる。

【００９４】例えば、本発明のモノクローナル抗体Ｓｎ
２Ｉ１−９−１は、塩化トリフェニルスズ、フッ化トリ
フェニルスズ、水酸化トリフェニルスズ、酢酸トリフェ
ニルスズおよび酸化ビストリフェニルスズの各トリフェ
ニルスズ化合物と約０．０１ｎｍｏｌ／ｍｌないし約１
ｎｍｏｌ／ｍｌの範囲で反応する（実施例８、図３）。
一方、スズ元素を他の元素に置換した類縁化合物につい
ては、塩化トリフェニル鉛と若干の反応性を示すもの
の、他のトリフェニル化合物にはほとんど反応性を示さ
ず、本発明の抗体はトリフェニルスズ化合物に対して高
い特異性を有する（実施例８、図４）。以下、実施例に
よって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の
技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本
明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加
えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれ
る。

【００９５】

【実施例】実施例１ トリフェニルスズハプテンの合成

【００９６】

【化９】

【００９７】３−トリフェニルスズプロピオン酸エチル
（１）の合成 トリフェニルスズヒドリド１．７５ｇ（５ｍｍｏｌ）、
アクリル酸エチル０．７５ｇ（７．５ｍｍｏｌ）および
２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）３ｍｇの混
合物を６０℃で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮後、
残渣をシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝
８：１）で精製し、１．２ｇ（収率５３％）の（１）を
得た。

【００９８】３−トリフェニルスズプロピオン酸（２）
の合成 メタノール２０ｍｌ中の３−トリフェニルスズプロピオ
ン酸エチル（１）１．０ｇ（２．２ｍｍｏｌ）の溶液
に、水２０ｍｌ中の水酸化ナトリウム０．４４ｇ（１１
ｍｍｏｌ）の溶液を加え、２時間環流撹拌した。減圧下
にメタノールを留去し、残渣に２０ｍｌの水と３０ｍｌ
の酢酸エチルを加え分液した。水層を１Ｎの塩酸で酸性
にし、酢酸エチルで抽出した（３０ｍｌ×３）。酢酸エ
チル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮
した。残渣の結晶をリグロインで再結晶化し０．６９ｇ
（収率７４％）の（２）を得た。

【００９９】融点：＞２５０℃ 上記トリフェニルスズハプテン（２）の¹Ｈ ＮＭＲに
よる物性データ（ケミカルシフトδ）を以下に示す。

【０１００】

【表１】¹ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ） δ １．５８（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂）， ２．６５（２
Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），７．４５（１５Ｈ，ｍ，Ａｒ：
Ｈ），１２．２５（１Ｈ，ｓ，ＣＯＯＨ）実施例２ 免疫用抗原及びスクリーニング用抗原の作製 免疫用抗原及びスクリーニング用抗原としてトリフェニ
ルスズハプテンとＢＳＡとの結合体を混合酸無水物法を
用いて作製した。

【０１０１】実施例１で作製したトリフェニルスズハプ
テン２．１ｍｇ（５μｍｏｌ）をＤＭＦ ５ｍｌに溶解
し、Ｎ−メチルモルホリン２５μｌを添加し、室温で２
０分間撹拌した。次に、クロロ蟻酸イソブチル１０μｌ
を添加し、室温で２０分間撹拌した（これを、以下「Ａ
液」という）。

【０１０２】一方、ＢＳＡ ６７ｍｇ（１μｍｏｌ）を
蒸留水２ｍｌに溶解し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶
液を加えてｐＨを９に調整した後、撹拌しながらＤＭＦ
１．３ｍｌを滴下した。この溶液にｐＨが９になるよ
うに０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を適宜添加しなが
らＡ液を滴下し、４０℃にて一晩反応させた。反応後、
蒸留水にて４℃で透析したものを凍結乾燥し、トリフェ
ニルスズハプテンとＢＳＡとの結合体（以下、「トリフ
ェニルスズハプテン／ＢＳＡ結合体」と言う）を調製し
た。以下、免疫用抗原として用いた。

