CN101314785A - 利用微生物发酵生产Ectoine的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用微生物发酵生产Ectoine的方法，属于微生物发酵工程领域。该方法是将盐单胞菌属(Halomonas)一些具有Ectoine分泌特性的菌株在以谷氨酸单钠为唯一碳氮源，并且NaCl浓度15～120g/L的液体培养基中发酵，诱导其合成并分泌Ectoine，然后从发酵体系中回收Ectoine。上述方法使Ectoine发酵产率达到了6.4～7.9g/L/d，是现有技术的2.1～2.4倍，并且产物大部分分泌至培养基中，简化了产物回收工序，有利于实现连续培养；培养基NaCl浓度比现有技术降低了1/2～2/3，有利于减轻设备腐蚀，并降低下游加工成本。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及利用微生物发酵生产Ectoine的方法。
背景技术
1985年Galinski在嗜盐菌细胞中发现了补偿性溶质Ectoine，即1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸(1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine carboxylic acid)。此后的研究发现，Ectoine作为主要的补偿性溶质在中度嗜盐菌中普遍存在。Ectoine能够在高温、冷冻和干燥等逆环境下，对酶、DNA、细胞膜和整个细胞提供保护作用。因此，Ectoine在化妆品、生物制剂、酶制剂和制药等领域具有很大的应用价值和广泛的应用前景。
过去十几年间，高效生产Ectoine的工艺研究，首先是解决细胞的高密度培养，第一个用于批量生产的技术是Ectoine的“细菌挤奶”工艺(Bacterial Milking：A novel bioprocess for production of compatible solutes.Biotechnol.Bioeng.，57，306-313，1998)。Halomonas elongata DSM 142T在较高盐浓度(1.5mol/L)诱导下细胞合成Ectoine，经过分批流加的高密度发酵后，收集细胞，通过低渗胁迫使细胞迅速释放胞内Ectoine(约释放总合成量的64％)，随后，细胞再在含有较高盐浓度的培养基中生长，重新诱导合成胞内Ectoine，再行低渗透压释放，这种渗透压胁迫过程重复循环。一个完整的(含9个循环的)细菌挤奶工艺，Ectoine发酵产率约为3.3g/L/d。还有利用Brevibacterium epidermis DSM 20659菌株在较高盐浓度(1.0mol/L)下通过分批流加进行高密度培养后，收集细胞，通过低渗胁迫释放和酒精抽提胞内Ectoine相结合的方法收集Ectoine，收集胞内Ectoine后的细胞不能再重复用于发酵。Ectoine发酵产率为2g/L/d(Optimizationof ectoine synthesis through fed-batch fermentation of Brevibacterium epidermis.Biotechnol.Prog.，21，1206-1212，2005)。
上述工艺的特点是，菌株合成的Ectoine均存在于细胞内，它们不分泌Ectoine，发酵培养基中不积累Ectoine。当细胞内Ectoine积累量达到一定浓度时，其合成便受到抑制，即Ectoine的合成量受胞内Ectoine浓度阈值的限制。因此人们试图寻找使胞内Ectoine分泌至细胞外的方法。Grammann等在Halomonas elongata DSM 2581T(H.elongata DSM 2581T)中首次发现了一种新型的Ectoine特异性吸收系统TeaABC，该系统能够回收细胞输出和/或泄露至细胞周质或培养基中的Ectoine，包括向培养基中添加的Ectoine。Ectoine通过这种输出/吸收循环，调节细胞Ectoine的合成，达到并维持胞内的Ectoine浓度阈值，因此，在培养基中不积累Ectoine。而TeaABC缺陷的H.elongata DSM2581T菌株，则向培养基中分泌Ectoine，从而达到Ectoine的超量(超过胞内的Ectoine浓度阈值)合成的目的(A new type of osmoregulated solutetransporter identified in halophilic members of the Bacteria domain：TRAP-transporter TeaABC mediates the uptake of ectoine and hydroxyectoine inHalomonas elongata DSM2581T.J.Bacteriol.，184，3078-3085，2002)。利用这种TeaABC缺陷菌株经高密度发酵制备Ectoine，培养基中积累的Ectoine发酵产率约为2.1g/L/d(德国，DE10114189，2002年9月26日)。