JP7219925B2 - p-ボロノフェニルアラニン誘導体及びそれを含む組成物、並びにそれらを製造するためのキット - Google Patents
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Description
<1>
以下の式(I):
矢印は隣接する原子との結合をかし、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである]
で表される基が、直接的に又はリンカーを介して連結しているポリマーを含む、
p-ボロノフェニルアラニン誘導体。
<2>
2個以上の前記式(I)の基が、直接的に又はリンカーを介して前記ポリマーに連結されており、
ここで前記式(I)の基のそれぞれは、同一であっても異なってもよい、<1>に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。
<3>
数平均分子量が1,000Da以上である、<1>又は<2>に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。
<4>
前記ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリペプチド、ポリサッカリド、及びそれらの共重合体から成る群から選択される、<1>~<3>のいずれか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。
<5>
前記ポリマーがポリビニルアルコールである、<1>~<4>のいずれか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。
<6>
以下の式(II)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、<5>に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
L1及びL2は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R1及びR2は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
m=0~3,998であり、
n=1~2,000であり、
m+2n=10~4,000であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。]
<7>
前記ポリマーがポリペプチドである、<1>~<4>のいずれか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。
<8>
以下の式(III)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、<7>に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体:
L3及びL4は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R3及びR4は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R5aは、それぞれ独立して、以下の(IV-a)又は(IV-b)の基:
であり、
R5bは、それぞれ独立して、以下の式(IV-c)~(IV-g)からなる群から選択される基:
矢印はNHへの結合を示し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
Y+は、H+、アルカリ金属イオン又はテトラ-C1-6アルキル-アンモニウムイオンである)
であり、
p=0~299であり、
q=1~300であり、
r=0~299であり、
p+q+r=10~300であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。]
<9>
以下の式(V)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、<7>に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体:
L5及びL6は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R6及びR7は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R8aは、以下の式(VI-a)の基:
であり、
R8bは、それぞれ独立して、以下の式(VI-b)~(VI-h)からなる群から選択される基:
矢印はカルボニル炭素への結合を示し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである)
であり、
s=0~299であり、
t=1~300であり、
u=0~299であり、
s+t+u=2~300であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。]
<10>
以下の式(XX)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、<7>に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体:
L11及びL12は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R15及びR16は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R17aは、以下の式(XXI-a)の基:
であり、
R17bは、それぞれ独立して、以下の式(XXI-b)~(XXI-h)からなる群から選択される基:
矢印はNHへの結合を示し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである)
であり、
x=0~299であり、
y=1~300であり、
z=0~299であり、
x+y+z=10~300であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。]
<11>
以下の式(XXII)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、<5>に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体:
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
L13及びL14は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R18及びR19は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R20は、それぞれ独立して、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、-NR21R22基、又は以下の基:
であり、
R21及びR22はそれぞれ独立して、水素であるか、又はハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基であり、
a=1~3,998であり、
b=0~3,997であり、
c=1~2,000であり、
a+b+2c=10~4,000であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。]
<12>
<1>~<11>のいずれか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体を含む、組成物。
<13>
腫瘍を治療するための、<12>に記載の組成物。
<14>
腫瘍を診断又は検出するための、<12>に記載の組成物。
<15>
式(VII):
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである]
で表される化合物と、
前記式(VII)の化合物と反応して<1>~<11>のいずか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体を形成することができるポリマーと
を含む、<1>~<9>のいずれか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体、又は<10>~<12>のいずれか1つに記載の組成物を製造するためのキット。
<16>
それを必要とする対象に、有効量の<1>~<11>のいずれか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体を投与することを含む、腫瘍の治療方法。
<17>
それを必要とする対象に、有効量の<1>~<11>のいずれか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体を投与することを含む、腫瘍の診断又は検出方法。
<18>
腫瘍の治療のための、<1>~<11>のいずれか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。
<19>
腫瘍の診断又は検出のための、<1>~<11>のいずれか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。
<20>
腫瘍を治療するための医薬の製造における、<1>~<11>のいずれか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体の使用。
<21>
腫瘍の診断又は検出のための医薬の製造における、<1>~<11>のいずれか1つに記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体の使用。
本明細書において、「C1-10アルキル基」とは、炭素数1~10の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基である。C1-10アルキル基の例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、1-エチルプロピル、n-ヘキシル、イソヘキシル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、2-エチルブチル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニル、n-デシルなど挙げられる。C1-10アルキル基は、C1-8アルキル基、C1-7アルキル基、C1-6アルキル基、C1-5アルキル基、C1-4アルキル基などを含む。
硫酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸などの無機酸との塩、
酢酸、シュウ酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、エタンスルホン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、ガラクタル酸、ナフタレン-2-スルホン酸などの有機酸との塩、
リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、アルミニウムイオンなどの1種または複数の金属イオンとの塩、
アンモニア、アルギニン、リシン、ピペラジン、コリン、ジエチルアミン、4-フェニルシクロヘキシルアミン、2-アミノエタノール、ベンザチンなどのアミンとの塩
が挙げられる。
本発明のBPA誘導体は、以下の式(I)で表されるBPA由来の基が、直接的に又はリンカーを介して連結しているポリマーを含む:
矢印は隣接する原子との結合を表し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである。]
矢印は隣接する原子との結合を表し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである。]
矢印は隣接する原子との結合を表し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
Y+は、例えばH+、アルカリ金属イオン又はテトラ-C1-6アルキル-アンモニウムイオンである。]
矢印は隣接する原子との結合を表し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
Y+は、例えばH+、アルカリ金属イオン又はテトラ-C1-6アルキル-アンモニウムイオンである。]
矢印は隣接する原子との結合を表し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである。]
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
L1及びL2は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R1及びR2は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
m=0~3,998であり、
n=1~2,000であり、
m+2n=10~4,000であり、
各繰り返し単位の順序は任意である(すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい)。]
またリンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
L3及びL4は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R3及びR4は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R5aは、それぞれ独立して、以下の(IV-a)又は(IV-b)の基:
であり、
R5bは、それぞれ独立して、以下の式(IV-c)~(IV-g)からなる群から選択される基:
矢印はNHへの結合を示し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
Y+は、H+、アルカリ金属イオン又はテトラ-C1-6アルキル-アンモニウムイオン(例えば、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラ-n-プロピルアンモニウム、テトラ-n-ブチルアンモニウム、テトラ-n-ペンチルアンモニウム、テトラ-n-ヘキシルアンモニウム)である)
であり、
p=0~299であり、
q=1~300であり、
r=0~299であり、
p+q+r=10~300であり、
各繰り返し単位の順序は任意である(すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい)。]
またリンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
L5及びL6は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R6及びR7は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R8aは、以下の式(VI-a)の基:
であり、
R8bは、それぞれ独立して、以下の式(VI-b)~(VI-h)からなる群から選択される基:
矢印はカルボニル炭素への結合を示し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである)
であり、
s=0~299であり、
t=1~300であり、
u=0~299であり、
s+t+u=2~300であり、
各繰り返し単位の順序は任意である(すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい)。]
またリンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
L7及びL8は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R9及びR10は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R11aは、以下の式(X-a):
であり、
R11bは、それぞれ独立して以下の式(X-b):
矢印はNHへの結合を示し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
Y+は、H+、アルカリ金属イオン又はテトラ-C1-6アルキル-アンモニウムイオン(例えば、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラ-n-プロピルアンモニウム、テトラ-n-ブチルアンモニウム、テトラ-n-ペンチルアンモニウム、テトラ-n-ヘキシルアンモニウム)である)
であり、
e=0~299であり、
f=1~300であり、
g=0~299であり、
e+f+g=10~300であり、
各繰り返し単位の順序は任意である(すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい)。]
またリンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
L9及びL10は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R12及びR13は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R14aは、以下の式(XII-a):
であり、
R14bは、それぞれ独立して以下の式(XII-b):
矢印はNHへの結合を示し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
Y+は、H+、アルカリ金属イオン又はテトラ-C1-6アルキル-アンモニウムイオン(例えば、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラ-n-プロピルアンモニウム、テトラ-n-ブチルアンモニウム、テトラ-n-ペンチルアンモニウム、テトラ-n-ヘキシルアンモニウム)である)
であり、
h=0~299であり、
i=1~300であり、
k=0~299であり、
h+i+k=10~300であり、
各繰り返し単位の順序は任意である(すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい)。]
またリンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
L11及びL12は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R15及びR16は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R17aは、以下の式(XXI-a)の基:
であり、
R17bは、それぞれ独立して、以下の式(XXI-b)~(XXI-h)からなる群から選択される基:
矢印はNHへの結合を示し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである)
であり、
x=0~299であり、
y=1~300であり、
z=0~299であり、
x+y+z=10~300であり、
各繰り返し単位の順序は任意である(すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい)。]
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
L13及びL14は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R18及びR19は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R20は、それぞれ独立して、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、-NR21R22基、又は以下の基:
であり、
R21及びR22はそれぞれ独立して、水素であるか、又はハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基であり、
a=1~3,998であり、
b=0~3,997であり、
c=1~2,000であり、
a+b+2c=10~4,000であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。]
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである]
で表される化合物と、
前記式(VII)の化合物と反応して式(I):
矢印は隣接する原子との結合を表し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである]
で表される基を形成することができるポリマーとを、水又は水含有溶媒(例えば、リン酸緩衝生理食塩水など)中で混合し、例えば4~100℃で、10分~1時間反応させることによって製造することができる。
本発明の組成物は、本発明のBPA誘導体を含む。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝剤、賦形剤又はこれらの組み合わせをさらに含んでも良い。本発明の組成物は、腫瘍の治療、診断、又は検出のために使用することができる。本発明の組成物を対象の生体内に投与する場合は、その投与経路は特に限定されないが、例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、関節内投与、腹腔内投与、眼内投与などが挙げられる。また、投与量は疾患の種類、対象の年齢、体重、性別などにより適宜選択される。
本発明のキットは、式(VII):
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである]
で表される化合物と、
前記式(VII)の化合物と反応して式(I):
矢印は隣接する原子との結合を表し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである]
