CN118006516A

CN118006516A - 一种可利用甲醇作为唯一碳源高产菌体蛋白的甲基营养杆菌及其应用

Info

Publication number: CN118006516A
Application number: CN202410419794.9A
Authority: CN
Inventors: 吴信; 高乐
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2024-04-09
Filing date: 2024-04-09
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2044-04-09
Also published as: CN118006516B

Abstract

本发明属于微生物领域，涉及一种可利用甲醇作为唯一碳源高产菌体蛋白的甲基营养杆菌及其应用。所述菌株保藏编号为CGMCCNo.29908，其具有生长速度快，耐受高浓度甲醇、甲醇‑蛋白转化效率高的特点；以0.5%甲醇为唯一碳源，甲基营养杆菌MB‑1菌体中蛋白含量65.3%，氨基酸含量为56.7%。在摇瓶条件下(0.5%甲醇)，甲醇转化率达0.41g DCW/g，达到理论转化效率的82%。本发明可提供高效转化高浓度甲醇的微生物菌株，在以甲醇为碳源的微生物单细胞蛋白领域具有前景。

Description

一种可利用甲醇作为唯一碳源高产菌体蛋白的甲基营养杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种高产菌体蛋白的甲基营养杆菌及其生产单细胞蛋白的方法。

背景技术

世界人口增长与自然资源短缺的不平衡日益显著。蛋白质资源紧缺是一个世界性的问题，我国的蛋白质资源尤为紧缺，饲用蛋白质资源的缺乏已成为饲料工业及畜牧养殖业发展的制约因素。必须拓宽蛋白质资源、寻找新的蛋白质生产出路。近年来,豆粕等常规蛋白质资源逐渐紧俏，价格连年飙升, 较高的价格及资源供应不足造成饲料成本偏高，影响到养殖成本，限制了养殖业的发展，所以研究者的目光逐渐转向一些非常规的蛋白质资源,微生物发酵生产蛋白质因此再次进入了人们的视野。微生物蛋白质资源是指从微生物中提取的蛋白质。具有高效生产、多样性、易于改造、高蛋白含量、丰富的氨基酸含量、适宜的配比、全面的营养、高消化吸收率和良好的口感等优点。此外，利用微生物蛋白质资源进行生产不会对自然资源造成过度消耗，与传统的动物或植物来源相比，更具有可持续性的优点。

一碳甲醇作为碳源生产饲用蛋白原料具有成本低、质量稳定可控等优点，一碳来源的单细胞蛋白被认为是食品和饲用蛋白质替代品。在1967年的第一届世界单细胞会议上，微生物菌体蛋白被统称为单细胞蛋白（Single-Cell-Protein，简称SCP），又称微生物蛋白或菌体蛋白。它是指通过大规模培养细菌、酵母菌、藻类和担子菌等微生物获得的蛋白质。单细胞蛋白富含各种营养物质，尤其是蛋白质含量很高。以干重计算，细菌一般在40%-80%之间，酵母菌为40%-60%，藻类为50%-70%。其蛋白质含量比大豆高出10%-20%，比肉、鱼和奶酪高出20%以上。此外，单细胞蛋白中的氨基酸组成也非常丰富。此外，单细胞蛋白还含有多种维生素、碳水化合物、脂类、矿物质以及丰富的酶和生物活性物质。作为饲料蛋白，单细胞蛋白已经在世界各地得到广泛应用。富含单细胞蛋白的饲料可以促使家禽和家畜生长更快，奶牛产奶量增加，家禽的产蛋率也会提高，并且可以增强机体的免疫力。

传统酵母单细胞蛋白的生产菌株大多以可食用的糖基碳源为原料，需要依赖种植，生产成本较高。同时我国面临糖基碳源严重紧缺的问题，以甘蔗为代表的糖料作物对外依存度已达每年600万吨，单细胞蛋白创制缺乏有发展前景的碳源及底盘菌株。细菌源性单细胞蛋白的生产原料广泛，生产周期短，培养成本低，是非常有前景的底盘菌株。目前，以甲醇为碳源生产单细胞蛋白，是我国最具工业化前景的单细胞蛋白生产方式。甲醇作为工业产物可由煤炭制取，而我国煤炭储量非常丰富，因此甲醇原料价格低廉且来源充足。另外，甲醇可由CO₂加氢大量制备，被认为是“液态阳光”战略的理想能量储存载体。当前我国甲醇市场规模居世界第一，产能已达8000万吨/年，呈现过剩趋势，甲醇经济的发展急需配套的甲醇转化利用技术。近年来，随着合成生物学技术的不断发展及其应用领域的不断扩大，以甲醇为碳源，利用微生物转化单细胞蛋白的技术逐渐受到关注。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是自然界中存在的一种能够利用甲醇作为唯一碳源和能量来源的微生物，前期研究非常多。然而，巴斯德毕赤酵母属于商业菌株，知识产权不清晰。亟待开发具有自主知识产权的、高效利用甲醇的野生型菌株。

