CN109415720A

CN109415720A - C4二羧酸的制造方法

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Publication number: CN109415720A
Application number: CN201780040866.7A
Authority: CN
Inventors: 野中镜士朗; 高桥史员
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2016-06-29
Filing date: 2017-06-22
Publication date: 2019-03-01
Anticipated expiration: 2037-06-22
Also published as: JP6944748B2; US10590442B2; US20190316159A1; CN109415720B; WO2018003641A1; JPWO2018003641A1

Abstract

本发明涉及宿主细胞中的C4二羧酸生产能力的提高。本发明提供一种多肽，其由序列号2表示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成。

Description

C4二羧酸的制造方法

技术领域

本发明涉及一种生物学的C4二羧酸制造。

背景技术

C4二羧酸作为酸味料或抗菌剂、pH调节剂在食品工业中被利用于各种各样的用途，此外，也用作合成树脂或生物分解性聚合物的原料等，为工业的价值高的物质。C4二羧酸在工业上通过源自石化原料的化学合成、或微生物发酵的任意种而制造。从前，为了成本更低，化学合成法为主流，但近年来，从原料的昂贵、或环境负荷等观点出发，利用以循环再生资源为原料的微生物发酵的制造方法备受关注。

已知有作为C4二羧酸之一的富马酸可以使用根霉属菌(Rhizopus)等发酵菌而制造。根霉属菌将葡萄糖作为碳源生产富马酸，排出至菌体外。迄今为止，关于用于根霉属菌的富马酸高生产化的方法，已知有培养法的改良或变异育种的高生产率菌株的制作等。但是，由于根霉属菌的遗传学的背景还没有充分地进行研究，因此，利用基因重组的根霉属菌的富马酸高生产化技术的开发不容易，报道也少。仅报道有将编码源自酿酒酵母的丙酮酸羧化酶的基因导入至戴尔根霉(专利文献1)、及将编码源自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因导入至米根霉(非专利文献1)引起的富马酸生产率提高。

(专利文献1)中国专利申请公开第103013843号说明书

(非专利文献1)Metabolic Engineering，2012，14：512-520

发明内容

本发明提供一种多肽，其由序列号2表示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成。

另外，本发明提供一种多核苷酸，其编码上述多肽。

另外，本发明提供一种载体或DNA片段，其含有上述多核苷酸。

另外，本发明提供一种转化细胞，其含有上述多核苷酸或载体或DNA片段。

进而，本发明提供一种C4二羧酸的制造方法，其包含将上述转化细胞进行培养。

进而，本发明提供一种转化细胞的制造方法，其包含将上述多核苷酸或载体导入至宿主细胞。

进而，本发明提供一种宿主细胞中的C4二羧酸生产能力的提高方法，其包含将上述多核苷酸或上述载体或DNA片段导入至宿主细胞，或者强化上述多核苷酸的表达。

具体实施方式

本发明涉及一种具有提高宿主细胞的C4二羧酸生产能力效果的多肽、编码该多肽的基因、含有该基因的转化细胞，以及使用该转化细胞的C4二羧酸的制造方法。

本发明人进行了深入研究的结果发现：使由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽的表达强化的细胞能够提高C4二羧酸生产能力。

本发明的多肽具有提高细胞的C4二羧酸生产能力的功能。本发明的多肽的表达被强化的细胞(例如导入有编码该多肽的基因的细胞)可以更快地生产C4二羧酸。因此，本发明的多肽及强化了其表达的细胞可用于C4二羧酸的生物学的生产。本发明的上述及其它特征及优点由以下的本说明书的记载进一步明确。

(1.定义)

本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列的同一性利用Lipman-Pearson法(Science，1985，227:1435-1441)进行计算。具体而言，使用遗传信息处理软件GENETYCSVer.12的同源性分析程序的氨基酸序列×氨基酸序列最大匹配或核苷酸序列×核苷酸序列最大匹配，通过将Maches作为-1、将Mismatches作为1、将Gaps作为1、*N+2进行分析而算出。

本说明书中，氨基酸或核苷酸序列的同一性是指，当比对(alignment)两个氨基酸序列或核苷酸序列以使一致性最大化时，两个序列中存在相同的氨基酸或核苷酸的位置的数目相对于全长氨基酸数或核苷酸数的比例(％)。该同一性区别于同源性，同源性是包括相似氨基酸或核苷酸的组都被视为相似的相似性和同一性的两者而计算的同源性。

本说明书中，与氨基酸序列或核苷酸序列有关的“至少90％的同一性”是指90％以上、优选95％以上、更优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步更优选98％以上、进而优选99％以上的同一性。

本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列上的“相当的区域”可以通过以给予最大的相同性的方式使目标序列和参照序列(例如序列号2表示的氨基酸序列)进行比对(alignment)而确定。氨基酸序列或核苷酸序列的比对可以使用公知的算法而实行，其步骤是本领域技术人员所公知的。例如，就比对而言，可以基于上述的Lipman-Pearson法等通过手操作而进行，也可以通过在默认设置中使用Clustal W多重比对程序(Thompson，J.D.etal，1994，Nucleic Acids Res.22:4673-4680)而进行。Clustal W例如可以在欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute：EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])、或国立遗传学研究所运营的日本DNA数据库(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])的网站上利用。通过上述的比对而对应于参照序列的任意的区域所匹配的目标序列的区域在该任意的区域中被看作“相当的区域”。

本说明书中的“1个或多个氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列”是指1个以上且10个以下、优选1个以上且8个以下、更优选1个以上且5个以下、进一步优选1个以上且3个以下的氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。另外，本说明书中的“1个或多个核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列”是指：1个以上且30个以下、优选1个以上且24个以下、更优选1个以上且15个以下、进一步更优选1个以上且9个以下的核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。本说明书中，氨基酸或核苷酸的“附加”中包括对序列的一个末端及两个末端的氨基酸或核苷酸的附加。

本说明书中，与基因有关的“上游”及“下游”是指该基因的转录方向的上游及下游。例如，“配置于启动子的下游的基因”是指在DNA正义链中在启动子的3'侧存在基因，基因的上游是指DNA正义链中的该基因的5'侧的区域。

本说明书中，控制区域与基因的“可操作地连结”是指基因与控制区域以该基因在该控制区域的控制下可表达的方式进行连接。基因与控制区域的“可操作地连结”的步骤为本领域技术人员所公知的。

本说明书中，对于细胞的功能或性状、表型所使用的用语“本来”是为了表示该功能或性状、表型存在于该细胞的野生型而使用的。对照而言，用语“外来”是为了表示原来并不存在于该细胞中，是从外部导入的功能或性状、表型而使用的。例如，“外来”基因或多核苷酸为从外部导入至细胞的基因或多核苷酸。外来基因或多核苷酸可以源自与导入其的细胞同种的生物，也可以源自异种的生物(即，异种基因或多核苷酸)。

本说明书中，细胞的“C4二羧酸生产能力”是作为该细胞的培养基中的C4二羧酸的生产速度来表示。更详细而言，用该细胞培养开始后经过一定时间由该细胞生产的C4二羧酸的每单位体积培养基的质量除以培养时间得到的值(g/L/h)表示。细胞的C4二羧酸的生产量可以作为从该细胞的培养物中除去了细胞的培养上清液中的C4二羧酸的量算出。培养上清液中的C4二羧酸的量可以利用高效液相色谱法(HPLC)等进行测定。更具体的测定步骤例示于后述的参考例1。

本说明书中，转化细胞中的“C4二羧酸生产能力的提高”是指该转化细胞的C4二羧酸生产能力与宿主细胞或对照细胞相比有所提高。转化细胞中的C4二羧酸生产能力的提高率用以下的式子进行计算。