で表される基を形成することができるポリマーと
を含む。
ポリビニルアルコール(PVA)の合成
<使用した試薬>
特に記述のない試薬及び溶媒は、市販品をそのまま使用した。
酢酸ビニル:市販品 (和光、和光特級) をアルゴン雰囲気下で蒸留したものを使用。
シアノメチル メチル(フェニル)カルバモジチオエート(Cyanomethyl methyl (phenyl) carbamodithioate): Sigma Aldrich
α, α’-アゾビスイソブチロニトリル (AIBN) : Sigma Aldrich
メタノール(MeOH) (試薬特級) : ナカライテスク
5 mol/l 塩酸 (質量分析用) : 和光純薬工業株式会社
5 mol/l 水酸化ナトリウム (質量分析用) : 和光純薬工業株式会社
ベンゼン (試薬特級) : 和光純薬工業株式会社
テトラヒドロフラン(THF) : 和光純薬工業株式会社
りん酸二水素ナトリウム(NaH2PO3) : 和光純薬工業株式会社
りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
<使用した機器>
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) : BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
GPC (Gel Permeation Chromatography) : 日本分光株式会社
PVAcを測定したカラム:TSK-gel superAW3000, superAW4000, 及びsuperAWL-guard column (Tosoh Corporation)
PVAを測定したカラム:Superdex 200 Increase 10/300 GL (GEヘルスケア)
検出器:RI-2031
PVAにBPAが結合したBPA誘導体(PVA-BPA)の結合評価
<使用した試薬>
特に記述のない試薬・溶媒は市販品をそのまま使用した。
5 mol/l 塩酸 (質量分析用) : 和光純薬工業株式会社
5 mol/l 水酸化ナトリウム (質量分析用) : 和光純薬工業株式会社
りん酸二水素ナトリウム (NaH2PO3) : 和光純薬工業株式会社
4-ボロノ-L-フェニルアラニン (BPA)(本試薬のホウ素は10B): Katchem
4-ボロノ-L-フェニルアラニン (11B-BPA)(本試薬のホウ素は、11B-BPAと10B-BPAが混在している):Sigma-Aldrich
アリザリンレッドS (ARS): 和光純薬工業株式会社
りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
D-フルクトース (以下で「Fru」とも呼ぶ): 和光純薬工業株式会社
なお、FruとBPAとを反応させて得られるBPA誘導体を以下で「Fru-BPA」とも呼ぶ。
<使用した機器>
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) : BRUKER AVANCEIII HD500 (500 MHz, BRUKER BioSpin)
蛍光分光光度計 (FP8300) : 日本分光株式会社
11B-BPA溶液:11B-BPA濃度191.3 mM = 40 mg / mL
Fru-11B-BPA溶液:11B-BPA濃度191.3 mM = 40 mg / mL,フルクトース濃度103.2 mg / mL
PVA-11B-BPA溶液:11B-BPA濃度191.3 mM = 40 mg / mL,PVA中ジオール濃度573.9 mM = 50.4 mg / mL
・Solution A : ARS (9.0×10-6 M)
・Solution B : ARS (9.0×10-6 M) + BPA (2.0×10-3 M)
・Solution C : ARS (9.0×10-6 M) + BPA (2.0×10-3 M) + PVA (ジオール濃度 = 5.0×10-1 M)
・Solution D : ARS (9.0×10-6 M) + BPA (2.0×10-3 M) + フルクトース(0.8×10-1 M)
・Solution E : ARS (9.0×10-6 M) + BPA (2.0×10-3 M) + グルコース(0.8×10-1 M)
PVA-BPAの細胞内取り込み
<使用した試薬>
ロズウェルパーク記念研究所培地 (RPMI) : Sigma Aldrich
D-PBS (-) : 和光純薬工業株式会社
ウシ胎児血清 (FBS) : Biosera
Trypsin-EDTA solution : Sigma life science
ペニシリン/ ストレプトマイシン : Sigma life science
Cy5-NHS : Thermo Fisher Scientific
LysoTracker (登録商標) red DND - 99 : Thermo Fisher Scientific
4-ジエチルアミノサリチルアルデヒド: 東京化成工業株式会社
メチルアミン : 東京化成工業株式会社
DMSO : ナカライテスク
2-アミノノルボルナン-2-カルボン酸 (BCH) : Sigma-Aldrich
Hoechst(登録商標) 33342 : Thermo Fischer Scientific.
4-ブロモ-L-フェニルアラニン (BPA) : Katchem
実施例1と同様の方法で製造されたPVA (Mn = 6,500 ~ 9,500)
りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
DAHMI: Springsteen G., et al., Acs Sensors 1, 1394-1397 (2016) に記載の方法に従って製造。
セルストレイナー:Falcon セルストレイナー 5 mL チューブ用 35 μm
BxPC3細胞 (ヒトすい臓癌細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
<使用した機器>
フローサイトメーター (FCM) :Guava easy Cyte 6 - 2L(Merck Millipore)
共焦点レーザー走査型顕微鏡 (CLSM):LSM710(Carl Zeiss)
Agilent 7900 ICP - MS(アジレント・テクノロジー株式会社)
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) : BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
PVA 125 mg (1.67 × 10-2 mmol) を6 mLバイアルに量り取り、2.5 mLのDMSOに溶解させた。次に、PVA溶液に対して1.2当量のCy5-NHSを1.23 mL (2.00 × 10-2 mmol) を加え、室温で3時間攪拌した。反応溶液を透析膜 (MWCO = 3.5kD) に入れ、2 Lの純水中で透析を3回行った。透析溶液中のフリーのCy5を完全に除くため、PD - 10 columnを用いて精製した後、凍結乾燥を行い、PVAとCy5-NHSとの反応物(Cy5-PVA)を青色個体として得た(収量 122 mg)。PVA中ジオール濃度0.34 mM及びBPA濃度0.11 mMとなるようにCy5-PVA 及びBPAを10 mM PBS (140 mM NaCl, pH 9.5)中で混合し、Cy5-PVA-BPAを調製した。平衡定数(pH7.4)に基づいて、調製された溶液において、 (遊離のBPA):(PVAに結合したBPA) =約60:40 (モル比率)と計算された。
Glass base dish(AGCテクノグラス社)にBxPC3細胞を5 × 104 cell / dishとなるよう播種し、24時間、前培養した。上記(1)で調製したCy5-PVA-BPA溶液またはFru-BPA溶液 (フルクトース濃度 = 0.28 mM, BPA濃度 = 0.11 mM)を、D-PBS/RPMI培地(10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin含有)混合液 (PBS : RPMI = 1 : 4)で調製し、これらのサンプルを1mLずつ各ウェルに加え、30分インキュベートした。培地を取り除いた後、2 mM DAHMI (BPA蛍光検出用化合物)/ DMSO 溶液10 μL と50 nM LysoTracker (登録商標) red DND - 99 / PBS 溶液990 μLを各ウェルに加え、30分インキュベートした。PBS 1 mLで3回洗浄後、PBS 1 mLを加え、CLSMで観察した。得られた結果を図2に示す。Fru-BPAは、細胞内に取り込まれると細胞質全体にBPAが分布することが確認された。一方、図2よりCy5-PVA及びBPAがリソソームと共局在していることから、Cy5-PVA-BPAはエンドサイトーシスで取り込まれることが示唆された。
PVA-BPAの細胞内取込量とLAT1介在性の評価
シャーレにBxPC3細胞を5 × 106 cells / well となるよう播種し、24時間、前培養した。次に、D-PBS / RPMI (10% FBS, 1% ペニシリン-ストレプトマイシン) 培地溶液 (D-PBS : RPMI = 1 : 4)を用いて、下記のサンプルを準備した。
PVA-BPA溶液 (ジオール濃度 = 3.03 mM,BPA濃度= 3.03 mM)
Fru-BPA溶液 (フルクトース濃度 = 7.82 mM, BPA濃度= 3.03 mM)
上記PVA-BPA溶液 + BCH(LAT1阻害剤)(20 mM)
上記Fru-BPA溶液 + BCH(20 mM)
BPAの有無によるPVAの細胞内取込量への影響
12-ウェルプレートにBxPC3を1 × 105 cell / well となるよう播種し、24時間、前培養した (n = 3) 。次に、D-PBS / RPMI (10% FBS, 1% ペニシリン-ストレプトマイシン) 培地溶液 (D-PBS : RPMI = 1 : 4)を用いて下記のサンプルを準備した
Cy5-PVA-BPA溶液 (PVAのジオール濃度 = 0.34 mM, BPA濃度= 0.11 mM)
上記Cy5-PVA-BPA溶液 + BCH (20.0 mM)
皮下腫瘍モデルに対する効果
<使用した試薬、細胞及び動物>
実施例1と同様の方法で製造されたPVA (Mn = 6,500~9,500)
5mol / l 塩酸 (質量分析用) : 和光純薬工業株式会社
5mol / l 水酸化ナトリウム (質量分析用) : 和光純薬工業株式会社
4-ボロノ-L-フェニルアラニン (BPA) : Katchem
りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
レモゾール : 和光純薬工業株式会社
ドライゾール : 関東化学
クライオスタット: Leica CM 3050S, Leica Microsystems, Nussloch GmbH, Germany
O.C.T コンパウンド: Sakura Finetek Japan, INC.