发明内容

本发明提供一株从宁夏银川市西夏区志辉源石酒庄葡萄园基地树洞腐木中筛选一株可以高效利用甲醇的酵母菌株，16S鉴定为甲基营养杆菌，命名为甲基营养杆菌MB-1。该菌株创制了一种以甲醇为唯一碳源的甲基营养杆菌及其生产单细胞蛋白的方法，为单细胞蛋白新原料的开发提供了重要的工业菌株及配套发酵技术。

本发明一种可利用甲醇作为唯一碳源高产菌体蛋白的甲基营养杆菌（Methylobacterium sp.），其保藏号为：CGMCCNo.29908,其于2024年2月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，分类命名为甲基杆菌Methylobacterium sp.（也称为甲基营养杆菌）。

本发明提供一种培养所述的甲基营养杆菌的方法，其特征在于，以甲醇为唯一碳源的培养基上进行培养。

具体地，其培养条件为：28-32℃，600-1000转/分钟。优选地，其培养条件为：为30℃，800转/分钟。

本发明提供所述的甲基营养杆菌在生产菌体蛋白中的应用。

本发明提供一种产菌体蛋白的方法，其是将所述的甲基营养杆菌接种于发酵培养基中进行培养，得到菌体蛋白。

具体地，先将甲基营养杆菌接种于种子液培养基上活化培养，所述种子液培养的组分为；酵母浸粉6g/L、蛋白胨3g/L、葡萄糖20g/L、KH₂PO₄0.5g/L、(NH)₂SO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L。

具体地，所述发酵培养基为含有0.1%至6%的Delft基础盐培养基。

优选地，所述发酵培养基为含有0.25%至1%的Delft基础盐培养基。

具体实施方式中，所述发酵的条件温度为28-32℃，转速为600-1000rpm/min。

本发明提供的菌株MB-1具有生长速度快，耐受高浓度甲醇、甲醇-蛋白转化效率高的特点；以0.5%甲醇为唯一碳源，甲基营养杆菌MB-1菌体中蛋白含量65.3%，氨基酸含量为56.7%。在摇瓶条件下(0.5%甲醇)，甲醇转化率达0.41g DCW/g，达到理论转化效率的82%。本发明可提供高效转化高浓度甲醇的微生物菌株，在以甲醇为碳源的微生物单细胞蛋白领域具有前景。

附图说明

图1是菌株甲基营养杆菌MB-1在YPD培养基上的菌落形态图。

图2为甲基营养杆菌MB-1在不同甲醇浓度中的生长情况。

图3为甲基营养杆菌MB-1在不同甲醇浓度中的转化率。

图4为甲基营养杆菌MB-1不同甲醇浓度培养下的蛋白含量。

生物材料保藏信息：本发明使用的甲基营养型甲基营养杆菌MB-1，其于2024年2月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为：CGMCC No.29908，分类命名为甲基杆菌Methylobacterium sp.（也称为甲基营养杆菌）。

具体实施方式

实施例1：甲基营养型甲基营养杆菌筛选

（1）基础筛选培养基：称取0.5g酵母浸粉，加热溶解于100mL纯化水中，分装至含导管的试管中，115℃灭菌30min；

（2）甲醇溶液：用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌备用；

纯化：使用无菌接种环，将筛选纯化的菌株在葡萄糖蛋白胨酵母粉琼脂培养基(YPD培养基)上划线纯化。培养温度30℃，培养时间48h，得如图1所示的菌落形态，菌落颜色为乳白色，单菌落直径2mm。

实施例2：甲基营养型甲基营养杆菌分子鉴定

在YPD固体培养基上30℃培养2天，观察菌落形态，如图1所示，菌落呈圆形乳白色、边缘整齐，表面光滑湿润，有粘性易被挑起。

分子生物学鉴定方法（16S序列扩增）：按照细菌基因组DNA提取试剂盒(美国BIOMIGA公司)提取细菌DNA。吸取1mL菌液10000rpm离心5min，去上清，收集菌泥，加入CTAB溶液及苯酚-氯仿—异戊醇（25：24：1）萃取核酸DNA，12000rpm离心5min取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)，混匀后12000rpm离心5min取上清，乙醇溶液漂洗两次，12000rpm离心5min去上清，沉淀吹干，加入50μL无菌水重悬，即得菌株DNA模板。

采用16S序列的通用引物27F和1492R，进行PCR扩增。

反应体系(50μL)：

表1 PCR反应体系（EasyTaq聚合酶）

反应程序：

表2 PCR反应条件（EasyTaq聚合酶）

测序由金唯智公司完成，测序获得16S片段的基因序列（如SEQ ID NO：1所示），通过NCBI的BLAST比对，进行菌种鉴定，确定菌株种属信息。本实施例中一共获得3株甲基营养型甲基营养杆菌，以0.5%甲醇与Delft培养基，相同条件下培养测定其OD₆₀₀，最终筛选获得一株生长最好的甲基营养型甲基营养杆菌。将该菌株命名为MB-1，其保藏号：CGMCCNo.29908。

