CN113528595A - 一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，通过将来源于新喀里多尼亚弧菌的ectABC基因簇，导入表达载体pBAD中，构成重组表达载体pBADVnectABC，并对重组菌株用L‑阿拉伯糖诱导表达，离心收集细胞，加入含有天冬氨酸钠、甘油和氯化钾的PBS缓冲液，进行全细胞催化；离心，收集上清，加入氯仿‑正丁醇混匀，剧烈震荡，离心，取水相；减压浓缩，并调节pH至4.5～5.5，经聚酰胺吸附纯化，乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩结晶处理，得到高纯度的四氢嘧啶成品，本发明不仅可在低盐环境下生产四氢嘧啶，而且实现了更加简便的四氢嘧啶纯化工艺，安全环保，成本低，四氢嘧啶的纯度高达95.6％，收率达72％。

Description

一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法

技术领域

本发明涉及基因工程和生物技术领域，特别涉及一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法。

背景技术

四氢嘧啶(ectoine，Ec)，是一种源于嗜盐具有渗透调节功能的相容性溶质，其作用是帮助嗜盐微生物维持细胞质与环境的渗透平衡。四氢嘧啶不仅是微生物细胞的渗透压调节物质，还是细胞及大分子物质的生物保护剂，可缓解高渗、高温、冻融、干燥、辐射和化学试剂对蛋白、核酸、生物膜及整个细胞的毒害作用。由于四氢嘧啶是所有己知的相容性溶质中对生物细胞及大分子物质保护效果最好的化合物，所以近年来它在医疗、酶工业、化妆品等领域的应用也日益受到关注。

目前获取四氢嘧啶的方法之一是通过嗜盐微生物发酵以获得大量四氢嘧啶。但从嗜盐微生物中分离纯化四氢嘧啶，则需要粉碎菌体或浸泡溶胀使四氢嘧啶释放出来，同时菌体破碎后产生的蛋白等杂质也增加了下游纯化的工艺。近年来，有专利通过重组大肠杆菌生产四氢嘧啶，且四氢嘧啶主要在发酵液中，但此专利采用双膜系统提取四氢嘧啶，此种方法虽然能耗较低，但菌体和蛋白很容易将膜孔径堵塞，大大缩短了膜的使用寿命，不符合实际生产的经济性。专利CN202011343592.9一种双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法，是从一种嗜盐菌体中分离纯化四氢嘧啶的方法，而通过嗜盐微生物在高盐浓度下发酵对设备损耗较大，而且提高了生产成本。专利201310518176.1一种四氢嘧啶高产大肠杆菌工程菌及其应用，生物转化反应后需要进行胞内/胞外四氢嘧啶的抽提，而其需要分别对胞内和胞外进行反复水相的抽提处理，其操作复杂且蛋白等杂质去除不充分，得率低等不足。因此，本发明寻求一种新的重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，以实现更加简化的纯化工艺，获得高收率、高纯度的四氢嘧啶成品。

发明内容

鉴以此，本发明提出一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，不仅可在低盐环境下生产四氢嘧啶，而且实现了更加简便的四氢嘧啶纯化工艺，安全环保，成本低，四氢嘧啶的纯度高达95.6％，收率达72％。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，包括如下步骤：

(1)生产四氢嘧啶：将来源于新喀里多尼亚弧菌的ectABC基因簇，通过酶切、连接导入到表达载体pBAD，构成重组表达载体pBADVnectABC，并导入大肠杆菌BW25113，构成重组菌株K-VnectABC(菌种保藏号：GDMCC No.61577，于中国广东省的GDMCC-广东省微生物菌种保藏中心，Escherichia coli K-VnectABC 菌种保藏日期为2021年3月24日)；重组菌株用L-阿拉伯糖诱导VnectABC 的表达，离心收集细胞，加入含有天冬氨酸钠、甘油和氯化钾的PBS缓冲液中，形成细胞悬浮液，进行全细胞催化，生产四氢嘧啶；

(2)纯化四氢嘧啶：将全细胞催化完成后的发酵液离心，收集上清，加入氯仿-正丁醇混匀，剧烈震荡，离心，取水相；将水相进行减压浓缩，并调节pH 至4.5～5.5后，经聚酰胺吸附纯化，乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩结晶处理，得到高纯度的四氢嘧啶成品，相比现有的四氢嘧啶生产及纯化技术(如膜系统过滤、电渗析法脱盐、活性炭脱色等方法)，本发明具有操作简便，安全环保，成本低、收率高、产品纯度高等优点，适合工业推广应用。