这项研究虽然解决了Ectoine分泌的问题，但是因为细胞生长缓慢、培养时间较长，约90小时达到生长的最高OD值，而且Ectoine的总合成量低，所以Ectoine发酵产率与非分泌菌株的“细菌挤奶技术”相比并没有得到明显改善。另外Schubert等人构建的合成并分泌Ectoine的基因工程大肠杆菌，Ectoine发酵产率为0.8g/L/d(Continuous synthesis and excretion of compatible solute ectoine by a transgenic，nonhalophilic bacterium.，Appl.Environ.Microbiol.，73，3343-3347，2007)，除Ectoine发酵产率较低外，基因工程大肠杆菌培养基中的启动转录诱导物价格昂贵。
现有技术中的Ectoine发酵方法的共同缺点是细胞生长缓慢，并且Ectoine合成量低。通过高密度发酵，尽管可以达到较高的细胞密度，然而由于细胞生长缓慢和合成量低，发酵产率仍然无法显著提高。本发明的发明人尝试通过控制代谢流来提高细胞的生长速率和Ectoine合成量，并促进Ectoine分泌，以解决上述现有技术中存在的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物发酵生产Ectoine的方法，相比于现有技术，该方法能提高Ectoine的发酵产率，并提高Ectoine总合成量中分泌Ectoine所占比例。
本发明的技术方案是将盐单胞菌属(Halomonas)细菌在以谷氨酸单钠为唯一碳氮源，并且NaCl浓度15～120g/L的液体培养基中发酵，诱导其合成并分泌Ectoine，然后从发酵体系中回收Ectoine；其中所述的盐单胞菌属(Halomonas)细菌是Halomona salina DSM 5928(H.salina DSM 5928)，Halomonas venustaDSM4743(H.venusta DSM4743)，Halomonas halodenitrificans DSM 735(H.halodenitrificans DSM 735)，Halomonas ventosae DSM 15911(H.ventosae DSM15911)，Halomonas pacifica DSM 4742(H.pacifica DSM 4742)或Halomonasalimentaria DSM 15356(H.alimentaria DSM 15356)。
此技术方案的提出基于发明人在对盐单胞菌属(Halomonas)细菌的研究过程中的发现，即：在一定条件下，该属的一些菌株将合成的Ectoine部分分泌至胞外培养基中，这是首次发现的野生型菌株分泌Ectoine的现象。其中尤以H.salina DSM 5928能够大量合成和分泌Ectoine。因此，本发明的技术方案优选将H.salina DSM 5928在以谷氨酸单钠为唯一碳氮源，并且NaCl浓度15～120g/L的液体培养基中发酵，诱导具合成并分泌Ectoine，然后从发酵液中回收Ectoine。
研究同时还发现：培养基碳源种类对H.salina DSM 5928的生长和Ectoine的合成量有非常大的影响。使用现有技术中常用于Ectoine诱导合成的培养基，如葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的培养基(Osmoregulation in Escherichia coli byaccumulation of organic osmolytes：betaines，glutamic acid，and trehalose.，Arch.Microbiol.，147，1-7，1987；Bacterial Milking：A novel bioprocess for production ofcompatible solutes，Biotechnol.Bioeng.，57，306-313，1998)，或者以蛋白胨和酵母膏为主要成分的培养基(Supplementation effects of hydroxyectoine on prolineuptake of downshocked Brevibacterium sp.JCM 6894.，J.Biosci.Bioeng.，101，178-184，2006)，H.salina DSM 5928生长缓慢，Ectoine合成量也不高，发酵产率≤2.0g/L/d(6L发酵罐数据)，而且合成的Ectoine仅在细胞内积累，培养基中没有Ectoine。