提高率(％)＝(转化细胞的C4二羧酸生产能力/宿主细胞或对照细胞的C4二羧酸生产能力)×100-100

在此，转化细胞是指强化了本发明的多肽的表达的细胞，例如，相对于宿主细胞以编码本发明的多肽的多核苷酸能够表达的方式被导入的细胞或者该多核苷酸的表达被强化了(即，转录量提高)的细胞。在此，宿主细胞是指上述转化细胞的宿主细胞(亲细胞)。另外，对照细胞是指导入了不含有编码本发明的多肽的多核苷酸的载体的细胞。对照细胞用作与已导入含有多核苷酸的载体的转化细胞的比较。优选该C4二羧酸生产能力的提高率基于由该转化细胞进行的C4二羧酸的生产速度成为最大的时刻的各细胞的C4二羧酸生产能力而进行计算。因此，本说明书中，“C4二羧酸生产能力提高X％以上的转化细胞”是指用上述式计算的C4二羧酸生产能力的提高率为X％以上的转化细胞，另外，细胞中的“C4二羧酸生产能力的X％以上的提高”是指用上述式计算的该细胞的C4二羧酸生产能力的提高率为X％以上。

作为通过本发明而制造的C4二羧酸的例子，可举出富马酸、苹果酸、及琥珀酸，优选为富马酸和苹果酸，更优选为富马酸。

本说明书中，“碳酸酐酶”是指具有促进水溶液中由二氧化碳分子(CO₂)和水分子(H₂O)生成碳酸离子(HCO₃ ^-)的反应和其逆反应中的任一者或两者的催化剂活性的酶(EC4.2.1.1)。另外，“碳酸酐酶活性”是指碳酸酐酶表现出的催化活性，例如，可以通过公知的方法(C.S.Gai et al.，AMB Express 2014，4，2-13。)等确定。

(2.细胞的C4二羧酸生产能力的提高)

(2.1.新型多肽)

在一个实施方式中，本发明提供一种多肽，其由序列号2表示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成。

利用多肽数据库(例如ncbi的Non-Redundant protein sequences(nr))的检索的结果发现，作为与由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽具有最高同一性的公知的蛋白质，源自Lichtheimia ramosa(横梗霉)株的功能未知的蛋白质(登录号：LRAMOSA 05249)，其序列同一性为62.77％。另外，由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽具有对应于序列号23表示的氨基酸序列构成的源自戴尔根霉(Rhizopus delemar)RA 99-880株的功能未知蛋白质(登录号：RO3G_10751)的第152位至第375位的区域。即，由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽是由序列号23表示的氨基酸序列构成的多肽的N末端侧的氨基酸(第2位至第151位的氨基酸序列)被删除后得到的多肽。发现该多肽与该功能未知的蛋白质具有60.00％的序列同一性，并且与该功能未知的蛋白质不同。由以上可知，证实该多肽是迄今未知的新型多肽，并且如后述实施例中所示，证实它具有碳酸酐酶活性。再如后述实施例所示，在由序列号23所示的氨基酸序列构成的功能未知蛋白质的表达被强化后的菌株中，未观察到富马酸生产能力的提高，仅在由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽的表达被强化了的菌株中，观察到富马酸生产能力的提高。

因此，在优选的实施方式中，本发明的多肽为由序列号2表示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成的具有碳酸酐酶活性的多肽。

作为与序列号2表示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列的例子，可举出相对于序列号2表示的氨基酸序列，1个或多个氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。

作为相对于氨基酸序列，导入氨基酸的缺失、取代、附加、或插入等变异的方法，可举出例如相对于编码该氨基酸序列的核苷酸序列，导入核苷酸的缺失、取代、附加、或插入等变异的方法。作为向核苷酸序列的变异导入的方法，可举出例如：甲磺酸乙酯、N-甲基-N-亚硝基胍、亚硝酸等化学诱变剂或紫外线、X射线、γ射线、离子束等物理诱变剂导致的突变诱发、部位特异性变异导入法、Dieffenbach等(Cold Spring Harbar Laboratory Press，New York，581-621，1995)中记载的方法等。作为部位特异性变异导入的方法，可举出利用了Splicing overlap extension(SOE)PCR(Horton et al.，Gene 77，61-68，1989)的方法、ODA法(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene，152，271-276，1995)、Kunkel法(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82，488)等。或者，也可以利用Site-DirectedMutagenesis System Mutan-Super Express Km试剂盒(Takara Bio公司)、Transformer^TMSite-Directed Mutagenesis试剂盒(Clonetech公司)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺公司)等市售的部位特异性变异导入用试剂盒。

(2.2.基因、载体及转化细胞)

在其它的一个实施方式中，本发明提供一种多核苷酸，其编码上述本发明的多肽。在优选的实施方式中，作为本发明的多核苷酸，可举出由序列号1表示的核苷酸序列构成的多核苷酸、由与序列号1表示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。在优选的实施方式中，上述本发明的多核苷酸编码由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽、或由与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成的具有碳酸酐酶活性的多肽。

作为与序列号1表示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列的例子，可列举相对于序列号1表示的核苷酸序列，1个或多个核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。在核苷酸序列中导入核苷酸的缺失、取代、附加、或插入等变异的方法如上所述。本发明的多核苷酸可以为1条链或2条链的形态，或者也可以为DNA，还可以为RNA。该DNA可以为cDNA、化学合成DNA等人工DNA。

上述本发明的多核苷酸可以被重组至载体。优选含有本发明的多核苷酸的载体为表达载体。另外，优选该载体为可以将本发明的多核苷酸导入至宿主细胞、且可以在宿主细胞内表达该多核苷酸的表达载体。优选该载体包含本发明的多核苷酸、及与其可操作地连结的控制区域。该载体可以为在质粒等染色体外可独立增殖及复制的载体，或也可以为被重组至染色体内的载体。

作为具体的载体的实例，可举出例如：pBluescript II SK(-)(Stratagene)、pUC18/19、pUC118/119等pUC系载体(Takara Bio)、pET系载体(Takara Bio)、pGEX系载体(GE Healthcare)、pCold系载体(Takara Bio)、pHY300PLK(Takara Bio)、pUB110(Mckenzie，T.et al.，1986，Plasmid 15(2):93-103)、pBR322(Takara Bio)、pRS403(Stratagene)、pMW218/219(NIPPONGENE)、pRI909/910等pRI系载体(Takara Bio)、pBI系载体(Clontech)、IN3系载体(Inplanta Innovations)、PTR1/2(Takara Bio)，pDJB2(D.J.Ballance et al.，Gene，36，321-331，1985)，pAB4-1(van Hartingsveldt W et al.，MoI Gen Genet，206，71-75，1987)，pLeu 4(M.I.G.Roncero et al.，Gene，84，335-343，1989)，pPyr 225(C.D.Skory et al.，Mol Genet Genomics，268，397-406，2002)、pFG1(Gruber，F.et al.，Curr Genet，18，447-451，1990)等。

或者，也可以构建含有上述本发明的多核苷酸的DNA片段。作为该DNA片段，可举出例如PCR扩增DNA片段及限制性内切酶切断DNA片段。优选该DNA片段可以为包含本发明的多核苷酸、及与其可操作地连结的控制区域的表达盒。

上述载体或DNA片段中所含的控制区域为用于在导入有该载体或DNA片段的宿主细胞内使本发明的多核苷酸表达的序列，可举出例如启动子或终止子等表达调节区域、复制起始点等。该控制区域的种类可以根据导入载体或DNA片段的宿主细胞的种类而适当选择。根据需要该载体或DNA片段可以进一步具有抗生素抗性基因、氨基酸合成相关基因等选择标记。

作为本发明的转化细胞，包括相对于宿主细胞以编码本发明的多肽的多核苷酸能够表达的方式被导入了的细胞、或者该多核苷酸的表达被强化了的细胞，但是优选含有外源的多核苷酸的细胞。

作为以能够表达该多核苷酸的方式导入或者强化该多核苷酸的方法，例如，可举出将控制区域、优选强控制区域(与野生型相比能够强化表达的控制区域)和含有可操作地连结的本发明的多核苷酸的载体或DNA片段导入到宿主细胞；或者在宿主细胞的基因组上，将强控制区域和本发明的多核苷酸可操作地连结配置(例如，将亲细胞的基因组上的本发明的多核苷酸的控制区域序列取代为强控制区域)等。