【０１０３】また、同様の方法を用いて、トリフェニル
スズハプテンとＲＳＡとの結合体（以下、「トリフェニ
ルスズハプテン／ＲＳＡ結合体」と言う）も作製した。実施例３ トリフェニルスズハプテンと標識物質との結
合体の作製 トリフェニルスズハプテンとＨＲＰとの結合体を活性化
エステル法により作製した。

【０１０４】トリフェニルスズハプテン０．０３ｍｍｏ
ｌを無水ＤＭＦ３０ｍｌに溶解し、濃度１μｍｏｌ／ｍ
ｌのトリフェニルスズハプテンＤＭＦ溶液を調製した。
一方、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド０．１ｍｍｏｌと
ジシクロヘキシルカルボジイミド０．１ｍｍｏｌをそれ
ぞれ各１ｍｌのＤＭＦに溶解し、濃度１００μｍｏｌ／
ｍｌのＤＭＦ溶液を調製した。

【０１０５】トリフェニルスズハプテンの１μｍｏｌ／
ｍｌ ＤＭＦ溶液５ｍｌにＮ−ヒドロキシこはく酸イミ
ドの１００μｍｏｌ／ｍｌ ＤＭＦ溶液５０μｌとジシ
クロヘキシルカルボジイミドの１００μｍｏｌ／ｍｌ
ＤＭＦ溶液５０μｌを添加し、室温にて一晩撹拌して反
応させた。反応後、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心
し、上清と沈殿とに分離した。

【０１０６】次に、ＰＢＳ４ｍｌにＨＲＰ２０．１ｍｇ
（０．５μｍｏｌ）を溶解した後、無水ＤＭＦ ０．５
ｍｌを添加した溶液を調製しておき、その溶液に前記の
上清２．５５ｍｌ（２．５μｍｏｌ）を加え、室温にて
一晩撹拌した後、４０℃にて１時間反応させた。反応
後、トリフェニルスズハプテンとＨＲＰとの結合体を１
４５ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２：以下「ＰＢＳ」と言う）中にメタノールを３０％含
有させた液で３回透析し、さらにＰＢＳによる透析を５
回行って精製した。以下、「ＨＲＰ結合トリフェニルス
ズハプテン」と言う。

【０１０７】実施例４ 免疫感作 免疫にはＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で作製
したトリフェニルスズハプテン／ＢＳＡ結合体（免疫用
抗原）１００μｇ又は２００μｇをＰＢＳ １００μｌ
に溶解し、等量のフロイント完全アジュバンドと混合し
て、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に接種した。その４週間
後に免疫用抗原１００μｇとフロイント不完全アジュバ
ントを前記と同様に混合し、マウスの皮下に追加免疫し
た。さらにその２週間後に同様にして免疫用抗原１００
μｇとフロイント不完全アジュバントの混合物をマウス
の皮下に追加免疫した。また、その２週間後にＰＢＳ
２００μｌに溶解した免疫用抗原３０μｇをマウスの尾
静脈又は腹腔に追加免疫した。

【０１０８】実施例５ 抗血清の塩化トリフェニルスズ
に対する反応性 実施例４におけるマウス尾静脈への接種直前、採血した
抗血清を希釈調製して、以下に詳述する間接競合ＥＬＩ
ＳＡ法にて塩化トリフェニルスズを測定し、抗血清を評
価した。

【０１０９】免疫用抗原と同様に調製したトリフェニル
スズハプテン／ＲＳＡ結合体溶液（０．１μｇ／ｍｌ）
を５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルマイクロプレート
にコーティングし（５ｎｇ／５０μｌ／ウェル）、４倍
希釈したブロックエース （「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」、
雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）でブロッキ
ングしてアッセイ用プレートを作製した。これに抗血清
４０００倍希釈液と、各種濃度の塩化トリフェニルスズ
と２μｇ／ｍｌのＢＳＡを溶解した６０％メタノール−
ＰＢＳ溶液とを等量混合し、その５０μｌを各ウェルに
入れ、室温で２時間反応させた。