上述本发明的生产方法中，促进H.salina DSM 5928旺盛生长、大量合成并分泌Ectoine的重要条件是所使用的培养基，其基本特征之一是以谷氨酸单钠为唯一的碳氮源。谷氨酸促进细胞生长和Ectoine合成并分泌的原因，可能与谷氨酸强化Ectoine的合成流和三羧酸循环、促进了H.salina DSM 5928在盐胁迫下的生长代谢有关。Ectoine的合成途径是草酰乙酸经过天冬氨酸、天冬氨酸-β-磷酸、天冬氨酸-β-半醛、L-2，4-二氨基丁酸、Nγ-乙酰二氨基丁酸，最后转变为Ectoine。Ectoine的合成由来自三羧酸循环的草酰乙酸起始，而谷氨酸通过脱氨基生成α-酮戊二酸后直接进入三羧酸循环，然后经过若干步骤转化为草酰乙酸，谷氨酸为合成天冬氨酸提供了底物草酰乙酸。草酰乙酸转变为天冬氨酸以及从天冬氨酸-β-半醛转变为L-2，4-二氨基丁酸的反应，均是需要谷氨酸脱氨提供氨基的反应。可见，谷氨酸对Ectoine的合成流中的原料天冬氨酸的供应具有推动作用，另外在Ectoine合成流中的分支点处(天冬氨酸-β-半醛是进一步合成Ectoine、赖氨酸、通过高丝氨酸进一步合成苏氨酸和蛋氨酸等的共同底物)，谷氨酸对天冬氨酸-β-半醛向Ectoine支路合成具有拉动作用。结果，谷氨酸通过对三羧酸循环和Ectoine合成流的强化，促进Ectoine的合成，导致细胞在盐的诱导下生长速度快、代谢旺盛，Ectoine合成量显著超过其胞内浓度阈值，而超过其浓度阈值的部分，被分泌至细胞外，解除了胞内Ectoine浓度阈值对Ectoine合成的限制作用。经过优化，本发明中所述的生产方法中述及的培养基中谷氨酸单钠浓度优选30～80g/L，更优选60～80g/L。
本发明的技术方案中，培养基中不使用酵母膏等含有渗透压补偿性溶质组分，而现有技术中，盐单胞菌属(Halomonas)细菌在高盐度环境下诱导Ectoine合成时，为了使菌体较好生长，通常采取外源性补给渗透压补偿溶质的做法。发明人为此特别考察了酵母膏对Ectoine分泌的影响，但发现添加酵母膏等不利于Ectoine的合成和分泌，Ectoine的总合成量和分泌量均随酵母膏的浓度增加而减少(实施例3)。因此，本发明培养基中不添加外源性渗透压补偿溶质。
另一方面，发明人还考察了NaCl浓度对Ectoine分泌量的影响，发现菌株H.salina DSM 5928的胞内Ectoine浓度阈值随盐浓度的升高而升高，而Ectoine的分泌量则随NaCl浓度的降低而增加，较低的盐浓度有利于Ectoine的分泌(实施例4)。然而当NaCl浓度低于15g/L时菌体生长不良。基于此，上述本发明的微生物发酵生产Ectoine的方法中，所述培养基中NaCl浓度优选20～60g/L，最优选20～30g/L。
尽管对培养基中的其他小量/微量组分的选定可以参考现有技术中的技术方案，如参考文献“Optimization of ectoine synthesis through fed-batch fermentation ofBrevibacterium epidermis.Biotechnol.Prog.，21，1206-1212，2005”中所描述的内容，本发明还是对培养基中小量及微量组分进行了优化，除了上文所述的培养基中提及组分L-谷氨酸单钠和NaCl，其他加入的组分优选是：KH2PO4 2.5～3.5g/L，K2HPO48～10g/L，MgSO4·7H2O 0.3～0.5g/L及MnSO4·4H2O 0.01g/L；培养基优选去离子水配制，pH7.2。
上述培养基中添加组分的更优选的添加量分别是KH2PO4 3g/L，K2HPO49g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，NaCl 20～30g/L。
对上文所述各种培养基，最为优选的是：L-谷氨酸单钠60～80g/L，KH2PO43g/L，K2HPO4 9g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，NaCl 20～30g/L，pH7.2。
对于发酵培养的其他条件，比如接种量、培养温度、压力等，本领域的技术人员可以参考现有技术中对盐单胞菌属(Halomonas)细菌的培养方法选择，较为优选的此类培养条件也可以通过有限次数的实验考察得之，此非本发明的主要发明点所在，本说明书不再赘述。
上述本发明的利用微生物发酵生产Ectoine的方法选用具有Ectoine分泌特性的H.salina DSM5928菌株，采用以谷氨酸单钠为唯一碳氮源的培养基，并选用较低的NaCl浓度进行发酵，使Ectoine发酵产率达到了6.4～7.9g/L/d，是现有技术的2.1～2.4倍；所产生的Ectoine大部分分泌到培养基中，生产者既可以选择从培养体系高效率地回收Ectoine，也可以选择从培养基中回收Ectoine，当然后者更为推荐，因其不仅简化了产物回收工序，还可以实现菌体的连续发酵培养；此外，培养基中NaCl浓度比现有技术降低了1/2～2/3，大大降低了培养基盐浓度，能够减轻设备腐蚀，并有利于降低下游加工成本。
附图说明
本发明附图3幅，
图1是不同添加量的酵母膏对H.salina DSM 5928合成及分泌Ectoine的影响(实施例3)；
图2是不同浓度的NaCl对H.salina DSM 5928合成及分泌Ectoine的影响
(实施例4)；
图3是实施例5发酵罐培养过程中，H.salina DSM 5928合成及分泌Ectoine的情况。
具体实施方式
以下通过实施例的方式对木发明的内容做进一步的说明。如无特殊说明，采用下述产物测定的方法：