作为本发明的转化细胞，与宿主细胞(亲细胞)相比，细胞内碳酸酐酶活性优选提高1.1倍以上，更优选为2倍以上，进一步优选为5倍以上，进一步优选为10倍以上，进一步优选为15倍以上，进一步优选为20倍以上。在宿主细胞不持有编码本发明的多肽的基因并且不表达本发明的多肽的情况下，本发明的转化细胞包括可识别该基因的转录的表型发生了变化的细胞。

作为上述转化细胞的宿主细胞，可以使用微生物细胞、植物细胞、及动物细胞的任意种。从C4二羧酸的制造效率的观点出发，宿主细胞优选为微生物细胞。该微生物可以为原核生物及真核生物的任意种。其中，从C4二羧酸生产率的观点出发，该微生物优选为丝状菌或酵母，更优选为丝状菌。作为该丝状菌，包含属于细区分真菌类(Eumycota)及卵菌(Oomycota)的全部的丝状形的菌(以根据Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby'sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，bUniversity，Press，Cambridge，UK定义的方式)。丝状菌一般而言利用由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖及其它复合多糖构成的菌丝体壁来赋予特征。营养生长是利用菌丝扩张，而且碳代谢为绝对有氧。

作为用作本发明的转化细胞的宿主细胞的丝状菌的优选的实例，可举出：枝顶孢(Acremonium)属、曲霉(Aspergillus)属、短梗霉(Aureobasidium)属、烟管霉(Bjerkandera)属、拟蜡菌(Ceriporiopsis)属、金孢子菌(Chrysosporium)属、鬼伞(Coprinus)属、云芝(Coriolus)属、隐球菌(Cryptococcus)属、线黑粉酵母(Filibasidium)属、镰刀菌(Fusarium)属、腐质霉(Humicola)属、梨孢菌(Magnaporthe)属、毛霉(Mucor)属、毁丝霉(Myceliophthora)属、新美鞭菌(Neocallimastix)属、脉孢菌(Neurospora)属、拟青霉(Paecilomyces)属、Parasitella属、青霉菌(Penicillium)属、平革菌(Phanerochaete)属、脉射菌(Phlebia)属、瘤胃壶菌(Piromyces)属、侧耳(Pleurotus)属、根霉(Rhizopus)属、裂褶菌(Schizophyllum)属、踝节菌(Talaromyces)属、嗜热子囊菌(Thermoascus)属、梭孢壳霉(Thielavia)属、弯颈霉(Tolypocladium)属、栓菌(Trametes)属、和木霉(Trichoderma)属的丝状菌。其中，从C4二羧酸的生产率的观点出发，优选戴尔根霉(Rhizopus delemar)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、华根霉(Rhizopus chinensis)、黑根霉(Rhizopus nigricans)、东京根霉(Rhizopus tonkinensis)、小麦曲根霉(Rhizopustritici)、米根霉(Rhizopus oryzae)等根霉(Rhizopus)属菌，更优选戴尔根霉(Rhizopusdelemar)及米根霉(Rhizopus oryzae)，进一步优选戴尔根霉(Rhizopus delemar)。

向上述宿主细胞的载体或DNA片段的导入中，可以采用通常的转化法，例如电穿孔法、转化法、转染法、连接法、原生质体法、颗粒枪法、农杆菌注射法等。

导入有目标载体或DNA片段的转化细胞可以利用选择标记而进行选择。例如，选择标记为抗生素抗性基因时，通过在该抗生素添加培养基中培养细胞，可以选择导入有目标载体或DNA片段的转化细胞。另外，例如选择标记为氨基酸合成相关基因时，在该氨基酸要求性的宿主细胞中导入基因之后，可以将该氨基酸要求性的有无作为指标，选择导入有目标载体或DNA片段的转化细胞。或者，通过利用PCR等研究转化细胞的DNA序列，也可以确认目标载体或DNA片段的导入。

另外，作为强控制区域，例如可以例举rRNA操纵子的控制区域、编码核糖体蛋白质的基因(rplS基因等)的控制区域、adh1启动子(日本特愿2015-155759)、ldhA启动子(美国专利第6268189号)、pgk1启动子(国际公开第2001/73083号)、pgk2启动子(国际公开第2001/72967号)、pdcA启动子和amyA启动子(Archives of Microbiology，2006，186：41-50)，tef和18S rRNA启动子(美国专利申请公开第2010/112651号)等，但是不特别限定于这些例子。

作为将亲细胞的基因组上存在的本发明的多核苷酸的控制区域取代为强控制区域的方法，可举出将含有强控制区域和选择标记的多核苷酸序列的DNA片段导入宿主细胞，并选择通过同源重组或非同源重组等转化细胞的方法等。

(2.3.C4二羧酸生产能力的提高)

关于上述本发明的转化细胞，本发明的多肽的表达量提高，该细胞内的碳酸酐酶活性强化。由此，该转化细胞的C4二羧酸生产能力提高。例如，含有包含多核苷酸的载体或DNA片段的转化细胞与其宿主细胞(亲细胞)相比，C4二羧酸生产能力提高优选5％以上、更优选10％以上、进一步优选15％以上。

(3.C4二羧酸的制造)

本发明的转化细胞的C4二羧酸生产能力提高。因此，本发明还提供一种包含将上述本发明的转化细胞进行培养的C4二羧酸的制造方法。作为通过该本发明的制造方法而制造的C4二羧酸，可举出富马酸、苹果酸、及琥珀酸，优选为富马酸和苹果酸，更优选为富马酸。

本发明的制造方法中的转化细胞的培养包含将含有该转化细胞的微生物、植物体、动物体、或它们的细胞或组织进行培养。用于将该转化细胞进行培养的培养基及培养条件可以根据该转化细胞的宿主的种类而适当选择。一般而言，可以采用相对于该转化细胞的宿主通常使用的培养基及培养条件。

例如，转化细胞为丝状菌时，培养温度只要为例如10℃～50℃、优选25℃～45℃即可，另外，培养期间只要是充分地产生目标C4二羧酸的期间，就没有特别限定，可以为例如1～240小时、优选12～120小时、优选24～72小时。优选在搅拌或通气下进行培养。

作为用于丝状菌培养的培养基，只要使用通常使用的培养基即可。优选该培养基为液体培养基，另外，也可以为合成培养基、天然培养基、及合成培养基中添加了天然成分的半合成培养基中的任意种。也可以使用市售的PDB培养基(马铃薯葡萄糖培养基；Becton，Dickinson and Company制等)、PDA培养基(Becton，Dickinson and Company制等)、LB培养基(Luria-Bertani培养基；日本制药公司制(商标名“DaiGo”)等)、NB培养基(NutrientBroth；Becton，Dickinson and Company制等)、SB培养基(Sabouraud培养基；OXOID公司制等)、SD培养基(Synthetic Dropout Broth；例如Clontech)等。一般在该培养基中含有碳源、氮源、无机盐等，但各成分组成可以适当选择。

以下，对用于丝状菌培养的优选的培养基组成进行详述。以下所记载的培养基中的各成分的浓度表示初始(培养基制备时或培养开始时)的浓度。

作为上述培养基中的碳源的实例，可举出葡萄糖、麦芽糖、淀粉水解物、果糖、木糖、蔗糖等，其中，优选葡萄糖及果糖。这些糖类可以单独或组合2种以上而使用。该培养基中的碳源的浓度优选为1％(w/v)以上、更优选为5％(w/v)以上，且优选为40％(w/v)以下，更优选为30％(w/v)以下。或者，上述培养基中的碳源的浓度优选为1～40％(w/v)，更优选为5～30％(w/v)。

作为上述培养基中的氮源的实例，可举出：硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等含氮化合物。该培养基中的氮源的浓度优选为0.001～0.5％(w/v)，更优选为0.001～0.2％(w/v)。

在上述培养基中，可以含有硫酸盐、镁盐、锌盐等。作为硫酸盐的实例，可举出硫酸镁、硫酸锌、硫酸钾、硫酸钠、硫酸铵等。作为镁盐的实例，可举出硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等。作为锌盐的实例，可举出硫酸锌、硝酸锌、氯化锌等。该培养基中的硫酸盐的浓度优选为0.01～0.5％(w/v)，更优选为0.02～0.2％(w/v)。该培养基中的镁盐的浓度优选为0.001～0.5％(w/v)，更优选为0.01～0.1％(w/v)。该培养基中的锌盐的浓度优选为0.001～0.05％(w/v)，更优选为0.005～0.05％(w/v)。