进一步说明，所述ectABC基因簇是由新喀里多尼亚弧菌中通过PCR克隆四氢嘧啶合成的基因簇ectABC，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1-4所示，其中，序列表SEQ IDNO.2-3依次为VnectA、VnectB和VnectC。

更优选的，步骤(1)中每100mM的PBS缓冲液中含有100mM天门冬氨酸钠、100mM氯化钾和100mM甘油，pH为7.0～7.5，温度为28℃。

更优选的，所述细胞悬浮液在28～32℃，180～220rpm条件下进行催化反应 24小时，生产四氢嘧啶。

更优选的，步骤(2)中，所述上清、氯仿与正丁醇按照体积比为(22～28): (3～5):1混合，并剧烈震荡25～35分钟。

更优选的，步骤(2)中，所述水相减压浓缩至原体积的20％，调节pH至 5.0，经聚酰胺树脂纯化，流速为1.8～2.2BV/h，由质量浓度为60％乙醇溶液洗脱，流速为0.6～1.5BV/h，收集洗脱液。

更优选的，所述聚酰胺树脂的目数为14～30目。

进一步说明，所述重组表达载体pBADVnectAB在大肠杆菌中的重组表达方法，具体为：

(1)在含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下接种含有重组表达载体 pBAD VnectABC的阳性克隆过夜；

(2)取过夜适量培养物按比例1:100加入LB培养基，在37℃下培养3小时，使其O6₆₀₀＝0.6；

(3)将L-阿拉伯糖添加到细菌培养物中使其终浓度为0.1％，在30℃，220 rpm诱导8h后，离心收集细胞。

更优选的，步骤(1)中，在加入PBS缓冲液前，采用0.85％NaCl溶液洗涤两次。

更优选的，所述浓缩结晶处理为：将洗脱液浓缩至浓度为50％，从50℃开始降温结晶至-4℃结晶结束，将粗晶再次重溶于质量浓度为60％乙醇溶液中，滤去杂质，重复浓缩结晶、干燥，得到高纯度的四氢嘧啶成品。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过采用新喀里多尼亚弧菌的ectABC基因簇，进行表达载体的构建，并对重组大肠杆菌在L-阿拉伯糖诱导VnectABC的表达的基础上，采用含有天冬氨酸钠、甘油和氯化钾的PBS缓冲液来制备细胞悬浮液，不需要添加葡萄糖下，即可进行全细胞催化生产四氢嘧啶，实现在低盐环境下有效生产四氢嘧啶；并通过优化了发酵液四氢嘧啶的纯化工艺，对发酵上清液采用氯仿-正丁醇进行提取联合酸性条件下的聚酰胺吸附处理，结合乙醇洗脱，洗脱液无酸碱度变化，无需进行分段上清的收集，洗脱液收集方便，所获得的四氢嘧啶的得率和纯度显著提高，在实际生产过程中的生产周期大幅缩短，具有操作简便、生产成本低、产品得率高、产品纯度品质优异的特点，四氢嘧啶的纯度高达95.6％，收率达72％，安全环保，适合工业推广应用。

附图说明

图1本发明实施例3的pBADectABC重组表达SDS-PAGE鉴定分析电泳图；

图2本发明实施例高效液相检测四氢嘧啶谱图(四氢嘧啶标准品)；

图3本发明实施例高效液相检测四氢嘧啶谱图(K-VnectABC全细胞催化产物)；

其中，图1中点样顺序为：1.三色预染双分子蛋白Marker；2.pBAD-DH5α；3.pBADectABC未诱导；4.pBADectABC诱导。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1-基因组提取

将新喀里多尼亚弧菌菌株CJG02-2用2216E(海博生物，青岛)培养基在 30℃培养过夜，常温8000rpm离心5分钟，收集菌体，按照takara微生物基因组提取试剂盒(TaKaRaMiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒Ver.3.0)操作，提取基因组DNA。