(1)细胞内Ectoine浓度测定：取发酵液1mL，4℃，12000rpm离心15分钟，NaCl-Kpi Buffer(100mmol/L，pH7.2，NaCl 60g/L)洗涤(4℃，12000rpm离心15分钟)，弃上清液，离心沉淀中加入1mL 80％乙醇，悬浮，室温静置过夜4℃，12000rpm离心15分钟，取上清液用于高效液相色谱(HPLC)测定。HPLC测定参照文献(Accumulation of ectoine in the halotolerantBrevibacterium sp.JCM 6894.，J.Biosci.Bioeng.，91，288-293，2001)进行。
(2)发酵液中Ectoine浓度测定：取发酵液1mL，4℃，12000rpm离心15分钟，取上清液，去离子水稀释10倍后用于HPLC测定。HPLC测定同(1)。
由于本发明中第一次发现野生型菌株分泌Ectoine的现象，因此还使用色质谱联用(LC-MS及核磁共振(NMR)对分泌产物进行了分子量和结构鉴定，具体方法为：
(3)分泌Ectoine的)LC-MS鉴定：取对数生长期的发酵液4℃下，12000rpm离心15分钟，取上清液，加入99.5％乙醇(发酵液∶乙醇＝1∶9)，4℃下静置30分钟，使发酵液中残留的谷氨酸单钠结晶析出，取其上清液用于LC-MS测定。LC-MS分析使用HPLC(Waters 2695 separation module)和质谱仪(Quattro Micro Waters公司，美国)。HPLC条件：色谱柱：Xterra
MS C18，5μm(2.1×150mm)，流动相为甲醇水溶液(甲醇∶水＝4∶1)，柱温35℃，流速0.2mL/min，紫外检测器，检测波长210nm。质谱条件：电喷雾电离，电离方式ES+，源温度120℃，检测器：Waters 2996 photodiode array detector。单级质谱和串联质谱电离电压分别为25V和20V。
(4)分泌Ectoine的NMR鉴定：取对数生长期的发酵液20mL，4℃，12000rpm离心15分钟，取上清液，加入99.5％乙醇(发酵液∶乙醇＝1∶9)，4℃下静置30分钟，使发酵液中残留的谷氨酸单钠结晶析出，取其上清液30℃减压蒸发至结晶，加入0.5mL D2O溶解，供NMR分析使用。NMR测定在核磁共振仪(Varian INOVA 400M NMR，Varian公司，美国)上进行，四甲基硅烷(TMS)为内标物，400MHz下记录1H-核磁共振(1H-NMR)波谱。测定样品与Ectoine标准品同时进行1H-NMR的测定。
本发明实施例所使用的菌种均购自德国DSMZ公司(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)。
Ectoine标准品购自德国Biomol公司。
菌种保存方法：菌株在装有5mL本发明所述培养基的试管中30℃、摇床(120rpm)培养24小时后，取菌液0.5mL与0.5mL 60％灭菌甘油混合，装入菌种冻存管中，-80℃低温冷冻保存。
实施例1
菌株：H.salina DSM 5928；
培养基：L-谷氨酸单钠30g/L，KH2PO4 3g/L，K2HPO4 9g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，NaCl 60g/L，pH7.2，0.2μm过滤灭菌；
培养方法：菌株在装有5mL上述培养基的试管中30℃、摇床(120rpm)培养24小时后，按1％(体积)接菌量转接至中30mL的上述培养基中(300mL三角瓶)，30℃、摇床120rpm培养，36小时取样测定胞内外Ectoine浓度；
结果：经分子量和结构鉴定及分析，培养基中有分泌的Ectoine；细胞内Ectoine浓度为0.56g/L，培养基中Ectoine浓度为0.68g/L，分泌率55％。
实施例2
菌株：盐单胞菌属(Halomonas)其他几种微生物，见表1；
培养基条件及培养方法如实施例1；实验结果如表1示：
表1
(未完待续)
(续表1)
由表1结果可见，在同样的培养条件下，并非所有的Ectoine合成菌株都能分泌Ectoine。
实施例3
本实施例考察添加酵母膏对H.salina DSM 5928合成及分泌Ectoine的影响。
本实施例在实施例1基础上，向培养基中添加0～10g/L的酵母膏，并按照实施例1的培养条件进行Ectoine诱导合成，并测定Ectoine总合成量(胞内Ectoine量与分泌Ectoine量之和)和分泌量，结果见附图1所示。
可见：Ectoine的总合成量和分泌量均随酵母膏的浓度增加而减少，特别是当酵母膏浓度达到10g/L时，H.salina DSM 5928仅分泌微量的Ectoine。
实施例4
菌株：H.salina DSM 5928；
培养基：除NaCl浓度分别设定为30、60、90及120g/L外，其余与实施例1相同；
培养方法：同实施例1；