Hoechst(登録商標) 33342 : Thermo Fischer Scientific.
トマトレクチン, DyLight 488 コンジュゲート: Funakoshi
BxPC3細胞 (ヒトすい臓がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
CT26 細胞 (マウス大腸がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
BALB/cマウス:Charles River Japan
BALB/c nudeマウス:Charles River Japan
<使用した機器>
Agilent 7900 ICP - MS : アジレント・テクノロジー株式会社
共焦点レーザー走査型顕微鏡 (CLSM) : LSM710:Carl Zeiss
富士ドライケムNX500 : 富士フイルム株式会社
重水中性子照射設備 : KUR
オールインワン蛍光顕微鏡 (BZ - X710): KEYENCE
PVA-BPA (BPA濃度=191mM, PVAジオール濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)
Fru-BPA (BPA濃度=191 mM, フルクトース濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)
Cy5-PVA-BPAの腫瘍浸透性試験
実施例6と同様に、Cy5-PVA-BPA溶液とCT26皮下腫瘍モデルを準備し、腫瘍サイズがおよそ200 mm3のマウスに対して200 μL のサンプルを尾静脈から投与した (BPA 8 mg / マウス)。投与から5.5時間後にトマトレクチン-DyLight488溶液(50 μg)とHoechst33342 (50 μg)を静脈投与した。試料投与から6 時間後に腫瘍を摘出して腫瘍を中心で切り、その断面を下にした状態でガラスベースディッシュに載せてCLSMで観察した。得られた結果を図7に示す。Cy5-PVAが全体に分布していることから、BPAを腫瘍全体にデリバリーできていることが示唆された。
抗腫瘍効果
CT-26細胞をBalb/c マウスの右大腿付近に皮下移植し(2.0 x 105 cells/mouse)、腫瘍サイズが約50 ~ 100 mm3のマウスに対して250 μLの下記のサンプルをゆっくりと尾静脈投与した (BPA 10 mg / マウス)。
PVA-BPA (BPA濃度=191mM, PVAジオール濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)
Fru-BPA (BPA濃度=191 mM, フルクトース濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)
Fru-BPA (COLD) (n=8):Fru-BPAを注射しただけの検体。
PVA-BPA (COLD) (n=8):PVA-BPAを注射しただけの検体。
Control (HOT) (n=8):中性子線を照射しただけの検体。
Fru-BPA (HOT) 3h (n=8):Fru-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
PVA-BPA (HOT) 3h (n=4):PVA-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
PVA-BPA (HOT) 6h (n=8):PVA-BPAを注射してから6時間後に中性子線を照射した検体。
PVA-19F-BPAの19F核磁気共鳴シグナルと腫瘍集積性
<使用した試薬、細胞及び動物>
実施例1と同様の方法で製造されたPVA(Mn= 6,500~9,500)
5 mol / l 塩酸 (質量分析用) : 和光純薬工業株式会社
5 mol / l 水酸化ナトリウム (質量分析用) : 和光純薬工業株式会社
70% 硝酸(1.42):和光純薬工業株式会社
りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
2-アミノ-3-(4-ボロノ-2-フルオロフェニル)プロパン酸 (19F-BPA)(ラセミ体):Fluorotech LLC
CT26 細胞 (マウス大腸がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
BALB/cマウス:Charles River Japan
<使用した機器>
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) : BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
Agilent 7900 ICP - MS : アジレント・テクノロジー株式会社
19F-BPA (19F-BPA濃度=176mM)
Fru-19F-BPA (19F-BPA濃度=176mM, フルクトース濃度=573.9 mM)
PVA-19F-BPA (19F-BPA濃度=176mM, PVA中ジオール濃度 573.9 mM)
PVA-19F-BPAとFru-19F-BPAの体内動態
CT26細胞をBALB/cマウスに2.0 x 105 cells/mouseで皮下注射し、皮下腫瘍モデルを作成した。腫瘍サイズが約200 mm3に達したところでマウスに対して200 μLの下記のサンプルを尾静脈からゆっくりと投与した (19F-BPA 8 mg / マウス)。
PVA-19F-BPA (BPA濃度=176mM, PVAジオール濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)
Fru-19F-BPA (BPA濃度=176 mM, フルクトース濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]の合成
<使用した試薬>
ジメチルスルホキシド (DMSO) (水素化カルシウムで脱水してから蒸留精製して使用):和光純薬工業株式会社
Lys(TFA)-NCA:中央化成品株式会社
MeO-PEG-NH2 (PEGの分子量:10KDa):日油株式会社
メタノール:和光純薬工業株式会社
NaOH:和光純薬工業株式会社
HCl:和光純薬工業株式会社
ベンゼン: 和光純薬工業株式会社
ジエチルエーテル:関東化学株式会社
2,3,4,5-ジ-O-イソプロピリデン-ベータ-D-フルクトピラノース (DiOFru):東京化成工業株式会社
1,1'-カルボニルジイミダゾール (CDI):Sigma-Aldrich
トリフルオロ酢酸 (TFA):和光純薬工業株式会社
4-ボロノ-L-フェニルアラニン (BPA):KatChem
<使用した機器>
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) : BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
GPC (Gel Permeation Chromatography) : 日本分光株式会社
PEG-PLys(TFA)を測定したカラム:TSK-gel superAW3000, superAW4000, and superAWL-guard column (Tosoh Corporation)
PEG-PLysを測定したカラム:Superdex 200 Increase 10/300 GL (GEヘルスケア)
検出器:RI-2031
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]にBPAが結合したBPA誘導体(PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA)の腫瘍集積性と抗腫瘍効果の評価
<使用した試薬、細胞及び動物>
実施例11と同様の方法で製造されたPEG-P[Lys(Fru)/Lys](Mn = 24,100)
・5mol / l 塩酸 (質量分析用) : 和光純薬工業株式会社