实施例2-四氢嘧啶合成基因簇ectABC的克隆及重组表达载体的构建

根据新喀里多尼亚弧菌菌株CGJ02-2全基因组测序结果，设计克隆ectABC 基因簇的1对引物：EctF-CTAGCTAGCATGATCACATCAG CACCTTGGGTC， EctR-EctR-CCGGAATTCTTAGTCAACGAGAGG ATAAACACC(下划线部分别为NheI和EcoRI酶切位点)。以新喀里多尼亚弧菌菌株CGJ02-2全基因组DNA 为模板，进行PCR扩增。扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸70s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR胶回收产物和表达载体pBAD用NheI和EcoR I进行双酶切，分别回收，回收产物通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌BW25113感受态细胞，获得的重组子用双酶切鉴定，阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。

实施例3-ectABC在大肠杆菌中的重组表达及SDS-PAGE鉴定

在含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下接种含有重组质粒pBADectABC 的阳性克隆(经测序验证)过夜。然后取过夜适量培养物按比例1:100加入LB培养基，在37℃下培养3小时，使其O6₆₀₀＝0.6。然后将L-阿拉伯糖添加到细菌培养物中使其终浓度为0.1％，30℃，220rpm诱导8h。

收集1毫升细菌培养液，在5000×g，4℃下离心5分钟。将细胞用50微升 1×SDS上样缓冲液(BOSTER，AR1142)重新悬浮，并在沸水中煮10分钟。然后将裂解液在12000×g下离心10分钟，取10微升上清液，用SDS-PAGE分析重组表达情况。阴性对照为重组菌株BW25113pBADectABC的未添加L-阿拉伯糖诱导的培养产物和菌株BW25113pBAD(空载体)的添加L-阿拉伯糖的培养产物。

实施例4-重组蛋白的质谱鉴定

根据SDS-PAGE结果，从凝胶上切取重组表达蛋白条带，送上海交通大学分析测试中心，通过纳升液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱联用仪进行鉴定。

实施例5-重组菌株全细胞催化生产四氢嘧啶

在含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下接种含有重组质粒pBAD Vn ectABC的阳性克隆过夜。然后取过夜适量培养物按比例1:100加入LB培养基，在37℃下培养3小时，使其O6₆₀₀＝0.6。然后将L-阿拉伯糖添加到细菌培养物中使其终浓度为0.1％进行诱导，8小时后，以6000×g，4℃离心10分钟收集细胞。

采用0.85％NaCl溶液洗涤收集的细胞两次，然后再悬浮在含有100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)、100mM天门冬氨酸钠、100mM KCl和100mM甘油的反应混合物中，形成细胞悬浮液，使细胞悬液在30℃，200rpm下进行催化反应24小时，生产四氢嘧啶。

实施例6-对重组菌株生产四氢嘧啶的检测

将全细胞催化24小时完成后，8000g离心收获上清，用80％乙醇重悬浮，并且剧烈摇晃30分钟，然后用0.45mm滤膜过滤，过滤后提取物用型号为 BRUKER compact的电喷雾四级杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF MS)分析四氢嘧啶的产生。质谱条件：扫描范围为m/z50-1300。1.8Bar的雾化器压力，500V的毛细管出口电压，4500V的毛细管电压，正离子化模式的电喷雾电离，7eV的碰撞能量，250℃的干燥气温度。

实施例7-对重组菌株发酵上清中四氢嘧啶的纯化

(1)取全细胞催化24小时完成后含有四氢嘧啶的发酵液1L(四氢嘧啶含量为5g/L)，5000rpm离心，收集上清，将上清、氯仿-正丁醇按照22:3:1的体积比例混合，剧烈震荡提取30分钟，离心，取富含四氢嘧啶的水相；

(2)将水相进行减压浓缩至原体积的20％，并将溶液pH调至5.0，经14 目聚酰胺树脂吸附，流速为1.8BV/h，采用60％乙醇洗脱，流速为0.6BV/h，收集洗脱液；

(3)将洗脱液浓缩至浓度为50％，从50℃开始降温结晶，到-4℃结晶结束，将粗晶重再次重溶于质量浓度为60％乙醇溶液中，滤去杂质，重复浓缩结晶、干燥，即得到四氢嘧啶成品，经检测和计算四氢嘧啶纯度和收率。

实施例8-对重组菌株发酵上清中四氢嘧啶的纯化

(1)取全细胞催化24小时完成后含有四氢嘧啶的发酵液1L(四氢嘧啶含量为5g/L)，5000rpm离心，收集上清，将上清、氯仿-正丁醇按照28:5:1的体积比例混合，剧烈震荡提取30分钟，离心，取富含四氢嘧啶的水相；