上述培养基的pH(25℃)优选为3～7，更优选为3.5～6。培养基的pH可以使用氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钙、氨等碱；或硫酸、盐酸等酸进行调节。

作为上述培养基的优选的实例，可举出：含有7.5～30％碳源、0.001～0.2％硫酸铵、0.01～0.6％磷酸二氢钾、0.01～0.1％硫酸镁·七水合物、0.005～0.05％硫酸锌·七水合物、及3.75～20％碳酸钙(浓度均为％(w/v))的液体培养基。

为了使用以丝状菌为宿主的转化体更有效地生产C4二羧酸，可以在以下所示的工序中进行生产。即，可以通过制备转化细胞的孢子悬浮液(工序A)，将其在培养液中进行培养使孢子发芽而制备菌丝体(工序B1)、优选进一步使该菌丝体增殖(工序B2)、接着将制备的菌丝体进行培养而生产C4二羧酸(工序C)，从而有效地制造C4二羧酸。但是，本发明中的转化细胞的培养工序并不限定于以下的工序。

＜工序A：孢子悬浮液的制备＞

将转化的丝状菌的孢子接种于例如无机琼脂培养基(组成例：2％葡萄糖、0.1％硫酸铵、0.06％磷酸二氢钾、0.025％硫酸镁·七水合物、0.009％硫酸锌·七水合物、1.5％琼脂、浓度均为％(w/v))、PDA培养基等培养基，通过在10～40℃、优选27～30℃下进行7～10天静置培养而形成孢子，接着悬浮于生理盐水等，由此可以制备孢子悬浮液。在孢子悬浮液中可以含有菌丝体，也可以不含有。

＜工序B1：菌丝体的制备＞

将工序A中得到的孢子悬浮液接种于培养液而进行培养，使孢子发芽而得到菌丝体。接种于培养液的丝状菌的孢子数为1×10²～1×10⁸个-孢子/mL-培养液、优选1×10²～5×10⁴个-孢子/mL-培养液、更优选5×10²～1×10⁴个-孢子/mL-培养液、进一步优选1×10³～1×10⁴个-孢子/mL-培养液。在培养液中，可以利用市售的培养基、例如PDB培养基、LB培养基、NB培养基、SB培养基、SD培养基等。从发芽率和菌体生长的观点出发，在该培养液中，可以适当添加作为碳源的葡萄糖、木糖等单糖，蔗糖、乳糖、麦芽糖等低聚糖，或淀粉等多糖；甘油、柠檬酸等生物体成分；作为氮源的硫酸铵、尿素、氨基酸等；作为其它无机物的钠、钾、镁、锌、铁、磷酸等的各种盐类。单糖、低聚糖、多糖及甘油的优选的浓度为0.1～30％(w/v)，柠檬酸的优选的浓度为0.01～10％(w/v)，硫酸铵、尿素及氨基酸的优选浓度为0.01～1％(w/v)，无机物的优选的浓度为0.0001～0.5％(w/v)。在上述培养液中接种孢子悬浮液，一边以优选80～250rpm、更优选100～170rpm进行搅拌，一边在25～42.5℃的培养温度控制下培养优选24～120小时、更优选48～72小时。供于培养的培养液的量只要与培养容器相符而适当调整即可，例如200mL容积带挡板的烧瓶的情况下为50～100mL左右、500mL容积带挡板的烧瓶的情况下为100～300mL左右即可。通过该培养，接种的孢子进行发芽，成长为菌丝体。

＜工序B2：菌丝体的增殖＞

从C4二羧酸生产能力提高的观点出发，优选进行将工序B1中得到的菌丝体进一步培养并使其增殖的工序(工序B2)。工序B2中使用的增殖用的培养液没有特别限定，只要是通常使用的含有葡萄糖的无机培养液即可，可举出例如含有7.5～30％葡萄糖、0.05～0.2％硫酸铵、0.03～0.6％磷酸二氢钾、0.01～0.1％硫酸镁·七水合物、0.005～0.05％硫酸锌·七水合物、及3.75～20％碳酸钙(浓度均为％(w/v))的培养液等。该培养液的量只要与培养容器相符而适当调整即可，例如500mL容积三角烧瓶的情况下为50～300mL、优选为100～200mL即可。在该培养液中，将工序B1中培养的菌体以作为湿重量成为1～6g-菌体/100mL-培养液、优选3～4g-菌体/100mL-培养液的方式接种，一边以100～300rpm、优选170～230rpm进行搅拌，一边在25～42.5℃的培养温度控制下培养12～120小时、优选24～72小时。

＜工序C：C4二羧酸生产＞

将上述的步骤(工序B1或B2)中得到的丝状菌的菌丝体进行培养，在该菌中生产C4二羧酸。该培养的条件只要按照上述的通常的丝状菌的培养条件即可。就培养基的量而言，200mL容积三角烧瓶的情况下可以设为20～80mL左右，500mL容积三角烧瓶的情况下可以设为50～200mL左右，30L发酵缸的情况下可以设为10L～15L左右，但只要与培养容器相符适当调整即可。相对于培养基的工序B1或B2中得到的菌体的接种量优选作为湿重量可以为5g～90g-菌体/100mL-培养基，更优选5g～50g-菌体/100mL-培养基。优选一边以100～300rpm、优选150～230rpm进行搅拌、一边在25～45℃的温度下进行2小时～240小时、优选12小时～120小时进行培养。使用发酵缸的情况下，以优选0.05～2vvm、更优选0.1～1.5vvm进行通气。

通过以上的步骤将本发明的转化细胞进行培养，生产C4二羧酸。培养后，从培养物中回收C4二羧酸。根据需要，可以将回收的C4二羧酸进一步进行精制。从培养物中将C4二羧酸进行回收或精制的方法没有特别限定，只要按照公知的回收或精制方法进行即可。例如通过倾斜法、过滤、离心分离等从培养物中除去细胞等，将剩余的培养物根据需要进行浓缩之后，附加晶析法、离子交换法、溶剂提取法等方法、或这些方法的组合，由此可以将该培养物中的C4二羧酸进行回收或精制。

从培养物中分离的本发明的转化细胞可以在C4二羧酸生产中再利用。例如可以在从培养物中分离的本发明的转化细胞中新加入上述的培养基，再在上述条件下进行培养而生产C4二羧酸，接着从培养基中回收生产的C4二羧酸。可以进一步重复该过程。在本发明的制造方法中，转化细胞的培养及C4二羧酸的回收可以通过间歇式、半间歇式及连续式的任意种方法进行。

(4.例示的实施方式)

作为本发明的例示的实施方式，将以下的物质、制造方法、用途、方法等进一步公开于本说明书。但是，本发明并不限定于这些实施方式。

[1]一种多肽，其中，由序列号2表示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成。

[2]根据[1]所述的多肽，其中，优选与上述序列号2表示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列为与序列号2表示的氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步更优选98％以上、另外优选具有99％以上的同一性的氨基酸序列；或为相对于序列号2表示的氨基酸序列，1个以上且10个以下、优选1个以上且8个以下、更优选1个以上且5个以下、进一步优选1个以上且3个以下的氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。

[3]根据[1]或[2]所述的多肽，其中，优选具有碳酸酐酶活性。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的多肽，其中，优选具有细胞的C4二羧酸生产能力提高功能。

[5]根据[4]所述的多肽，其中，使细胞的C4二羧酸生产能力优选提高5％以上、更优选10％以上、进一步优选15％以上。

[6]一种多核苷酸，其中，编码[1]～[5]中任一项所述的多肽。

[7]根据[6]所述的多核苷酸，其中，优选由序列号1表示的核苷酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成。

[8]根据[7]所述的多核苷酸，其中，优选与上述序列号1表示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列为与序列号1表示的核苷酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步更优选98％以上、另外优选具有99％以上的同一性的核苷酸序列；或为相对于序列号1表示的核苷酸序列，1个以上且30个以下、优选1个以上且24个以下、更优选1个以上且15个以下、进一步优选1个以上且9个以下的核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。