实施例3：甲基营养杆菌MB-1生长曲线测定

利用自动微生物生长曲线分析仪评估甲基营养杆菌MB-1的细胞生长。具体为：将单菌株的隔夜培养物接种到一个48孔板中，接种至甲醇浓度分别为0.1%、0.25%、0.5%、1%、3%、6%的Delft基础盐培养基，每孔的初始OD600为0.25，温度为30℃，转速为800rpm/min。细胞生长每小时测量一次，以绘制生长曲线并计算最终生物质量。每种处理方式设置三个重复。

从结果可以看出，该甲基营养杆菌MB-1以甲醇为唯一碳源时可以正常生长，并随着甲醇浓度的增加菌体量逐渐增加。尤其是，以3%甲醇为唯一碳源时，甲基营养杆菌MB-1菌体积累量达到最大，OD600可以达到6.71。当甲醇浓度提高至6%时，甲基营养杆菌MB-1菌体积累量略受影响，OD600降至5.81。在高浓度甲醇3%-6%环境下，该菌株具有优越的甲醇耐受度和环境鲁棒性。

实施例4：甲基营养杆菌MB-1菌体含量分析

（1）粗蛋白测定：

①收集菌体；

②用ddH2O洗涤菌体3次除去固体盐；

③处理好的菌体在专用催化剂存在的情况下，通过热催化高温氧化反应进行消解反应：通过这种途径，即便是非常稳定、复杂的含氮的化合物都可以在一定数量上被消解；样品直接进入填充的反应管中高温区，在这个区域中样品在载气流中发生高温催化和氧化反应生成NO；经高温分解的气体在一个旋管冷凝器中冷却，然后冷却水在接下来的TIC冷凝管中与测定气体分离，在进一步的干燥并除去腐蚀性气体之后，NO测定用气体通过CLD检测器；氮氧化物的浓度每秒被测定几次，可以得到信号随时间变化的峰图；

④峰面积与测定溶液中氮的浓度成比例；

⑤通过使用先前确定的标准曲线可以计算样品中含氮的含量；

⑥在测定出总氮量后，菌体中粗蛋白质含量的计算公式如下: 蛋白质(g/100g)=总氮量(g/100g)×6.25。

通过250ml摇瓶及5L发酵罐发酵诱导测总氮结果如表3所示。结果表明：

（2）氨基酸含量测定：

氨基酸含量测定采用A200型amino Nova氨基酸分析仪参照中华人民共和国国家标准GB/T 18246-2019《饲料中氨基酸的测定》进行测定。

利用不同甲醇培养甲基营养杆菌MB-1，收集菌体测定粗蛋白和氨基酸含量，可以从图4结果看出，在甲醇浓度为0.5%条件下，菌体蛋白含量最高，可以达到65.3%，氨基酸含量为56.7%，远远高于甲基酵母（50-53%菌体蛋白含量）。以0.5%甲醇为唯一碳源时，甲基营养杆菌MB-1的甲醇-蛋白转化效率达到0.41gDCW/g甲醇，达到理论转化效率的82%。相同条件下，巴斯德毕赤酵母X-33甲醇-蛋白转化效率仅为0.26gDCW/g甲醇。这个结果说明甲基营养杆菌MB-1比巴斯德毕赤酵母更节约能量，甲醇-蛋白转化效率更高。

随着甲醇浓度的增加，虽然甲基营养杆菌MB-1菌体积累量增多，但是菌体中粗蛋白含量反而下降，说明随着甲醇浓度的增加，甲醇代谢分支途径通量明显增加，导致甲醇-蛋白的合成通量下降，不利于菌体中粗蛋白的积累。所以，类似结果如图3，甲醇浓度增加后，甲醇-蛋白的转化效率明显降低。

Claims

1.一种可利用甲醇作为唯一碳源高产菌体蛋白的甲基营养杆菌（Methylobacterium sp.），其特征在于，其保藏号为：CGMCC No.29908。

2.一种培养如权利要求1所述的甲基营养杆菌的方法，其特征在于，以甲醇为唯一碳源的培养基上进行培养。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其培养条件为：28-32℃，600-1000转/分钟。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其培养条件为：为30℃，800转/分钟。

5.如权利要求1所述的甲基营养杆菌在生产菌体蛋白中的应用。

6.一种产菌体蛋白的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的甲基营养杆菌接种于发酵培养基中进行培养，得到菌体蛋白。

7.根据权利要求6所述的产菌体蛋白的方法，其特征在于，先将甲基营养杆菌接种于种子液培养基上活化培养，所述种子液培养的组分为；酵母浸粉6g/L、蛋白胨3g/L、葡萄糖20g/L、KH₂PO₄0.5g/L、(NH)₂SO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L。

8.根据权利要求6所述的产菌体蛋白的方法，其特征在于，所述发酵培养基为含有0.1%至6%的Delft基础盐培养基。

9.根据权利要求6所述的产菌体蛋白的方法，其特征在于，所述发酵培养基为含有0.25%至1%的Delft基础盐培养基。

10.根据权利要求6所述的产菌体蛋白的方法，其特征在于，所述发酵的条件温度为28-32℃，转速为600-1000rpm/min。