・5mol / l 水酸化ナトリウム (質量分析用) : 和光純薬工業株式会社
・4-ボロノ-L-フェニルアラニン (BPA) : Katchem
・りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
・BxPC3細胞 (ヒトすい臓がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
・CT26 細胞 (マウス大腸がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
・BALB/cマウス:Charles River Japan
・BALB/c nudeマウス:Charles River Japan
<使用した機器>
Agilent 7900 ICP - MS : アジレント・テクノロジー株式会社
重水中性子照射設備 : KUR
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA in PBS (33 mg PEG-P[Lys(Fru)/Lys]/mouse, 8 mg BPA/mouse)
CT26皮下腫瘍モデルにおけるPEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAの抗腫瘍効果
CT-26細胞をBalb/c マウスの右大腿付近に皮下移植し(2.0 x 105 cells/mouse)、腫瘍サイズが約15 ~ 150 mm3のマウスに対して、250 μLの下記のサンプルをゆっくりと尾静脈投与した (BPA 10 mg / マウス)。
Fru-BPA (BPA濃度 = 192 mM, フルクトース濃度:BPA濃度 = 3:1) in PBS (pH 8.5)
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (BPA濃度=192mM , ポリマー側鎖のフルクトース濃度: BPA濃度=1.2:1) in PBS (pH 8.5)
Fru-BPA (COLD) (n=7):Fru-BPAを注射しただけの検体。
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (COLD) (n=4):PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAを注射しただけの検体。
Control (HOT) (n=6):中性子線を照射しただけの検体。
Fru-BPA (HOT) 3h (n=7):Fru-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
Fru-BPA (HOT) 6h (n=7):Fru-BPAを注射してから6時間後に中性子線を照射した検体。
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (HOT) 3h (n=6):PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (HOT) 6h (n=5):PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAを注射してから6時間後に中性子線を照射した検体。
P[Asp(glucamine)/Asp]の合成
<使用した試薬>
ジメチルスルホキシド (DMSO) (水素化カルシウムで脱水してから蒸留精製して使用):和光純薬工業株式会社
BLA-NCA:ナノキャリア株式会社
4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (DMTMM):和光純薬工業株式会社
トリエチルアミン (TEA): 和光純薬工業株式会社
ジエチルエーテル:関東化学株式会社
メタノール:和光純薬工業株式会社
NaOH:和光純薬工業株式会社
HCl:和光純薬工業株式会社
N,N-ジメチルホルムアミド (DMF): 和光純薬工業株式会社(脱水蒸留してから使用)
ジクロロメタン (DCM): 和光純薬工業株式会社(脱水蒸留してから使用)
4-ボロノ-L-フェニルアラニン (BPA):KatChem
D-グルカミン: 東京化成工業株式会社
<使用した機器>
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) : BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
GPC (Gel Permeation Chromatography) : 日本分光株式会社
PBLAを測定したカラム:TSK-gel superAW3000, superAW4000, 及びsuperAWL-guard column (Tosoh Corporation)
PAspを測定したカラム:Superdex 200 Increase 10/300 GL (GEヘルスケア)
検出器:UV-2070 (Ch.1), RI-2031 (Ch.2)
P[Asp(glucamine)/Asp]にBPAを結合させたBPA誘導体(P[Asp(glucamine)/Asp]-BPA)の腫瘍集積性
CT26細胞をBALB/cマウスに2.0 x 105 cells/mouseで皮下注射し皮下腫瘍モデルを作成した。腫瘍サイズが約200 mm3に達したところでマウスに対して200 μLの下記のサンプルを尾静脈からゆっくりと投与した (BPA 8 mg / マウス)。
P[Asp(glucamine)/Asp]-BPA (BPA濃度=192 mM, BPA濃度:グルカミン濃度=1:1.2) in PBS (pH 9)
BxPC3皮下腫瘍モデルにおけるPVA-BPAの抗腫瘍効果
BxPC3細胞をBalb/c マウスの右大腿付近に皮下注射し(5 x 106 cells/mouse)、腫瘍サイズが約500 mm3となったマウスに対して、250 μLの下記のサンプルをゆっくりと尾静脈投与した (BPA 10 mg / マウス)。
PVA-BPA (BPA濃度=191mM, PVAジオール濃度=574 mM) in water (pH 9.2)
Fru-BPA (BPA濃度=191 mM, フルクトース濃度=574 mM) in water (pH 9.2)
(pHはHCl水溶液及びNaOH水溶液にて調整した。)
Fru-BPA (HOT) (n=6):Fru-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
PVA-BPA (HOT) (n=6):PVA-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
BxPC3皮下腫瘍モデルにおけるPEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAの抗腫瘍効果
BxPC3細胞をBalb/c マウスの右大腿付近に皮下注射し(5 x 106 cells/mouse)、腫瘍サイズが約15 ~ 150 mm3のマウスに対して、250 μLの下記のサンプルをゆっくりと尾静脈投与した (BPA 10 mg / マウス)。
Fru-BPA (BPA濃度 = 192 mM, フルクトース濃度:BPA濃度 = 3:1) in PBS (pH 8.5)
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (BPA濃度=192mM , ポリマー側鎖のフルクトース濃度: BPA濃度=1.2:1) in PBS (pH 8.5)
Fru-BPA (HOT) (n=8):Fru-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (HOT) (n=8):PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
11-azide-3,6,9-trioxaundecane-1-amine : Sigma Aldrich
Methoxy-PEG10k-NH2 : NOF Co.