[9]根据[6]～[8]中任一项所述的多核苷酸，其中，优选为cDNA或化学合成DNA。

[10]一种载体或DNA片段，其中，含有[6]～[9]中任一项所述的多核苷酸。

[11]根据[10]所述的载体或DNA片段，其中，优选还含有与上述多核苷酸可操作地连结的控制区域。

[12]一种转化细胞，其中，含有外来的[6]～[9]中任一项所述的多核苷酸。

[13]一种转化细胞，其中，优选含有[6]～[9]中任一项所述的多核苷酸、[10]中所述的载体或DNA片段。

[14]一种转化细胞，其中，[6]～[9]中任一项所述的多核苷酸的表达被强化。

[15]根据[12]、[13]或[14]所述的转化细胞，其中，优选上述细胞为微生物细胞。

[16]根据[15]所述的转化细胞，其中，优选上述微生物为丝状菌。

[17]根据[16]所述的转化细胞，其中，优选上述丝状菌为根霉属(Rhizopus)。

[18]根据[17]所述的转化细胞，其中，上述根霉属优选为戴尔根霉(Rhizopusdelemar)或米根霉(Rhizopus oryzae)，更优选为戴尔根霉(Rhizopus delemar)。

[19]根据[12]～[18]中任一项所述的转化细胞，其中，优选C4二羧酸生产能力提高。

[20]根据[19]所述的转化细胞，其中，上述C4二羧酸生产能力优选提高5％以上、更优选10％以上、进一步优选15％以上。

[21]根据[19]或[20]所述的转化细胞，其中，优选上述C4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸，更优选为富马酸或苹果酸，进一步优选为富马酸。

[22]一种C4二羧酸的制造方法，其中，包含将[12]～[21]中任一项所述的转化细胞进行培养。

[23]根据[22]所述的制造方法，其中，优选还包含从上述培养物中回收C4二羧酸。

[24]根据[22]或[23]所述的制造方法，其中，优选上述C4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸，更优选为富马酸或苹果酸，进一步优选为富马酸。

[25]一种转化细胞的制造方法，其中，包括将[6]～[9]中任一项所述的多核苷酸导入至宿主细胞，或者强化[6]～[9]中任一项所述的多核苷酸的表达。

[26]一种宿主细胞中的C4二羧酸生产能力的提高方法，其中，包含将[6]～[9]中任一项所述的多核苷酸导入至宿主细胞，或者强化[6]～[9]中任一项所述的多核苷酸的表达。

[27]根据[26]所述的方法，其中，上述宿主细胞中的C4二羧酸生产能力优选提高5％以上、更优选10％以上、进一步优选15％以上。

[28]根据[26]或[27]所述的方法，其中，优选上述C4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸，更优选为富马酸或苹果酸，进一步优选为富马酸。

[29]根据[25]～[28]中任一项所述的方法，其中，优选包含将[10]所述的载体或DNA片段导入至宿主细胞。

[30]根据[25]～[29]中任一项所述的方法，其中，优选上述宿主细胞为微生物细胞。

[31]根据[30]所述的方法，其中，优选上述微生物为丝状菌。

[32]根据[31]所述的方法，其中，优选上述丝状菌为根霉属(Rhizopus)。

[33]根据[32]所述的方法，其中，上述根霉属优选为戴尔根霉(Rhizopusdelemar)或米根霉(Rhizopus oryzae)，更优选为戴尔根霉(Rhizopus delemar)。

实施例

以下，基于实施例，进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。

实施例1转化细胞的制备

(1)基因组提取

在PDA培养基中植菌戴尔根霉(Rhizopus delemar)JCM(Japan Collection ofMicroorganisms/理研)5557株(以下，记为5557株)的孢子后，在30℃下进行5天培养。培养后，将菌体与3mL用金属锥(Metal Cone)(安井器械)一起放入3mL破碎管中，立即在液氮中使其冻结10分钟以上。其后，使用多珠振荡器(multibeads shocker)(安井器械)，以1700rpm进行10秒菌体的破碎。在破碎后的容器中加入TE缓冲液(TE Buffer)(pH8.0)(NIPPONGENE)400μL并颠倒混合，将250μL移至1.5mL管。从该菌体溶液，使用“GenTLE(酵母用)”(Takara Bio)，根据操作说明进行基因组提取。相对于得到的基因组溶液50μL，添加RNaseA(Roche)1μL，在37℃下使其反应1小时。反应后，加入等量的苯酚/氯仿，通过轻敲(tapping)进行混合之后，在4℃下以14500rpm离心5分钟，将上清液移至新的1.5mL管。再次重复苯酚/氯仿处理，接着进行乙醇沉淀，得到5557株的精制基因组溶液。

(2)cDNA的制备

(i)总RNA提取

将5557株的菌体6g-湿重量植菌于液体培养基40mL(0.1g/L(NH₄)₂SO₄、0.6g/LKH₂PO₄、0.25g/L MgSO₄·7H₂O、0.09g/L ZnSO₄·7H₂O、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖)，在35℃下以170rpm培养8小时。从培养液中将菌体进行过滤、回收，用0.85％生理盐水100mL进行2次清洗。清洗后，通过吸滤而除去多余的水分之后，量取0.3g，与3mL用金属锥(安井器械)一起放入3mL破碎管中，立即投入于液氮并使其冻结。使用多珠振荡器(安井器械)将得到的冻结菌体以1700rpm破碎10秒。在破碎后的菌体中添加RLT缓冲液(RLT buffer)500μL并颠倒混合后，将450μL供给RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)，进行总RNA提取。在得到的RNA溶液40μL中添加1μL的DNaseI(TaKaRa)及5μL的10×DNaseI缓冲液(DNaseI buffer)(USBCorporation)，用无RNA酶水(RNase free water)补充到50μL之后，在37℃下使其反应30分钟以上而除去溶液中的残存DNA。进一步追加1μL DNaseI，在37℃下使其反应30分钟后，进行苯酚/氯仿提取，接着进行乙醇沉淀。将沉淀溶解于50μL的灭菌水，使用Qubit(LifeTechnologies)测定RNA溶液的浓度及纯度。另外，将该RNA溶液适当稀释，使用Agilent2100Bioanalyzer(Agilent)及RNA6000Pico Kit(Agilent)进行提取的RNA的检测。确认作为RNA的分解度指标的“RNA完整性数(RNA Integrity Number)(RIN值)”为6.0以上，将得到的RNA溶液作为总RNA取得。

(ii)cDNA合成

cDNA合成使用SuperScriptIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(Invitrogen)而进行。即，将(i)中得到的RNA溶液1μg用DEPC水补充到8μL之后，添加10μL的2×RT Reaxtion Mix和2μL的RT Enzyme Mix，平稳地混合，在25℃下使其反应10分钟，在50℃下使其反应30分钟，在85℃下使其反应5分钟。在反应后的溶液中加入1μL的RNaseH，在37℃下使其反应20分钟，将其设为cDNA溶液。

(3)质粒载体的制备

(i)向pUC18的trpC基因区域的导入

以上述(1)中得到的5557株的基因组DNA为模板，通过使用有引物oJK162(序列号4)及oJK163(序列号5)的PCR来合成含有trpC基因(序列号3)的DNA片段。接着，以质粒pUC18为模板，通过使用有引物oJK164(序列号6)及oJK165(序列号7)的PCR来将DNA片段进行扩增。将以上的2个片段使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)连结，构建质粒pUC18-trpC。

(ii)ADH1启动子、终止子的克隆

以上述(1)中得到的5557株的基因组DNA为模板，将含有ADH1的启动子序列(序列号8)的DNA片段和含有终止子序列(序列号9)的DNA片段分别通过使用有引物oJK202(序列号10)及oJK204(序列号11)、以及oJK205(序列号12)及oJK216(序列号13)的PCR来进行扩增。接着，以(i)中得到的质粒pUC18-trpC为模板，通过使用有引物oJK210(序列号14)及oJK211(序列号15)的PCR来将DNA片段进行扩增。将以上的3片段用与(i)同样的步骤连结，构建质粒pUC18-trpC-Padh-Tadh。在得到的质粒中，在trpC基因区域的下游依次配置有ADH1启动子及终止子。进一步在ADH1终止子的下游配置有Not I限制性内切酶识别序列。