(2)将水相进行减压浓缩至原体积的20％，并将溶液pH调至5.0，经30 目聚酰胺树脂吸附，流速为2.2BV/h，采用60％乙醇洗脱，流速为1.5BV/h，收集洗脱液；

(3)将洗脱液浓缩至浓度为50％，从50℃开始降温结晶，到-4℃结晶结束，将粗晶重再次重溶于质量浓度为60％乙醇溶液中，滤去杂质，重复浓缩结晶、干燥，即得到四氢嘧啶成品，经检测和计算四氢嘧啶纯度和收率。

实施例9-对重组菌株发酵上清中四氢嘧啶的纯化

(1)取全细胞催化24小时完成后含有四氢嘧啶的发酵液1L(四氢嘧啶含量为5g/L)，5000rpm离心，收集上清，将上清、氯仿-正丁醇按照25:4:1的体积比例混合，剧烈震荡提取30分钟，离心，取富含四氢嘧啶的水相；

(2)将水相进行减压浓缩至原体积的20％，并将溶液pH调至5.0，经20 目聚酰胺树脂吸附，流速为2BV/h，采用60％乙醇洗脱，流速为1BV/h，收集洗脱液；

(3)将洗脱液浓缩至浓度为50％，从50℃开始降温结晶，到-4℃结晶结束，将粗晶重再次重溶于质量浓度为60％乙醇溶液中，滤去杂质，重复浓缩结晶、干燥，即得到四氢嘧啶成品，经检测和计算四氢嘧啶纯度和收率。

对比例1-根据实施例9对重组菌株发酵上清中四氢嘧啶的纯化方法，区别在于，步骤(1)中，所述上清、氯仿与正丁醇的体积比为25:1:0.5。

对比例2-根据实施例9对重组菌株发酵上清中四氢嘧啶的纯化方法，区别在于，采用甲醇替代正丁醇，上清、氯仿-甲醇按照25:4:1的体积比例混合。

对比例3-根据实施例9对重组菌株发酵上清中四氢嘧啶的纯化方法，区别在于，步骤(2)中，将水相进行减压浓缩至原体积的20％，调节pH至6.0，经20目聚酰胺树脂吸附。

对比例4-根据实施例9对重组菌株发酵上清中四氢嘧啶的纯化方法，区别在于，采用D-72树脂替代聚酰胺树脂。

由实施例7～9和对比例1～4中分别对重组菌株发酵上清中四氢嘧啶的纯化的纯度和收率结果如下表所示：

由上表可以看出，本发明对四氢嘧啶的纯化的纯度和得率提高，其纯度可达95.6％，收率可达72％，而由于对比例1中改变上清、氯仿-甲醇的比例，其四氢嘧啶纯度降低；对比例2采用甲醇替代正丁醇进行上清液提取，其得率和纯度均明显降低；对比例3改变聚酰胺树脂吸附的pH，其得率降低明显降低，对比例4中采用D-72树脂替代聚酰胺树脂进行吸附处理，其纯度下降，且收率显著降低，表明本发明通过优化了发酵液四氢嘧啶的纯化工艺，对发酵上清液采用氯仿-正丁醇进行提取联合酸性条件下的聚酰胺吸附处理，结合乙醇洗脱，可有效获得高得率、高纯度的四氢嘧啶，产品纯度品质优异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院海口实验站

<120> 一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2235

<212> DNA

<213> Vibrioneocaledonicus

<400> 1

atgatcacat cagcaccttg ggtcctttat ccagagattg gagaagactc aagtaaaaaa 60

tggatttttc gtgagcctaa aatctctgat ggtgacgaca tttacagctt gattgcagac 120

tgtcctccat tggacatgaa ctcatcttat tgcaatttcc tacagtctac gcatttcagc 180

aaaaccagta ttttggttga gcaaaaaggc gaaatcgcag gtttcatttc cggttatcag 240

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cctctcgttg actaa 2235

<210> 2

<211> 534

<212> DNA

<213> Vibrioneocaledonicus

<400> 2

atgatcacat cagcaccttg ggtcctttat ccagagattg gagaagactc aagtaaaaaa 60

tggatttttc gtgagcctaa aatctctgat ggtgacgaca tttacagctt gattgcagac 120

tgtcctccat tggacatgaa ctcatcttat tgcaatttcc tacagtctac gcatttcagc 180

aaaaccagta ttttggttga gcaaaaaggc gaaatcgcag gtttcatttc cggttatcag 240

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gttaaatcgg tagaaactac catcacggaa gataataaag cctcttgggc actgttcaaa 420