NCA-L-Lys(Tfa) : Chuo Kasei Co.
D-glucono-1,5-lactone : 東京化成工業
トリエチルアミン(TEA) : ナカライテスク
ジメチルスルホキシド(DMSO) : 和光純薬工業から購入したものをアルゴン雰囲気下で蒸留精製したものを使用
メタノール : 和光純薬工業
ベンゼン : ナカライテスク
ジエチルエーテル : 関東化学
5 mol/L水酸化ナトリウム水溶液 : 和光純薬工業
5 mol/L 塩酸 : ナカライテスク
重水(0.05 wt.% 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid, sodium salt : Sigma Aldrich
<使用した機器>
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) : BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
GPC (Gel Permeation Chromatography) : 日本分光株式会社
Superdex 200 Increase 10/300 GL (GEヘルスケア)
検出器:RI-2031
N3-PLys_(A)の合成
NCA-Lys(Tfa) 3.2 g (11.9 mmol)を秤量し、100 mL二口ナスフラスコにアルゴン雰囲気下で加えた。そこに、蒸留精製したDMSO 33 mLを加え、NCAを溶解させた。その後、開始剤 11-azide-3,6,9-trioxaundecane-1-amine 30 μL (0.151 mmol)を加え、40 ℃の水浴中で3日間撹拌した。その後、反応溶液を透析膜(MWCO =3.5 kD)に入れ、500 mLのメタノールに対して4 hの透析を3回行った。透析したサンプル溶液をロータリーエバポレーターにより、溶媒を留去したのち、一晩減圧乾燥した。得られた固形物にメタノール100 mLと5 Mの水酸化ナトリウム水溶液2 mL、超純水8 mLを加え、溶解させた。40 ℃の水浴中で一晩撹拌した。その後反応溶液を透析膜(MWCO=3.5 kDa)に入れ、1 Lの0.01 M水酸化ナトリウム水溶液に対して4 h透析を2回、その後、3 Lの超純水に対して4 hの透析を4回行った。透析したサンプルを500 mLのナスフラスコに入れ、凍結乾燥により溶媒を除去し、N3-PLys_(A)の白色固体を得た。1H-NMRより、得られた化合物の重合度は64.4であった。
N3-PLys_(B)の合成
開始剤 11-azide-3,6,9-trioxaundecane-1-amineを20 μL (0.101 mmol)使用した以外は、上記(1-1)と同様の方法で反応を行うことで、N3-PLys_(B)の白色固体を得た。1H-NMRより、得られた化合物の重合度は98.4であった。
N3-PLys_(C)の合成
開始剤 11-azide-3,6,9-trioxaundecane-1-amineを15 μL (0.0755 mmol)使用した以外は、上記(1-1)と同様の方法で反応を行うことで、N3-PLys_(C)の白色固体を得た。1H-NMRより、得られた化合物の重合度は130.4であった。
mPEG10k- PLysの合成
一端が-OMe基、もう一端が-NH2基で数平均分子量が10,000のポリエチレングリコール(以下 mPEG10k-NH2)を開始剤として、上記(1-1)と同様の重合反応を行った。mPEG10k-NH2 1.00 g (0.100 mmol)を秤量し、二口ナスフラスコに加え、ベンゼン2 mLに溶解させた。次に凍結乾燥により、溶媒を留去した。アルゴン雰囲気下で、蒸留精製したDMSO 10 mLを加え、溶解させた。次にアルゴン雰囲気下でNCA-Lys(Tfa) 1.61 gを秤量し、別の二口ナスフラスコに加えた。そこに精製蒸留したDMSO 16 mLを加え、溶解させた。シリンジを用いてNCA/DMSO溶液をPEG/DMSO溶液に加え、40 ℃の水浴で2日間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテル 500 mLに滴下し、再沈殿法により精製した。沈殿物を吸引ろ過により回収し、一晩減圧乾燥させることで、白色固体を得た。得られたポリマーを100 mLナスフラスコに加え、そこにメタノール 100 mLと5 M 水酸化ナトリウム水溶液 2 mL、超純水 8 mLを加え、40 ℃の水浴で一晩撹拌した。サンプル溶液を透析膜(MWCO 3.5 kDa)に入れ、1 Lの0.01 M 水酸化ナトリウム水溶液に対して、4 h透析を2回、その後、3Lの超純水に対して4 h透析を4回行った。透析したサンプル溶液を500 mLナスフラスコに入れ、凍結乾燥により、溶媒を留去し、白色固体のmPEG10k- PLys 1.3 gを得た。1H-NMRより、得られた化合物の重合度は52.1であった。
であった。
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A)の合成
200 mLナスフラスコに、上記(1-1)得られたN3-PLys_(A)1.3g(0.066mmol)、D-glucono-1,5-lactone 2.73g (15.3 mmol)、及びTEA 2.1mL(15 mmol)を加え、メタノール100 mLに溶解し、還流下で24 h撹拌した。その後ロータリーエバポレーターにより溶媒を留去し、得られた沈殿物を0.01 M塩酸30 mLに溶解した。サンプル溶液を透析膜(MWCO=3.5 kDa)に入れ、1 Lの0.01 M塩酸に対して4 h透析を1回、その後、3 Lの超純水に対して4 hの透析を4回行った。透析した溶液を0.45 μmのフィルターでろ過した後、凍結乾燥により溶媒を留去し、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A)2.5 gを白色固体で得た。1H-NMRより、グルコン酸の高分子への導入率は98.0%であった。また、重合度及び導入率から、Mn = 19763であった。また、GPCより、多分散指数(PDI)は1.22であった。
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B)の合成
N3-PLys_(A)の代わりにN3-PLys_(B)を1.6g(0.054mmol)使用したこと、D-glucono-1,5-lactoneを 3.36g (18.9 mmol)使用したこと、そしてTEAを 2.6mL(19 mmol)使用したこと以外は、上記(2-1)と同様の方法で反応を行うことで、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B) 3.0 gを白色固体で得た。1H-NMRより、グルコン酸の高分子への導入率は98.4%であった。また、重合度及び導入率から、Mn = 29712であった。また、GPCより、多分散指数(PDI)は1.24であった。
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C)の合成
N3-PLys_(A)の代わりにN3-PLys_(C)を1.5g(0.038mmol)使用したこと、D-glucono-1,5-lactoneを 3.15g (17.7 mmol)使用したこと、そしてTEAを 2.4mL(17 mmol)使用したこと以外は、上記(2-1)と同様の方法で反応を行うことで、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C) 2.9 gを白色固体で得た。1H-NMRより、グルコン酸の高分子への導入率は97.8%であった。また、重合度及び導入率から、Mn = 39636であった。また、GPCより、多分散指数(PDI)は1.35であった。
mPEG10k-P[Lys(Gluconate)/Lys]_の合成
上記(1-4)で得られたmPEG10k- PLys 1.3 g (0.050 mmol)、D-glucono-1,5-lactone 1.5 g (8.43 mmol)、及びTEA 0.83 mL (8.4 mmol)を50 mLナスフラスコに加え、そこにメタノール10 mLを加え溶解させた。還流下で24 h撹拌した。その後ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、得られた沈殿物を0.01 M塩酸10 mLに溶解させた。サンプル溶液を透析膜(MWCO=3.5 kDa)に入れ、1 Lの0.01 M塩酸に対して4 hの透析を一回、その後、3 Lの超純水に対して4 hの透析を4回行った。透析した溶液を0.45 μmのフィルターでろ過した後、凍結乾燥により溶媒を留去し、mPEG10k-P[Lys(Gluconate)/Lys]_ 1.8 gを白色固体で得た。1H-NMRより、グルコン酸の高分子への導入率は98.9%であった。また、GPCより、多分散指数(PDI)は1.16であった。
