CN115216414A

CN115216414A - 一种高甲醇转化率且高蛋白的毕赤酵母菌株及其制备方法

Info

Publication number: CN115216414A
Application number: CN202211146356.7A
Authority: CN
Inventors: 吴信; 孟娇; 高乐
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2022-09-20
Filing date: 2022-09-20
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2042-09-20
Also published as: CN115216414B

Abstract

本发明属于微生物领域和生物技术领域，公开了一种高甲醇转化率且高蛋白的毕赤酵母菌株及其制备方法。所述菌株是具有鲁棒性、高甲醇转化率且高蛋白的巴斯德毕赤酵母菌株(P.pastoris)HTX‑330，保藏编号为CGMCC NO.25207，其能够在33℃条件下，以甲醇为唯一碳源实现高生物量生长以及高蛋白表达，具有绿色、环保、无污染、表达率高以及成本低等优势。

Description

一种高甲醇转化率且高蛋白的毕赤酵母菌株及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物领域和生物技术领域，具体涉及一种高甲醇转化率且高蛋白毕赤酵母菌株的制备方法。

背景技术

随着我国蛋白饲料原料进口量的不断提高，蛋白饲料原料创新保障畜牧养殖业健康发展成为养殖业重要挑战，寻找和开发新的蛋白质资源成为饲料工业急需解决的问题。

根据蛋白质饲料来源不同可分为植物性蛋白饲料、动物性蛋白饲料、微生物蛋白（SCP、单细胞蛋白）饲料和非蛋白饲料。植物性蛋白饲料原料以豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕、苜蓿、玉米加工的副产品玉米蛋白粉等草本饲料为主，动物性蛋白饲料原料有鱼粉、肉骨粉、羽毛粉等，微生物蛋白饲料是由单细胞生物个体组成的蛋白质含量较高的饲料，如酵母菌饲料和单细胞藻类饲料，非蛋白氮饲料一般指饲料用尿素等。伴随着饲料行业的迅速发展，饲料也逐渐向低药、低残留的趋势发展，微生物发酵蛋白饲料的发展呈现一片生机，微生物发酵蛋白饲料能够使饲料中的大分子物质和营养物质分解转化为易消化、吸收和利用的小分子物质、小肽等，可溶性蛋白的增加，增加了蛋白的消化利用率，有效降解抗营养因子，提高了蛋白饲料的营养水平和利用效率，也间接增加了优质蛋白供给，缓解了蛋白饲料原料的供应不足，提高动物的生产性能。

甲醇是一种平台化工品，可由劣质煤炭制取，我国煤炭储量丰富，因此甲醇原料价格低廉且来源充足。另外，甲醇可由CO₂加氢大量制备，因此其被认为是“液态阳光”战略的理想能量储存载体。我国甲醇市场规模居世界第一，产能已达8000万吨/年，呈现过剩趋势，甲醇经济的发展急需配套的甲醇转化利用技术。近年来，随着合成生物学技术的不断发展及其应用领域的不断扩大，以甲醇为碳源，利用微生物转化单细胞蛋白的技术逐渐受到关注。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是自然界中存在的一种能够利用甲醇作为唯一碳源和能量来源的微生物，是甲醇生物转化单细胞蛋白的理想宿主。然而，毕赤酵母天然甲醇代谢途径复杂，甲醇转化利用率低，并且毕赤酵母菌株在工业发酵过程中鲁棒性通常较差，例如不耐高温，需要进行物理降温，最终提高发酵成本。因此，显著提高甲醇转化效率及发酵过程中的鲁棒性将成为利用毕赤酵母进行甲醇生物转化单细胞蛋白研究的关键所在。

发明内容

本发明的目的在于构建一株高甲醇转化效率并且高蛋白的毕赤酵母菌株。

为了克服现有技术不足，本发明提供了一株具有鲁棒性、高甲醇转化率且高蛋白的巴斯德毕赤酵母菌株(P. pastoris) HTX-330。HTX-330菌株的出发菌株来源于实验室保藏菌株P. pastoris X-33。HTX-330能够在33℃条件下，以甲醇为唯一碳源实现高生物量生长以及高蛋白表达，具有绿色、环保、无污染、表达率高以及成本低等优势。

本发明提供一种高甲醇转化率且高蛋白的毕赤酵母菌株HTX-33，其保藏编号为CGMCC NO.25207。其是由野生型P. pastoris X-33驯化迭代培养筛选得到。