结果：如附图2所示，其中，Ectoine分泌量和细胞内Ectoine量以每克干细胞的Ectoine的毫克数计算；由附图2可见，细胞内Ectoine量随NaCl浓度的增加而增加，而Ectoine分泌量却随NaCl浓度的降低而增加。30g/L NaCl浓度下Ectoine分泌量最高为196.4mg/g，分泌率为80.1％；当NaCl浓度升高至120g/L时，Ectoine分泌量降低为31.6mg/g，分泌率降低为13.2％；需要注意的是，本发酵条件下，NaCl浓度≤15g/L时，细胞生长不良，Ectoine合成量显著降低。
实施例5
菌株：H.salina DSM 5928；
培养基：L-谷氨酸单钠60g/L，KH2PO4 3g/L，K2HPO4 9g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，NaCl 30g/L，pH7.2，121℃、15分钟灭菌；
培养方法：发酵罐培养，反应器10L，装6L的培养基；最大通风量为10L/min，最大转速1000rpm，保持溶解氧水平在30％以上，用极性氧分压电极检测。玻璃pH电极检测并控制添加6M HCl，维持pH7.2；添加消泡剂(泡敌，中国旅顺化工厂)0.015％避免起泡；发酵罐中接种300mL H.salina DSM 5928培养液(500mL三角瓶，30℃、摇床120rpm.培养24小时的培养液)；培养过程定时取发酵液，按实施例1的方法测定分泌Ectoine浓度和细胞内Ectoine浓度，结果见附图3。
由附图3可见，在细胞生长的对数生长期和平衡期中，Ectoine的合成量和分泌量均随发酵时间的延长而增加，其最大值呈现在平衡期的末期(21小时)，最大分泌量为4.3g/L，最大总合成量为6.9g/L，Ectoine合成体积效率为7.9g/L/d。
实施例6
菌株：H.salina DSM 5928；
培养基：L-谷氨酸单钠80g/L，KH2PO4 3g/L，K2HPO4 9g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，NaCl 30g/L，pH7.2，121℃、15分钟灭菌；
培养方法：同实施例5；
结果：平衡期末期(27小时)时测定，最人分泌量为5.4g/L，最大总合成量为7.2g/L，Ectoine合成体积效率为6.4g/L/d。
Claims (8)
1、一种利用微生物发酵生产Ectoine的方法，是将盐单胞菌属(Halomonas)细菌在以谷氨酸单钠为唯一碳氮源，并且NaCl浓度15～120g/L的液体培养基中发酵，诱导其合成并分泌Ectoine，然后从发酵体系中回收Ectoine；
其中所述的盐单胞菌属(Halomonas)细菌是Halomonas salina DSM 5928，Halomonas venusta DSM4743，Halomonas halodenitrificans DSM 735，Halomonasventosae DSM 15911，Halomonas pacififca DSM 4742或Halomonas alimentariaDSM 15356。
2、根据权利要求1所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的盐单胞菌属(Halomonas)细菌是H.salina DSM 5928。
3、根据权利要求1或2所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的谷氨酸单钠浓度为30～80g/L。
4、根据权利要求3所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的谷氨酸单钠浓度为60～80g/L。
5、根据权利要求1、2或4中任一权利要求所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的培养基中NaCl浓度为20～60g/L。
6、根据权利要求5所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的培养基中NaCl浓度为20～30g/L。
7、根据权利要求1或2所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的培养基为：L-谷氨酸单钠30～80g/L，KH2PO42.5～3.5g/L，K2HPO4 8～10g/L，MgSO4·7H2O 0.3～0.5g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，NaCl 20～120g/L，去离子水配制，pH7.2。
8、根据权利要求7所述的利用微生物发酵生产Ectoine的方法，其特征在于所述的培养基为：L-谷氨酸单钠60～80g/L，KH2PO4 3g/L，K2HPO4 9g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，MnSO4·4H2O 0.01g/L，NaCl 20～30g/L，去离子水配制，pH7.2。
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