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPAの結合評価
<使用した試薬>
5 mol / L 塩酸: ナカライテスク
5 mol / L 水酸化ナトリウム水溶液 : 和光純薬工業
リン酸二水素ナトリウム (NaH2PO3) : ナカライテスク
[10B-rich] 4-borono-L-phenylalanine (BPA): Katchem
Alizarin Red S(ARS): 和光純薬工業株式会社
D-fructose : 和光純薬工業株式会社
D-glucose : ナカライテスク
D-sorbitol : 東京化成工業
<使用した機器>
蛍光分光光度計 (FP8300) : 日本分光株式会社
・Solution A : ARS (9.0×10-6 M)
・Solution B : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M)
・Solution C1 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), Sorbitol (0.05 M)
・Solution C2 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), Glucose (1.5 M)
・Solution C3 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), Fructose (0.1 M)
・Solution C4 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A) (0.01 M :側鎖グルコン酸基準)
・Solution C5 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B) (0.01 M :側鎖グルコン酸基準)
・Solution C6 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C) (0.01 M :側鎖グルコン酸基準)
Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPAの細胞への取り込み
(1)Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)の合成
実施例18(2-3)で合成したN3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C)100 mg ( 2.5 μmol) を6 mLバイアルに量り取り、 1.8 mL のDMSOに溶解させた。次に、12.5 mg/mL Cy5 - DBCO / DMSO溶液 224 μL ( 2.8 μmol) を加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を限外濾過膜 (MWCO = 10 kD) に入れ、そこに超純水10 mLを加え、限外ろ過を行った。さらに、超純水15 mLを加え限外ろ過を2回行った。限外ろ過精製したサンプルを更に精製するために、PD-10 カラム (GEヘルスケア)を用いて精製し、分取したサンプル溶液を凍結乾燥により溶媒を留去し、Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C) 97 mgを青色固体として得た。
顕微鏡観察用の8 wellプレート(Lab-Tek Chambered #1.0 borosilicate Coverglass system)にBxPC-3細胞を5 x 104 cell / wellとなるように播種し、37 ℃ 5 % CO2雰囲気下で一晩インキュベーションした(培地 : 10 % FBS, 1 % Penicilin-Streptmycin含有RPMI-1640)。インキュベーション後、アスピレータを用いて培地を取り除き、以下のサンプル溶液500 μLを加えた。
・Sorbitol-BPA : BPA (3.03 mM), Sorbitol (3.64 mM)/10 % PBS - 90 % RPMI培地
・Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPA : BPA (3.03 mM), Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C) (3.64 mM : 側鎖グルコン酸基準)/10 % PBS - 90 % RPMI培地
上記サンプル溶液は、リン酸緩衝液(10 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4)に10倍濃度で調整し、その後RPMI培地で希釈して使用した。サンプル溶液を加えた後、1 hインキュベーションした。その後、アスピレータでサンプル溶液を取り除き、20 μM DAHMI, 50 nM LysoTracker Green/PBS溶液500 μLを加え、30 minインキュベーションした。その後、アスピレータで溶液を取り除き、PBS 500 μLで3回洗浄した。洗浄後PBS 500 μLを加え、共焦点顕微鏡で蛍光を観察した。その結果を図18に示す。
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPA及びSorbitol-BPAの体内動態
<使用した試薬、細胞及び動物>
・実施例18で合成したN3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A)、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B)、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C)及びmPEG10k-P[Lys(Gluconate)/Lys]_
・D-Sorbtiol : 東京化成工業
・5 mol /L 塩酸 : ナカライテスク
・5 mol / L 水酸化ナトリウム (質量分析用) : 和光純薬工業
・L - 4 - boronophenyl - alanine (BPA) : Katchem
・硝酸(1.42) : 和光純薬工業
・CT26 細胞 (マウス大腸がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
・BALB/cマウス:Charles River Japan
<使用した機器>
Agilent 7900 ICP - MS : アジレント・テクノロジー株式会社
重水中性子照射設備 : KUR
・N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A)-BPA (BPA 240mM)
・N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B)-BPA (BPA 240mM)
・N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C)-BPA (BPA 240mM)
・mPEG10k-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPA (BPA 240mM)
・Sorbitol-BPA (BPA 240 mM, Sorbitol 288 mM)
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPAの抗腫瘍効果
CT-26細胞をBalb/c マウスの右大腿付近に皮下移植し(1.0 x 105 cells/mouse)、腫瘍サイズが約50 ~ 100 mm3のマウスに対して200 μLの下記のサンプルをゆっくりと尾静脈投与した (BPA 10 mg / マウス)。
・N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](B)-BPA (BPA 240mM)
・N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPA (BPA 240mM)
・Sorbitol-BPA (BPA 240 mM, Sorbitol 288 mM)
Control (HOT):中性子線を照射しただけの検体。
Sorbitol-BPA (HOT):Sorbitol-BPAを注射してから2.5時間後に中性子線を照射した検体。