(iii)质粒载体制备

通过人工基因合成，合成含有序列号1表示的基因(以下，称为RdCA1S)的质粒，通过使用引物NK-035(序列号16)和NK-036(序列号17)进行PCR扩增。接着，以(ii)中得到的质粒pUC18-trpC-Padh-Tadh为模板，通过采用引物NK-011(序列号18)和NK-012(序列号19)的PCR对DNA片段进行扩增。将上述2个片段用与(i)同样的步骤连结，构建质粒pUC18-trpC-Padh-RdCA1S-Tadh。在获得的质粒中，ADH启动子和终止子之间插入有序列号1所示的RdCA1S基因。此外，通过人工基因合成，合成含有序列号22表示的基因(以下，称为RdCA1L)的质粒，通过使用了引物Padh-RdCAfull F(序列号24)和RdCA-Tadh R2(序列号25)进行PCR扩增。接着，以(ii)中得到的pUC18-trpC-Padh-Tadh为模板，通过采用引物RdPADH R(序列号26)和RdPADH F(序列号27)的PCR对DNA片段进行扩增。将上述2片段用与(i)同样的步骤连结，构建了质粒pUC18-trpC-Padh-RdCA1L-Tadh。

用于制备质粒载体pUC18-trpC-Padh-RdCA1S-Tadh和pUC18-trpC-Padh-RdCA1L-Tadh的PCR引物示于表1中。

[表1]

引物	序列(5′→3′)	序列号
			oJK162	cgagctcgaattatttaaatgaacagcaagttaataatctagaggg	4
oJK163	tatgaccatgattacgatgagaggcaaaatgaagcgtac	5
			oJK164	atttaaataattcgagctcggtacccgggg	6
oJK165	cgtaatcatggtcatagctg	7
			oJK202	tagagggaaaaagagagaattgaaatagg	10
oJK204	ttttgttatttaattgtattaattgataatg	11
			oJK205	aattaaataacaaaatcattttaattacgcattttc	12
oJK216	catgattacgcggccgcgccattataatgcactagtg	13
			oJK210	ctctttttccctctaatgagaggcaaaatgaagcgtac	14
oJK211	aattaaataacaaaaatgtcttctatcgaaacctccaaaatctc	15
			NK-035	aattaaataacaaaaatggtgtcttctcctatccg	16
NK-036	gcgtaattaaaatgattataaaggttgacaagc	17
			NK-011	ttttgttatttaattgtattaattg	18
NK-012	tcattttaattacgcattttc	19
			RdPADH R	ttttgttatttaattgtattaattg	24
RdTADH F	tcattttaattacgcattttcatttac	25
			Padh-RdCAfull F	aattaaataacaaaaatgatgacccaagaactggatg	26
RdCA-Tadh R2	gcgtaattaaaatgattataaaggttgacaagcataaatag	27

(4)向宿主细胞的基因导入

(i)色氨酸营养缺陷型株的制作

用作基因导入的宿主细胞的色氨酸营养缺陷型株是从向5557株的离子束照射形成的变异导入株中选拔而取得。离子束照射在独立行政法人日本原子力研究开发机构·高崎量子应用研究所的离子照射设施(TIARA)中进行。就照射而言，使用AVF回旋加速器将¹²C⁵ ⁺进行加速，以220MeV的能量进行100～1250Gray照射。从照射过的菌体中回收孢子，从其中取得显示色氨酸营养缺陷型的戴尔根霉(Rhizopus delemar)02T6株(以下，记为02T6株)。02T6株的trpC基因编码区域(序列号3)全长2298bp中的第2093号缺损一个碱基。

(ii)质粒载体的扩增

分别使用上述(3)中制作的质粒载体pUC18-trpC-Padh-Tadh、pUC18-trpC-Padh-RdCA1S-Tadh以及pUC18-trpC-Padh-RdCA1L-Tadh，将大肠杆菌DH5α株(NIPPON GENE)利用感受态细胞转化法进行转化。将得到的转化细胞在37℃下静置一夜，将得到的菌落接种于LBamp液体培养基(Bacto Trypton 1％、酵母提取物(Yeast Extract)0.5％、NaCl 1％，氨苄西林钠50μg/mL)2mL，在37℃下培养一夜。由该培养液使用高纯度质粒分离试剂盒(RocheLife Science)进行各质粒载体的精制。

(iii)质粒载体向宿主细胞的导入

将(ii)中得到的质粒载体pUC18-trpC-Padh-Tadh、pUC18-trpC-Padh-RdCA1S-Tadh以及pUC18-trpC-Padh-RdCA1L-Tadh的各DNA溶液(1μg/μL)10μL加入至金颗粒溶液(60mg/mL)100μL并混合之后，加入0.1M亚精胺40μL，用涡旋振荡器(Vortex)充分搅拌。进一步加入2.5M CaCl₂ 100μL，用涡旋振荡器搅拌1分钟，接着以6000rpm离心30秒，除去上清液。在得到的沉淀中加入70％EtOH200μL，用涡旋振荡器搅拌30秒之后，以6000rpm离心30秒，除去上清液。将得到的沉淀用100μL的100％EtOH进行再悬浮。

接着，对(i)中制备的02T6株的孢子，使用上述的DNA-金颗粒溶液，用GDS-80(NepaGene)进行基因导入。基因导入后的孢子在无机琼脂培养基(20g/L葡萄糖、1g/L硫酸铵、0.6g/L磷酸二氢钾、0.25g/L硫酸镁·七水合物、0.09g/L硫酸锌·七水合物、15g/L琼脂)上、在30℃的条件下静置培养1周左右。用植菌环搔取生长的菌体的一部分，悬浮于TE(pH8.0)(NIPPON GENE)。将悬浮溶液在95℃下处理15分钟，由转化株提取核酸。以该核酸为模板，进行使用了引物oJK438(序列号20)及oJK439(序列号21)的PCR反应，将确认有目标DNA片段的导入的菌株选拔作为转化株。将PCR引物示于表2。将导入有含有在ADH1启动子下游连结有RdCA1S基因的DNA的pUC18-trpC-Padh-RdCA1S-Tadh的株设为CA1S株，将导入有含有连结有RdCA1L基因的DNA的pUC18-trpC-Padh-RdCA1L-Tadh的株设为CA1L株，另一方面导入有含有没有插入RdCA1L基因的DNA的质粒载体pUC18-trpC-Padh-Tadh的株作为负对照株(以下，称为“NC株”)来取得。用植菌环搔取剩余的菌体，在孢子回收溶液(8.5g/L氯化钠、0.5g/L聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)中激烈地进行混合。将混合后的孢子悬浮液用3GP100圆筒漏斗型玻璃过滤器(柴田化学)进行过滤，将其设为孢子液。孢子液中的孢子数使用TC 20自动细胞计数器(Bio-Rad)进行测定。

[表2]

引物	序列(5′→3′)	序列号
			oJK438	gttccttgctgtggatttgtg	20
oJK439	gggtgtatctctgtcctattcatg	21

实施例2 CA1S株的细胞内碳酸酐酶活性测定

(1)菌株的培养

(i)菌丝体的制备

将添加有以最终浓度计为0.5％(v/v)的山梨糖醇酐单月桂酸酯(RHEODOL SP-L10(花王))的200mL的SD/-Trp培养基(Clontech)和PDB培养基(Becton，Dickinson andCompany制)供给500mL用带挡板的三角烧瓶(旭硝子)，以成为1×10³个-孢子/mL-培养基的方式分别接种实施例1中制备的CA1株S及5557株的各孢子液之后，在27℃下以170rpm搅拌培养3天。使用预先进行了灭菌处理的网眼筛目250μm的不锈钢筛(AS ONE)将得到的培养物进行过滤，在过滤器上回收菌体。