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cactttaaag gcaaacacga tacagaatat ttgtatcgca ttcctctcaa ataa 534

<210> 3

<211> 1266

<212> DNA

<213> Vibrioneocaledonicus

<400> 3

atggatattt tcaaaaagca ggaatccaac gtacgctcat attcaaacaa tttcccggtc 60

gtttttcgta aagcgaaagg ctgctggcta gaaacagaac aaggtgaacg atacttagac 120

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ggactaagca tctttgaaaa tgcagtagag actatcgctg cgaaacattt caaacaagca 1260

tcttaa 1266

<210> 4

<211> 387

<212> DNA

<213> Vibrioneocaledonicus

<400> 4

atgatcgtca gaactctaga tgaatgccgc aacagcgaac gacgtgttgt ttcagataac 60

tgggaaagtg tccgcatgtt gttgaaagac gacaacatgg gtttctcttt ccacatcaca 120

acgatttatg aagatacaga aactcatatt cactatcaaa accaccttga atcggtgttt 180

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ggtacattat acatccttga taaacacgat gagcactact tgagagctta taagaataaa 300

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aacggtgttt atcctctcgt tgactaa 387

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> primer

<400> 5

ctagctagca tgatcacatc agcaccttgg gtc 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> primer

<400> 6

ccggaattct tagtcaacga gaggataaac acc 33

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)生产四氢嘧啶：将来源于新喀里多尼亚弧菌的ectABC基因簇，通过酶切、连接导入到表达载体pBAD中，构成重组表达载体pBADVnectABC，并导入大肠杆菌BW25113，构成重组菌株K-VnectABC，该菌种的保藏号为：GDMCC No.61577；重组菌株用L-阿拉伯糖诱导VnectABC的表达，离心收集细胞，加入含有天冬氨酸钠、甘油和氯化钾的PBS缓冲液中，形成细胞悬浮液，进行全细胞催化，生产四氢嘧啶；

(2)纯化四氢嘧啶：将全细胞催化完成后的发酵液离心，收集上清，加入氯仿-正丁醇混匀，剧烈震荡，离心，取水相；将水相进行减压浓缩，并调节pH至4.5～5.5后，经聚酰胺吸附纯化，乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩结晶处理，得到高纯度的四氢嘧啶成品。

2.如权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：所述ectABC基因簇是由新喀里多尼亚弧菌中通过PCR克隆四氢嘧啶合成的基因簇ectABC，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1-4所示。

3.如权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：步骤(1)中每100mM的PBS缓冲液中含有100mM天门冬氨酸钠、100mM氯化钾和100mM甘油，pH为7.0～7.5，温度为28℃。

4.如权利要求3所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：所述细胞悬浮液在28～32℃，180～220rpm条件下进行催化反应24小时，生产四氢嘧啶。

5.如权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述上清、氯仿与正丁醇按照体积比为(22～28):(3～5):1混合，并剧烈震荡25～35分钟。

6.如权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述水相减压浓缩至原体积的20％，调节pH至5.0，经聚酰胺树脂纯化，流速为1.8～2.2BV/h，由质量浓度为60％乙醇溶液洗脱，流速为0.6～1.5BV/h，收集洗脱液。

7.如权利要求6所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：所述聚酰胺树脂的目数为14～30目。

8.如权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：所述重组表达载体pBADVnectAB在大肠杆菌中的重组表达方法，具体为：

(1)在含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下接种含有重组表达载体pBADVnectABC的阳性克隆过夜；

(2)取过夜适量培养物按比例1:100加入LB培养基，在37℃下培养3小时，使其O6₆₀₀＝0.6；

(3)将L-阿拉伯糖添加到细菌培养物中使其终浓度为0.1％，在30℃，220rpm诱导8h后，离心收集细胞。

9.如权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：步骤(1)中，在加入PBS缓冲液前，采用0.85％NaCl溶液洗涤两次。

10.如权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：所述浓缩结晶处理为：将洗脱液浓缩至浓度为50％，从50℃开始降温结晶至-4℃结晶结束，将粗晶再次重溶于质量浓度为60％乙醇溶液中，滤去杂质，重复浓缩结晶、干燥，得到高纯度的四氢嘧啶成品。

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