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](B)-BPA (HOT):N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](B)-BPAを注射してから2.5時間後に中性子線を照射した検体。
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPA (HOT):N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPAを注射してから2.5時間後に中性子線を照射した検体。
P[VA(RGD)/VA]の合成
腫瘍関連血管や腫瘍細胞に過剰発現していると報告されている、αvβ3インテグリンに対して強いアフィニティを有する環状RGDfKペプチドをPVA側鎖に導入した。
特に記述のない試薬・溶媒は市販品をそのまま使用した。
・PVA(Mn=9200):実施例1(2)の方法にしたがって合成。
・cyclic RGDfKペプチド:Synpeptide社より購入
・CDI:Sigma Aldrich社より購入
・DMSO:和光純薬工業株式会社より購入
・DMSO-d6: 和光純薬工業株式会社より購入
P[VA(RGD)/VA]-BPAの腫瘍集積性評価
<使用した試薬、細胞及び動物>
・P[VA(RGD)/VA]:実施例23で製造したもの
・BPA:KatChem
・BxPC3細胞:American Type Culture Collection (Manassas, VA)
・BALB/c nudeマウス:Charles River Japan
P[VA(RGD)/VA]-BPA(BPA濃度:191 mM, P[VA(RGD)/VA]のジオール濃度:91 mM) in PBS (pH 10)
Claims (14)
- 2個以上の前記式(I)の基が、直接的に又はリンカーを介して前記ポリマーに連結されており、
ここで前記式(I)の基のそれぞれは、同一であっても異なってもよい、請求項1に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。 - 数平均分子量が1,000Da以上である、請求項1又は2に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。
- 前記ポリマーがポリビニルアルコールである、請求項1~3のいずれか1項に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。
- 以下の式(II)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項4に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体:
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
L1及びL2は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R1及びR2は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
m=1~3,998であり、
n=1~2,000であり、
m+2n=10~4,000であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。] - 前記ポリマーがポリペプチドである、請求項1~3のいずれか1項に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体。
- 以下の式(III)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項6に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体:
L3及びL4は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R3及びR4は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R5aは、それぞれ独立して、以下の(IV-a)又は(IV-b)の基:
であり、
R5bは、それぞれ独立して、以下の式(IV-c)~(IV-g)からなる群から選択される基:
矢印はNHへの結合を示し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
Y+は、H+、アルカリ金属イオン又はテトラ-C1-6アルキル-アンモニウムイオンである)
であり、
p=0~299であり、
q=1~300であり、
r=0~299であり、
p+q+r=10~300であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。] - 以下の式(V)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項6に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体:
L5及びL6は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R6及びR7は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R8aは、以下の式(VI-a)の基:
であり、
R8bは、それぞれ独立して、以下の式(VI-b)~(VI-h)からなる群から選択される基:
矢印はカルボニル炭素への結合を示し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである)
であり、
s=0~299であり、
t=1~300であり、
u=0~299であり、
s+t+u=2~300であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。] - 以下の式(XX)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項6に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体:
L11及びL12は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R15及びR16は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R17aは、以下の式(XXI-a)の基:
であり、
R17bは、それぞれ独立して、以下の式(XXI-b)~(XXI-h)からなる群から選択される基:
矢印はNHへの結合を示し、
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fである)
であり、
x=0~299であり、
y=1~300であり、
z=0~299であり、
x+y+z=10~300であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。] - 以下の式(XXII)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項4に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体:
X1~X4はそれぞれ独立して、H、18F又は19Fであり、
L13及びL14は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
R18及びR19は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、-CH(OA1)2又は検出可能な標識であり、
A1はC1-6アルキル基であり、
R20は、それぞれ独立して、ハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基、-NR21R22基、又は以下の基:
であり、
R21及びR22はそれぞれ独立して、水素であるか、又はハロゲンで置換されていてもよいC1-10アルキル基であり、
a=1~3,998であり、
b=1~3,997であり、
c=1~2,000であり、
a+b+2c=10~4,000であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。] - 請求項1~10のいずれか1項に記載のp-ボロノフェニルアラニン誘導体を含む、組成物。
- 腫瘍を治療するための、請求項11に記載の組成物。
- 腫瘍を診断又は検出するための、請求項11に記載の組成物。
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