CN101191769A - 一种从中性嗜盐菌Halomonas salina检测和提取相容性溶质ectoine的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从中性嗜盐菌Halomonas salina检测和提取相容性溶质ectoine的新方法：将经过渗透压震荡的菌体，离心收集并冻干，经甲醇∶氯仿∶水(10∶5∶4)对冻干细胞进行抽提，剧烈震荡，离心促进分相，再加入氯仿和水，剧烈震荡，再次离心分相；回收含有相容性溶质的水相，冻干后溶于乙醇中；采用洗脱液的pH为7.0的Tris－HCl缓冲液，将ectoines从弱碱性阴离子二乙基氨乙基纤维素和弱酸性阳离子羧甲基纤维素串连柱上被洗脱下来，从而与混合物中的其他在生理条件下呈阳离子和阴离子的杂质分离，210nm紫外下检测，收集生理条件下的ectoines与其他有吸收峰的中性物质。相容性溶质Ectoine的进一步鉴定，其采用MECC胶束毛细管电泳法。本文中所采用的阴离子阳离子交换柱连用并以210nm紫外吸收峰作为检测信号的纯化方法不但比两次过柱节省了大量的时间，而且也提高了分离的效率，过柱一次就可以将各种阳离子、阴离子以及210nm下无吸收峰的中性化合物除去。
Description
技术领域
本发明涉及一种从中性嗜盐菌检测相容性溶质ectoine的方法
背景技术
在高渗环境中，微生物胞内水的溢出引起膨压减小，细胞体积缩小，相应的细胞内所有代谢物的浓度均升高而造成胞内水活度下降。这时，微生物通过在胞内积累有限的几种小分子溶质以提高细胞内水活度，使细胞的体积和膨压达到正常水平，并避免细胞内所有物质浓度的升高。
大多数耐盐微生物在长期的进化过程中逐步形成了适应渗透压变化的机制，它们通过在细胞内积累小分子有机溶质，如糖，多元醇，甜菜碱，氨基酸等来使细胞内外渗透压达到平衡。1972年Brown将这类能够高浓度积累，具有平衡细胞内外渗透压而又不影响细胞正常代谢功能的有机渗透溶质称为“相容性溶质”(compatible solutes)。到目前为止，已发现的相容性溶质主要有糖类的蔗糖、海藻糖；氨基酸中的脯氨酸、丙氨酸；氨基酸衍生物中的甜菜碱(N-三甲基甘氨酸)；“Ectoines”家族包括(1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸[ectoine]、1，4，5，6-四氢-2-甲基-5-羟基-4-嘧啶羧酸[hydroxyectoine])以及人工合成的衍生物Decarboxyectoine(4，5，6，7-四氢-2-甲基嘧啶)、Homoectoine(1，4，5，6，7-四氢-2-甲基-1，3-二氮-4-碳酸)。
L-Ectoine β-Hydroxyectoine Decarboxyectoine Homoectoine
Ectoines因在Ectothiorhodospira菌株中发现而得名，它具有高度的可溶性和生理pH条件下的非离子特性，所以成为嗜盐光合细菌主要的渗透压调节剂，ectoines除了可作为细胞、蛋白质、DNA等大分子在高盐、高热、冷冻、干燥、低氧等各种胁迫环境下的保护剂及化妆品和护肤品的保湿剂，还具有许多其他功能ectoines的手性模型(chiral building blocks)使它在化疗中可能可作为健康细胞的保护剂；它还可以清除包括超氧化物、羟氧基自由基、纯态氧及过氧化氢等各种羟自由基。可以作为细胞碳源、氮源和能源的储备形式，为细胞提供在饥饿状态下生存的必要物质以及防止蛋白质的错误折叠以及包涵体的形成，最新研究表明，ectoines对于消除阿尔兹海默氏综合症中形成的致病性不溶性聚合β-淀粉肽有很好的效果。一项最有前途的应用是用ectoines作为PCR稳定剂。
发明内容
菌株：TA-4，XM分离自同安盐田，本发明采用阴离子阳离子交换柱连用对ectoines提取物的初步分离，Ectoine的进一步鉴定采用MECC胶束毛细管电泳法。
附图说明
图1为210nm紫外吸收峰作为检测信号。
图2标准品ectoine的毛细管电泳图谱
图3混合物的毛细管电泳图谱
图4加入内标的混合物的毛细管电泳图谱
具体实施方式
相容性溶质ectoines的分离纯化与鉴定：将经过渗透压震荡的菌体TA-4，XM离心收集并冻干400μl甲醇∶氯仿∶水(10∶5∶4)对冻干细胞进行抽提，剧烈震荡60min，离心13000rpm，30min促进分相，加入130μl同样体积氯仿和水，剧烈震荡30min，再次离心分相。回收含有相容性溶质的水相，冻干后溶于乙醇中。由于ectoines在生理pH值条件(6.8～7.4)下为两性离子，因此当洗脱液的pH为7.0的Tris-HCl缓冲液，ectoines将会从弱碱性阴离子二乙基氨乙基纤维素(简称DEAE-纤维素)和弱酸性阳离子羧甲基纤维素(简称CM-纤维素)串连柱上被洗脱下来，从而与混合物中的其他在生理条件下呈阳离子和阴离子的杂质分离，210nm紫外下检测(ectoines在此波长有强烈吸收峰)收集生理条件下的ectoines与其他有吸收峰的中性物质。在已有的文献中，有人采用先将样品溶液通过阴离子交换柱，收集未结合与柱上的组分，冻干后溶于去离子水，然后再通过阳离子交换柱，收集洗脱组分，冻干得到粗分产物。本文中所采用的阴离子阳离子交换柱连用并以210nm紫外吸收峰作为检测信号的纯化方法不但比两次过柱节省了大量的时间，而且也提高了分离的效率，过柱一次就可以将各种阳离子、阴离子以及210nm下无吸收峰的中性化合物除去。
阴离子阳离子交换柱连用对ectoines提取物的初步分离