【０１１０】ＰＢＳで５回洗浄した後に、１０倍希釈の
ブロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキ
シダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ社製）
を５０μｌ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応さ
せた。ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍｇ／ｍｌのＯＰ
Ｄ及び０．０２％の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ／ウェルの量
で加え、室温にて１０分間反応させて発色させた。

【０１１１】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で
加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
結果の一例を図１に示す。図１より、マウスの抗血清
（ポリクローナル抗体）を使用することにより、塩化ト
リフェニルスズの量を０．０１μｇ／ｍｌないし１００
μｇ／ｍｌの範囲で測定することができた。

【０１１２】実施例６ ハイブリドーマの作製 実施例４に続いて、血清中の抗トリフェニルスズ抗体活
性が高くなったマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞（Ｓ
ｐ２／０−Ａｇ１４）とを山下修二らの方法（組織細胞
化学：日本組織細胞化学会編：学際企画．１９８６年）
に従ってポリエチレングリコール法により融合し、培養
した。実施例５と同様の方法でコーティング及びブロッ
キングしたプレートに６０％メタノール−ＰＢＳ溶液を
５０μｌ／ウェルの量で加え、次いで、細胞の増殖が認
められた培養上清液をそれぞれ５０μｌ／ウェルの量で
加え、室温にて２時間反応させた。

【０１１３】ＰＢＳで５回洗浄した後、１０倍希釈のブ
ロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシ
ダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ社製）を
５０μｌ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させ
た。ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ
及び０．０２％の過酸化水素を含む０．１Ｍ クエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ／ウェルの量
で加え、室温にて１０分間発色させた。

【０１１４】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で
加えて、反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定し、
反応性を示す細胞（ハイブリドーマ）を選抜した。次
に、各ウェルの塩化トリフェニルスズとの反応性を実施
例５に記載した間接競合ＥＬＩＳＡ法で調べ、目的の抗
体を産生している細胞について限界希釈法によりクロー
ニングを行った。その結果、数株のハイブリドーマが抗
トリフェニルスズ抗体を産生する細胞としてクローン化
された。そのうちのＳｎ２Ｉ１−９−１を平成１２年１
月１８日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６９７で、工
業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６
茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。

【０１１５】実施例７ 直接競合ＥＬＩＳＡ法による塩
化トリフェニルスズの測定 実施例６で得られたハイブリドーマＳｎ２Ｉ１−９−１
をマウスの腹腔に移植し、１０日後ないし１５日後に得
られた腹水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル
抗体を分取した。（以降、モノクローナル抗体は、これ
らを産生するハイブリドーマと同一の名称を用いる。）
このＳｎ２Ｉ１−９−１抗体を用いて直接競合ＥＬＩＳ
Ａ法にて塩化トリフェニルスズの量を測定した。

【０１１６】上記のＳｎ２Ｉ１−９−１抗体溶液（１０
μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルマイ
クロプレートに入れ、４℃で一晩静置してコーティング
し、さらに４倍希釈のブロックエース（雪印乳業社製）
でブロッキングを行い、アッセイ用のプレートを作製し
た。各種濃度の塩化トリフェニルスズを含む２０％メタ
ノール−ＰＢＳ溶液と、実施例３で作製したＨＲＰ結合
トリフェニルスズハプテンのＰＢＳ溶液との等量混合液
を５０μｌずつ各ウェルに入れ、２５℃で１．５時間反
応させた。

【０１１７】反応後、ＰＢＳで５回洗浄した後、２ｍｇ
／ｍｌのＯＰＤ及び０．０２％の過酸化水素を含む０．
１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ
ずつ各ウェルに入れ、室温で１０分間静置して発色反応
を行った。

【０１１８】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌずつ各ウェルに
加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定
した。この結果を図２に示した。図２より、直接競合Ｅ
ＬＩＳＡ法において、本発明のモノクローナル抗体Ｓｎ
２Ｉ１−９−１は、塩化トリフェニルスズを０．１ｎｇ
／ｍｌないし１００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定することが
できた。