(ii)菌丝体的增殖

在供给500mL容积三角烧瓶的无机培养液100mL(0.1g/L(NH₄)₂SO₄、0.6g/L KH₂PO₄、0.25g/L MgSO₄·7H₂O、0.09g/L ZnSO₄·7H₂O、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖)中接种(i)中回收的湿菌体5.0～8.0g，在27℃下以220rpm搅拌培养约40小时。使用预先进行了灭菌处理的不锈钢滤网支架(MILLIPORE)将得到的培养物进行过滤，在过滤器上回收菌体。进一步在该过滤器支架上用200mL的生理盐水清洗菌体。用于清洗的生理盐水进行吸滤而除去。

(2)菌体破碎液的制备

将6.0g上述(1)中得到的CA1S株和5557株的湿菌体植菌于提供给200mL容积三角烧瓶的无机培养液40mL(0.0175g/L(NH₄)₂SO₄、0.06g/L KH₂PO₄、0.375g/L MgSO₄·7H₂O、0.135g/L ZnSO₄·7H₂O、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖)，在35℃下以170rpm进行搅拌培养24小时。使用预先灭菌的灭菌筛网过滤器支架(MILLIPORE)过滤获得的培养物，并在过滤器上收集菌体。再在过滤器支架上用200mL生理盐水洗涤菌体，通过抽滤除去生理盐水，并将0.3g菌体在-80℃下冷冻。使用多珠冲击器和金属锥(MetalCone)(安井器械)破坏冷冻菌体。向其中加入50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)1mL并再次粉碎，以15000rpm在4℃下离心分离5分钟后，用Amicon Ultra-0.5(3kDa，Millipore)进行浓缩、洗净上清液，作为菌体破碎液。

(3)碳酸酐酶活性的测量

添加上述(2)中得到的CA1S株和5557株的菌体破碎液10μL到96孔测定板(Iwaki)中，然后加入120μL的反应液(最终浓度50mM的Tris-HCl pH8.0，50mM Na₂SO₄，0.004％酚红)，加入浸入干冰中30分钟的CO₂饱和水70μL开始反应。以直到30℃下557nm的吸光度降到0.35以下的时间作为基准，按照文献(C.S.Gai et al.，AMB Express 2014，4，2-13.)算出活性值(U/湿菌体计算重量g)。分析结果如表3所示。与作为野生株的5557株的碳酸酐酶活性相比，CA1S株中碳酸酐酶活性提高到22倍。

[表3]

实施例3 CA1S株和CA1L株的C4二羧酸生产能力

(1)菌株的培养

(i)菌丝体的制备

将添加有以最终浓度计为0.5％(v/v)的山梨糖醇酐单月桂酸酯(RHEODOL SP-L10(花王))的200mL的SD/-Trp培养基(Clontech)供给于500mL用带挡板的三角烧瓶(旭硝子)，以成为1×10³个-孢子/mL-培养基的方式接种实施例1中制备的CA1S株、CA1L株和NC株的各孢子液，之后在27℃下以170rpm搅拌培养3天。将得到的培养物使用预先进行了灭菌处理的网眼筛目250μm的不锈钢筛(AS ONE)进行过滤，将菌体在过滤器上进行回收。

将添加有以最终浓度计为0.5％(v/v)的山梨糖醇酐单月桂酸酯(RHEODOL SP-L10(花王))的200mL的SD/-Trp培养基(Clontech)供给于500mL用带挡板的三角烧瓶(旭硝子)，以成为1×10³个-孢子/mL-培养基的方式接种实施例1中制备的CA1株和NC株的各孢子液，之后在27℃下以170rpm搅拌培养3天。将得到的培养物使用预先进行了灭菌处理的网眼筛目250μm的不锈钢筛(AS ONE)进行过滤，将菌体在过滤器上进行回收。

(ii)菌丝体的增殖

在与实施例2(1)(ii)同样的条件下使菌丝体增殖。

(2)转化株的C4二羧酸生产性评价

将上述(1)中得到的CA1S株、CA1L株及NC株的各湿菌体6.0g植菌于供给于200mL容积三角烧瓶的无机培养液40mL(0.0175g/L(NH₄)₂SO₄、0.06g/L KH₂PO₄、0.375g/L MgSO₄·7H₂O、0.135g/L ZnSO₄·7H₂O、50g/L碳酸钙、100g/L葡萄糖)，在35℃下以170rpm进行搅拌培养。培养8小时后，将不含有菌体的培养上清液进行回收，通过后述的参考例1中记载的步骤进行C4二羧酸(富马酸、苹果酸)的定量。基于求出的各C4二羧酸的量，按照下式算出CA1S株及CA1L株中的各C4二羧酸的生产能力提高率。

提高率(％)＝(CA1S株和CA1L株中的生产速度/NC株和5557株中的生产速度)×100-100

将结果示于表5。与没有导入RdCA1基因的NC株相比，在CA1S株中，观察到苹果酸生产能力提高18％，富马酸生产能力提高28％，另一方面，在CA1L株中，与5557株相比，没有观察到富马酸生产能力的提高。

[表4]

8小时时的C4二羧酸生产速度(g/L/h)

株名	苹果酸	富马酸
			CA1S株	0.13	1.92
NC株	0.11	1.50

19小时时的C4二羧酸生产速度(g/L/h)

株名	苹果酸	富马酸
			CA1L株	0.24	0.93
5557株	0.07	1.26

[表5]

生产能力提高率(％)

株名	苹果酸	富马酸
			CA1S株	18	28
CA1L株	343	-26

参考例1C4二羧酸及葡萄糖的定量

培养上清液中的C4二羧酸(富马酸、苹果酸及琥珀酸)的定量通过HPLC而进行。

供给HPLC分析的培养上清液预先用37mM硫酸适当稀释之后，使用DISMIC-13cp(0.20μm醋酸纤维素膜，ADVANTEC)或AcroPrep96孔过滤板(0.2μmGHP膜，日本PALL)进行不溶物的除去。

HPLC的装置使用LaChrom Elite(Hitachi High-Technologies Corporation)。在分析柱中，使用连接有ICSep ICE-ION-300Guard Column Cartride(4.0mm I.D.×2.0cm、TRANSGENOMIC)的有机酸分析用聚合物柱ICSep ICE-ION-300(7.8mm I.D.×30cm、TRANSGENOMC)，洗提液为10mM硫酸，以流速0.5mL/分钟在柱温度50℃的条件下进行溶出。各C4二羧酸的检测中使用UV检测器(检测波长210nm)。浓度标准曲线使用标准试样[富马酸(销售代理商代码063-00655、和光纯药工业)、苹果酸(销售代理商代码135-00562、和光纯药工业)、琥珀酸(销售代理商代码194-04335、和光纯药工业)而制成。基于各自的浓度标准曲线进行各成分的定量。

将从定量好的培养基中的C4二羧酸量中减去该培养基的初始C4二羧酸量的值作为C4二羧酸生产量。将培养开始后8小时的每种培养基中各C4二羧酸的量除以培养时间得到的值计算作为该细胞的各C4二羧酸的生产速度。