同时提供，所述的毕赤酵母菌株在微生物蛋白或饲料生产中的应用。优选地，其中用甲醇作为唯一碳源和能量来源发酵所述毕赤酵母菌株。

为了获得更好的效果，本发明进一步对驯化菌株HTX-33进行分子改造，通过削弱细胞壁合成进一下提高毕赤酵母的总氮和粗蛋白含量，最终获得耐33℃、高甲醇转化率且高蛋白毕赤酵母菌株，命名为HTX-330。因此，本发明提供一种高甲醇转化率且高蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，其是将所述的毕赤酵母菌株中敲除编码细胞壁稳定性所需的O-糖基化蛋白基因PAS_chr4_0305得到。

优选地，其是通过CRISPR-Cas9基因编辑系统来实现对O-糖基化蛋白基因PAS_chr4_0305的无痕敲除。

本发明提供所述的毕赤酵母菌株在微生物蛋白或饲料生产中的应用。

优选地，其中用甲醇作为唯一碳源和能量来源的培养基好氧发酵所述毕赤酵母菌株。

进一步优选地，所述培养基中甲醇添加量体积比 (v/v)为0.5%。所用甲醇均过滤后使用。

更具体地，所述培养基以Delft基本盐培养基从作为基础培养基，其组分：7.5 g/L硫酸铵、14.4 g/L磷酸二氢钾、0.5 g/L七水硫酸镁，培养基初始pH值为6.5，使用之前在121℃ 下灭菌20 min。

在具体实施方式中，发酵的培养条件为33℃、220 rpm。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

1.本发明提供的HTX-330菌株具有鲁棒性，能够实现在33℃条件下将甲醇转化为单细胞蛋白。该菌株培养方法简单，后期生长迅速，适应性强，耐受性高。可解决目前工业发酵过程中菌株不耐高温，降低发酵成本，具有良好的工业应用化前景。

2.在摇瓶培养条件下，本发明提供的菌株HTX-330在33℃、Delft+0.5%(v/v)甲醇下的生长明显优于野生型菌株X-33，其最大OD较菌株X-33提高43%。

3. 在摇瓶培养条件下，本发明提供的菌株HTX-330在33℃、Delft+0.5%(v/v)甲醇下的总氮和粗蛋白含量明显优于野生型菌株X-33，其总氮和粗蛋白含量较菌株X-33均提高22%。

附图说明

图1为驯化菌株HTX-33与野生型菌株X-33在33℃、Delft+0.5%(v/v)甲醇条件下的生长曲线图。

图2为驯化菌株HTX-33与野生型菌株X-33在33℃、Delft+0.5%(v/v)甲醇条件下的最大OD₆₀₀值。

图3为驯化菌株HTX-33与野生型菌株X-33的菌落形态图。

图4为PAS_chr4_0305基因突变菌株菌落PCR验证电泳图。注：M，5000 K DNALadder；1 泳道，野生型菌株X-33 PCR扩增产物；2~4 泳道，成功敲除PAS_chr4_0305的菌株PCR扩增产物。

图5为驯化菌株HTX-33和改造菌株HTX-330在33℃、Delft+0.5%(v/v)甲醇条件下的生长情况。

生物材料保藏信息：

本发明的毕赤酵母菌株（Pichia pastoris）HTX -33已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期为2022年6月29日，保藏号为CGMCCNo. 25207；该菌株的分类命名：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。

具体实施方式

实施例1：菌株X-33的迭代进化

本实施例中采用的Delft培养基是以Delft基本盐培养基从作为基础培养基，其组分：7.5 g/L硫酸铵、14.4 g/L磷酸二氢钾、0.5 g/L七水硫酸镁，培养基初始pH值为6.5，使用之前在121℃ 下灭菌20 min。

挑取单克隆野生型菌株X-33接种于装有100 ml Delft+2%(w/v)甘油培养基的250mL摇瓶中，在30℃、220 rpm条件下振荡培养24 h，制备种子液。通过低温低速离心 (4℃，5000 rpm，5 min)的方式收集菌体，用Delft培养基重悬菌体，以初始OD₆₀₀=0.01接种于装有100 ml Delft+0.5%(v/v)甲醇培养基的250 mL摇瓶中，于33℃、220 rpm条件下继续培养。每次于对数期进行1:100转接至新鲜的Delft+0.5%(v/v)甲醇培养基，每次转接3个平行。重复上述过程约350代 (约100天)，驯化出稳定、高效的具有鲁棒性、高甲醇转化率的菌群。取每个摇瓶的混合样品，利用平板稀释涂布法，将混合菌群悬液均匀涂布在固体YPD培养基平板上以进行菌种分离，并于33℃条件下静置培养120 h后，分别从3个固体培养基表面挑取3个单菌落（共计9株菌株）进行后续的生长验证。