利用薄层层析可以对ectoines粗提物进行初步鉴定。以正丁醇∶甲酸∶水(75∶15∶10)为展层剂(其中水为固定相，有机溶剂为流动相)对混合物进行分离，显色剂为溶于0.2％正丁醇的水合茚三酮，标准品ectoine作为对照，130℃加热5min后，分离到的样品点呈红色，但由于得到的图谱清晰度不够高(无法拍照)，分离效果也不够好，所以还需要灵敏度更高的分析方法，粗略计算Rf值(原点中心至斑点中心的距离/原点中心至溶剂前沿的距离)为0.77。薄层层析法样品的预处理比较简单，对被分离样品的性质没有限制，可同时平行分离多个样品，但只适用于初步定性。
Ectoine的进一步鉴定采用MECC胶束毛细管电泳法，以50mmol/l磷酸-硼酸盐，50mmol/1SDS表面活性剂，pH7.0作为电泳缓冲液，温度25℃，电压30v，210nm检测吸光度值。根据标准品的毛细管电泳图谱(图2)以及样品的外标(图3)、内标图谱(图4)可以确定样品中含有目的产物ectoine。
由图2和3可知ectoine在6.01min出峰，加入内标的样品中ectoine出峰时间为5.94min，虽然与标准品相差0.07min，但峰的个数不变，而且误差是由于毛细管电泳仪的不稳定性，在系统可允许范围内，因此可确定提取样品中含有ectoine。
采用毛细管电泳分离样品具有高效(分离效率可达数百万理论塔板数，从根本上解决了HPLC分析最头痛的柱效问题)、快速(6min出峰)、样品消耗量很小(每次进样只是纳升级)、灵敏度高、耗资少、可对样品同时进行定性定量等优点，毛细管电泳使用方便是目前自动化程度最高的分离方法。但是它也有自身不可避免的一些缺点，例如制备能力差，样品对毛细管的吸附引起电渗变化从而影响分离重现性等，因此要大规模制备该种化合物还是要借助HPLC(高效液相色谱)，而为了解决分离重现性问题，则需要在样品中加入内标(如上)。
菌株TA-4，XM 16S rDNA序列分析
取对数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，提取基因组DNA。采用细菌16S rDNA通用引物Eubac27F 5’-AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG-3’，Eubac l492R为5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’进行PCR扩增菌株的16S rDNA。将PCR产物纯化处理后连接pMD 18-T Vector，转化大肠杆菌E.coli XL-Blue感受态细胞。在含有Ampicillin的L-琼脂平板培养基，选择Ampr转化子菌落。测序工作由博亚生物技术公司完成。将实验菌株的16S rDNA序列与GENBANK数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。并从数据库获得相关种属的16SrDNA序列，构建系统发育树。序列对排及进化树的构建采用DNA NEWMAN VERSION5.1软件。
经过测序与比对，菌株TA-4，XM的16S rDNA核苷酸序列全长分别为1500bp，1512bp，并且分别与盐单胞菌属、嗜盐菌属中Halomonas salina(盐盐单胞菌)及Halomonas sp.BYS-1(中度嗜盐菌)相似性达到99.5％，99.7％。基本上可认为它们同种。
Claims (3)
1.一种从中性嗜盐菌Halomonas salina检测和提取相容性溶质ectoine的方法：将经过渗透压震荡的菌体，离心收集并冻干，经甲醇∶氯仿∶水(10∶5∶4)对冻干细胞进行抽提，剧烈震荡，离心促进分相，再加入氯仿和水，剧烈震荡，再次离心分相；回收含有相容性溶质的水相，冻干后溶于乙醇中；其特征在于采用洗脱液的pH为7.0的Tris-HCl缓冲液，将ectoines从弱碱性阴离子二乙基氨乙基纤维素和弱酸性阳离子羧甲基纤维素串连柱上被洗脱下来，从而与混合物中的其他在生理条件下呈阳离子和阴离子的杂质分离，210nm紫外下检测，收集生理条件下的ectoines与其他有吸收峰的中性物质。
2.根据权利1的一种从中性嗜盐菌Halomonas salina检测鉴定相容性溶质ectoine的方法，其特征在于采用MECC胶束毛细管电泳法。
3.根据权利2的一种从中性嗜盐菌Halomonas salina检测鉴定相容性溶质ectoine的方法，其特征在于以50mmol/l磷酸-硼酸盐，50mmol/lSDS表面活性剂，pH7.0作为电泳缓冲液，温度25℃，电压30v，210nm检测吸光度值；根据标准品的毛细管电泳图谱以及样品的外标、内标图谱可以确定样品中含有目的产物ectoine。
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|---|---|---|---|---|
| CN101314785B (zh) * | 2008-07-22 | 2011-05-11 | 大连海事大学 | 利用微生物发酵生产Ectoine的方法 |
| CN104557729A (zh) * | 2014-12-11 | 2015-04-29 | 山东福田药业有限公司 | 一种四氢嘧啶的提取工艺 |
| CN113528595A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-10-22 | 中国热带农业科学院海口实验站 | 一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法 |
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