【０１１９】実施例８ モノクローナル抗体の交差反応
性の評価 実施例６で得られたハイブリドーマＳｎ２Ｉ１−９−１
に由来するモノクローナル抗体Ｓｎ２Ｉ１−９−１につ
いて、その培養上清を用いてＢＳＡを添加しないこと以
外は実施例５に記載した間接競合ＥＬＩＳＡ法と同様に
して、５種類のトリフェニルスズ化合物及び５種類のト
リフェニルスズ類縁化合物に対する反応性を検討した。

【０１２０】この結果を図３及び図４に示す。ここで、
阻害率は次式で定義される。

【０１２１】

【化１０】

【０１２２】図３より、本発明のモノクローナル抗体Ｓ
ｎ２Ｉ１−９−１は、トリフェニルスズ基を有する一群
の化合物をいずれも０．０１ｎｍｏｌ／ｍｌないし１ｎ
ｍｏｌ／ｍｌの範囲で測定できた。

【０１２３】また、図４に示すように、塩化トリフェニ
ルスズのスズ元素を他元素に置換した類縁化合物に対
し、本抗体は塩化トリフェニル鉛とは反応するが、塩化
トリフェニルメタン、塩化トリフェニルケイ素、塩化ト
リフェニルゲルマニウムとは反応しないことが分かっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、間接競合ＥＬＩＳＡ法を用いた、抗血
清による塩化トリフェニルスズとの反応性を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体Ｓｎ２Ｉ
１−９−１を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法による塩化ト
リフェニルスズとの反応性を示す。

【図３】図３は、培養上清を用いた間接競合ＥＬＩＳＡ
法による、モノクローナル抗体Ｓｎ２Ｉ１−９−１の評
価を示す。

【図４】図４は、培養上清を用いた間接競合ＥＬＩＳＡ
法による、モノクローナル抗体Ｓｎ２Ｉ１−９−１の評
価を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/531 Ｃ０７Ｆ 7/22 Ｌ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ０７Ｆ 7/22 15/00 Ｅ (72)発明者 宗像 浩 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 面田 内記 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡邊 繁幸 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 鎌田 良雄 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA20 CC24 DA13 DA16 4B065 AA92X AB05 AC14 BA08 BD39 CA25 4H045 AA11 BA52 CA42 DA70 DA76 EA50 4H049 VN03 VP01 VQ25 VR24 VU31

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、ｎは、１−１０の整数である］で表され
   る構造を有する化合物と高分子化合物を結合させること
   により抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、以
   下の式（２）： 【化２】 ［式（２）中、 Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなるグループから選
   択されるハロゲン原子であるか、あるいは、Ｈ、ＯＨ、
   ＣＨ₃ＣＯＯ、ＣｌＣＨ₂ＣＯＯ、（ＣＨ₃）₂−Ｎ−ＣＳ
   −Ｓ、（Ｃ₆Ｈ₅）₃−Ｓｎ−Ｏ及びＣＨ₂＝ＣＨ−ＣＨ₂
   からなるグループから選択される基である］で表される
   構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製造すること
   を特徴とする、式（２）で表される構造を有する化合物
   に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。
2. 【請求項２】請求項１に記載の方法により製造された、
   式（２）で表される構造を有する化合物に反応性を示す
   抗体又はそのフラグメント。
3. 【請求項３】モノクローナル抗体である、請求項２に記
   載の抗体又はフラグメント。
4. 【請求項４】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６９７で寄託
   されているハイブリドーマによって産生されるモノクロ
   ーナル抗体Ｓｎ２Ｉ１−９−１である、請求項２若しく
   は３に記載の抗体又はフラグメント。
5. 【請求項５】請求項２ないし４のいずれか１項に記載の
   抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。
6. 【請求項６】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６９７で寄託
   されている、請求項５に記載のハイブリドーマ。
7. 【請求項７】請求項２ないし４のいずれか１項に記載の
   抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
   （２）で表される構造を有する化合物の免疫化学的測定
   方法。
8. 【請求項８】さらに、請求項１において式（１）で表さ
   れる構造を有する化合物、および／又は、請求項１にお
   いて式（１）で表される化合物と高分子化合物若しくは
   標識物質との結合体を用いることを含む、請求項７に記
   載の免疫化学的測定方法。