实施例2：耐33℃、高甲醇转化率菌株的筛选

使用全自动微生物生长曲线分析仪对挑取的9个单菌落进行生长评价。将菌株用新鲜的Delft+0.5%(v/v)甲醇培养基稀释至初始OD₆₀₀=0.25，随后接入48孔板，每个样品做8个平行，每孔添加 1 ml。用Delft培养基为空白对照，于33℃、800 rpm条件下测定菌株的生长曲线（见图1）。通过菌株生长的最大OD值从这9株菌株中选择出能耐33℃、高甲醇转化率的菌株X-33-3，最终命名为HTX-33（见图2）。HTX-33菌落形态呈白色、不规则圆形、菌落边缘隆起、呈波状（见图3）。驯化菌株HTX-33在33℃、0.5% (v/v) 甲醇下的生长明显优于野生型X-33，最大OD提高50%。对该驯化菌株HTX-33进行了生物材料保藏，编号为CGMCC NO.25207。

实施例3：驯化菌株HTX-33总氮和粗蛋白的测定

在本实施例中，使用总氮测定仪实现对驯化菌株HTX-33和野生型菌株X-33总氮和粗蛋白的测定。挑取单克隆菌株接种于装有100 ml Delft+2%(w/v)甘油培养基的250 mL摇瓶中，在30℃、220 rpm条件下振荡培养24 h，制备种子液。通过低温低速离心 (4℃，5000rpm，5 min)的方式收集菌体，用Delft培养基重悬菌体，以初始OD₆₀₀=0.01接种于装有100ml Delft+0.5%(v/v)甲醇培养基的250 mL摇瓶中，于33℃、220 rpm条件下继续培养至对数中期后，收集菌体，去除培养基，再用ddH₂O洗涤菌体3次除去固体盐。处理好的菌体在专用催化剂存在的情况下，通过热催化高温氧化反应进行消解反应。通过这种途径，即便是非常稳定、复杂的含氮的化合物都可以在一定数量上被消解。样品直接进入填充的反应管中高温区，在这个区域中样品在载气流中发生高温催化和氧化反应生成NO。经高温分解的气体在一个旋管冷凝器中冷却，然后冷却水在接下来的TIC冷凝管中与测定气体分离，在进一步的干燥并除去腐蚀性气体之后，NO测定用气体通过CLD检测器。氮氧化物的浓度每秒被测定几次，可以得到信号随时间变化的峰图。峰面积与测定溶液中氮的浓度成比例。通过使用先前确定的标准曲线可以计算样品中含氮的含量。在测定出总氮量后,菌体中粗蛋白质含量的计算公式如下: 蛋白质(g/100g)=总氮量(g/100g)×6.25。从检测结果来看，驯化菌体HTX-33的总氮和粗蛋白含量与野生型X-33无显著性差异，均占细胞干重的36%左右。

表1 驯化菌株HTX-33与野生型菌株X-33在33℃、Delft+0.5%(v/v)甲醇条件下的总氮和粗蛋白含量

实施例4：构建细胞壁稳定性所需的O-糖基化蛋白缺失的菌株

在本实施例中，选用CRISPR-Cas9基因编辑系统来实现对驯化菌株HTX-33编码细胞壁稳定性所需的O-糖基化蛋白基因PAS_chr4_0305的无痕敲除。

CRISPR-Cas9系统通过小向导RNA (Small guide RNA，sgRNA) 的靶向序列定位至含有前间隔序列邻近基序 (Protospacer adjacent motif，PAM) 序列的特定位点，引导Cas9蛋白切割 DNA 形成双链断裂缺口，再依靠同源重组 (HR) 或者非同源末端连接(NHEJ) 修复的方式进行连接，从而引发基因编辑。本实施例选用pPICZ-Cas9-gGUT1质粒（双向启动子PHTX1控制Cas9蛋白和靶向GUT1基因的20 bp的sgRNA）进行质粒修改达到目的基因的编辑(其方法参见：Cai P , Duan X , Wu X , et al. Recombination machineryengineering facilitates metabolic engineering of the industrial yeastPichiapastoris[J]. Nucleic Acids Research, 2021(13):13)。

首先，设计靶向PAS_chr4_0305的sgRNA，构建敲除质粒pPICZ-Cas9-gPAS_chr4_0305。其中靶向PAS_chr4_0305的sgRNA序列由在线网站（CRISPR RGEN Tools, http://www.rgenome.net/）提供。本实施例选择基因PAS_chr4_0305序列的第121-140位的20 bp碱基作为该基因的sgRNA序列。以质粒pPICZ-Cas9-gGUT1为模板，经过Gibson组装将质粒pPICZ-Cas9-gGUT1中靶向GUT1的20 bp 序列修改为选定的靶向PAS_chr4_0305的sgRNA序列，经过大肠杆菌转化、质粒提取和基因测序，最终获得敲除质粒pPICZ-Cas9-gPAS_chr4_0305。（2）设计及构建供体DNA：PAS_chr4_0305-Donor。以P. pastoris HTX-33基因组为模板，分别扩增出基因PAS_chr4_0305的上游500 bp和下游500 bp。再通过融合PCR方法将上下游片段融合成1000 bp的长片段，得到PAS_chr4_0305-Donor。（3）同时共转化pPICZ-Cas9-gPAS_chr4_0305和PAS_chr4_0305-Donor到HTX-33菌株中，涂布YPDZ（YPD+博来霉素）平板。最后，挑取平板上的克隆进行菌落 PCR（见图4）以及基因测序验证，后挑取正确的转化子在YPD 培养基中进行传代，丢掉质粒后保菌，至此完成PAS_chr4_0305基因的敲除，菌株命名为HTX-330。

实施例5：改造菌株HTX-330生长的测定

使用全自动微生物生长曲线分析仪对改造菌株HTX-330进行生长评价。测定的方法与实施例2相同。从结果可以看出，敲除编码细胞壁稳定性所需的O-糖基化蛋白基因PAS_chr4_0305后，菌株HTX-330在33℃、Delft+0.5%(v/v)甲醇条件下的最大生物量较HTX-33略有降低，但是菌株HTX-330的生长明显优于野生型菌株X-33，其最大OD较X-33提高43%（见图5）。

实施例6：改造菌株HTX-330总氮和粗蛋白的测定

使用总氮测定仪实现对改造菌株HTX-330总氮和粗蛋白的测定。测定的方法和原理与实施例3相同，其结果如表2所示。

表2 改造菌株P. pastoris HTX-330在33℃、Delft+0.5%(v/v)甲醇条件下的总氮和粗蛋白含量

菌株	总氮含量（g/g DCW）	粗蛋白含量（g/g DCW）
			HTX-330	0.075±0.002	0.444±0.012

从结果可以看出，在驯化菌株HTX-33的基础上敲除合成细胞壁稳定性所需的 O-糖基化蛋白基因（PAS_chr4_0305）导致蛋白质含量提高22%。

Claims

1.一种高甲醇转化率且高蛋白的毕赤酵母菌株（Pichia pastoris），其特征在于，所述毕赤酵母菌株的保藏编号为CGMCC NO.25207。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母菌株在微生物蛋白或饲料生产中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，采用甲醇作为唯一碳源和能量来源发酵所述毕赤酵母菌株。

4.一种高甲醇转化率且高蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，其是将如权利要求1所述的毕赤酵母菌株中敲除编码细胞壁稳定性所需的O-糖基化蛋白基因PAS_chr4_0305得到。

5.如权利要求4所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，其是通过CRISPR-Cas9基因编辑系统来实现对O-糖基化蛋白基因PAS_chr4_0305的无痕敲除。

6.如权利要求4或5所述的毕赤酵母菌株在微生物蛋白或饲料生产中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，采用甲醇作为唯一碳源和能量来源的培养基好氧发酵所述毕赤酵母菌株。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述培养基中甲醇添加量体积比 (v/v)为0.5%。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述培养基以Delft基本盐培养基从作为基础培养基，其组分：7.5 g/L硫酸铵、14.4 g/L磷酸二氢钾、0.5 g/L七水硫酸镁，培养基初始pH值为6.5，使用之前在121℃ 下灭菌20 min。

10.如权利要求7至9任一项所述的应用，其特征在于，发酵的培养条件为33℃、220rpm。