序列表

<110> 花王株式会社

<120> C4 二羧酸的制造方法

<130> KS1492

<150> JP 2016-129167

<151> 2016-06-29

<160> 27

<170> 专利版本 3.5

<210> 1

<211> 678

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<400> 1

atggtgtctt ctcctatccg aatcaataag tttgatccca aagatgaaaa acttgatagt 60

ttattaaaga gtaacgctga atggtccaag gccgtgacag aagctgaccc caactttttc 120

aaaaagctgg ctcagattca agaacccaag atcttgtggg ttggctgtgc tgattctcgt 180

gtgcctgcta atcaactggt tcaattggca ccgggtgaag tctttgttca cagaaatatc 240

gcgaatgtcg tctgtcactc tgatttgaat tgcctttctg tcttacaata tgcggtagat 300

gtgctcaagg tagagcacgt gattgtctgc ggtcactcca actgtggtgg tgtggcagct 360

gcgatgggca gtggtcaata tggtctgatt gataattggc ttaggaacat caaggatgtc 420

tatagatttt atgaaaagga actggatgaa atcaaggatt caaaggaacg tctgagtcga 480

ctgatcgaat ttaacgcgat acactctgct caaaatgtat gccgttcgac gattgttcag 540

aacgcatggc atcgtggaca gaaattgaca gtacacgcat gggtttatga cttggaaaat 600

ggattggtaa agagattgga attcagccat aaagatcctg ctaaacttcc atctatttat 660

gcttgtcaac ctttataa 678

<210> 2

<211> 225

<212> PRT

<213> 戴尔根霉

<400> 2

Met Val Ser Ser Pro Ile Arg Ile Asn Lys Phe Asp Pro Lys Asp Glu

1 5 10 15

Lys Leu Asp Ser Leu Leu Lys Ser Asn Ala Glu Trp Ser Lys Ala Val

20 25 30

Thr Glu Ala Asp Pro Asn Phe Phe Lys Lys Leu Ala Gln Ile Gln Glu

35 40 45

Pro Lys Ile Leu Trp Val Gly Cys Ala Asp Ser Arg Val Pro Ala Asn

50 55 60

Gln Leu Val Gln Leu Ala Pro Gly Glu Val Phe Val His Arg Asn Ile

65 70 75 80

Ala Asn Val Val Cys His Ser Asp Leu Asn Cys Leu Ser Val Leu Gln

85 90 95

Tyr Ala Val Asp Val Leu Lys Val Glu His Val Ile Val Cys Gly His

100 105 110

Ser Asn Cys Gly Gly Val Ala Ala Ala Met Gly Ser Gly Gln Tyr Gly

115 120 125

Leu Ile Asp Asn Trp Leu Arg Asn Ile Lys Asp Val Tyr Arg Phe Tyr

130 135 140

Glu Lys Glu Leu Asp Glu Ile Lys Asp Ser Lys Glu Arg Leu Ser Arg

145 150 155 160

Leu Ile Glu Phe Asn Ala Ile His Ser Ala Gln Asn Val Cys Arg Ser

165 170 175

Thr Ile Val Gln Asn Ala Trp His Arg Gly Gln Lys Leu Thr Val His

180 185 190

Ala Trp Val Tyr Asp Leu Glu Asn Gly Leu Val Lys Arg Leu Glu Phe

195 200 205

Ser His Lys Asp Pro Ala Lys Leu Pro Ser Ile Tyr Ala Cys Gln Pro

210 215 220

Leu

225

<210> 3

<211> 2298

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<400> 3

atgaccactt tacttattga caactacgac agttttactt ataatgtcta tcaatacttg 60

agctgccaag gcgccaatgt agttgtctac agaaacgaca aaatcaccat ttccgaaatt 120

gagcaattgg ctcctcgcaa tattgtcatc tcacctggcc ctggccaccc ttccaccgat 180

gccggtgtct ctcgagaggc cattcgagct tttgcaggaa agattcccat cttgggtatt 240

tgtatgggtc agcaatgtat gtatgaagtg tacggtggta aagtgtcata tgcaggtgat 300

attgtgcatg gcaaggcatc cagcatcaag catgacagtc gaggtatctt caagggcgtt 360

cctcaaaaca acatggtcac tcgttaccat tcccttgctg gcatgccttc tactttacct 420

gaaacattag aagtcactgc gactaccgac gatggtatca tcatgggcat tcgacacaag 480

gaatacactg tcgaaggtgt tcagttccat cctgaaagta tcctttgtga acacggacat 540

acgatgatca acaacttctt aagcttgcgt ggtggcacct gggaagagaa tcctgcagcc 600

ggtgttgtct ttaagaaagc tcgttccgaa acacccaaaa tcagtgctag tgaatcccaa 660

ctcgatctct ctcagcaaca acctgccgca gcaccttcca tcttgacccg catttactct 720

caacgactca aggatgttca ggcagccaag gagattcccg gccagacatt tgaagattta 780

gaaaaacttt taaagttgca cgtcgcccca cctcttcaag acgtcgtcgc tcgcgtgcgt 840

caaagcaagc ccgccttgat ggccgaagtc aagcgtgcct ctccctcgaa aggaaacatt 900

gatgtttcgg ccaacgcggc tgagcaggca cttcaatatg ctttagcagg tgcaagcgtc 960

gtctctgttc tgactgaacc caaatggttc cgcggtacga ttcatgatat gcatcaggtc 1020

cgagaggcct tgagccatct gcccaaccgt ccttgtgtgt tgagaaagga ttttattgtc 1080

gatcgctatc aaatcttgga aggttgtctg tacggtgctg atactatctt gttgatcgtg 1140

gccatgctga atgatgaaca actgcacgaa ttgtatcact atgcgaaatc attaggtatg 1200

gaacccttgg tcgaagtcaa taatacggaa gagatggccc gtgccaatgc tttgggcgca 1260

cgtctggtgg gtgttaataa tcgcaacttg cacagctttg atgttgatat ggaaaccacg 1320

agtcgattgg tagagatggt gcctgaagga acgatcttgt gtgcactttc tggtattact 1380

ggacgagctg atgttgaaat gtacgtcaaa cagggtgtgc acgctgtctt ggtgggtgaa 1440

gccctgatgc gtgcttggaa tttgaaggag tttgtgtctg atttgttggg tcatgaaaag 1500

aaggatcctg tgcctgtgtc caaggaatca aaatcttcac tagtcaaggt atgtggtatc 1560

tctagtgtgg atgcagcagt tgaagcagcc aagtcagggg ctgacttgat tggtcttatc 1620

tttgctgaaa agtccaaacg aaaagtgtct ttggaaagag ctcaagaaat cgtgtcctca 1680

gtgcgtgcgt tggatattca agtcaaacga acgttatcaa atgatgattc tcaactggat 1740

tggttccaga tgcacaagcg tctcttggaa aagcgagcaa gaaaaccttt ggtagttggc 1800

gtgtttgtga atcaatcgat tgaatacatg actgaggtgg caacgacagt cggactggac 1860

cttattcagc tgcatggaac cgaatcaacg gagcttgcac gctatttacc cgtgcctgtc 1920

atcaaagctt tccatatcga cagtggtgag ttcaatgaag ctcagatacc aaacctaaat 1980

caaccaggct cttatcatta tgtcttactg gacgctaaag tgcccagctt accatcggat 2040

caacaaggtg gacgtggtgt caagtttgat tggtcaattg ctaccaaaat cgtgaaacat 2100

aggcactttg agtttttggg taatcaagat ttccctgtca tcttggctgg tgggttggat 2160

cctaccaatg tggcatctgc cattcaacag gtgaaaccct ggattgtgga tgtgtcgagt 2220

ggtgttgaaa cagatggagt gaaggattta gaaaagattc gtgcctttgt taaaactgtc 2280

cagtcaacac aattttaa 2298

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 4

cgagctcgaa ttatttaaat gaacagcaag ttaataatct agaggg 46

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 5

tatgaccatg attacgatga gaggcaaaat gaagcgtac 39

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 6

atttaaataa ttcgagctcg gtacccgggg 30

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 7

cgtaatcatg gtcatagctg 20

<210> 8

<211> 1000

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<400> 8

tagagggaaa aagagagaat tgaaatagga gaggatgagt caaaatatag tttacataaa 60

atttctcttt tttgtgttaa atataatcta atagcagggg ttttcttagt ttacgtttat 120

atcaaagtta tcaagcatac acttttttat gatttttcat actttaatcc cttttagtat 180

tctattgttt gaaaggagag aaaaaacagc tgagggtacg gtgcacacga gatcttacga 240

taattttcct gcccaacagg aaagaagtaa ttgatcttga ttgacgctcg gagtttgcac 300

gttcggagtt tgcacttcac attgagttat actcttactt attttgaagg aagggacgag 360

aaaagatgta aatataataa taacagtagt aaatagtatg cgcatcaaga acagctacca 420

acaaaagaga gaaatatgag cttaataatg aacaatgtaa atggcagaat gaaatttaat 480

tatcaaagcg gcatctttca gaccttccgt tacttccgat agagtttttt atgcaaagta 540

ataacaactg tatatataaa aaaaagaagg ttatcaagca aaagccacaa tgtcatatct 600

ggaataatca agagtaacta ttgaatgttg gtagccaaaa gaggcacgta attttatgac 660

gaaatatcac acaaaaagat tattttgaca attcatgaat aggacagaga tacaccctaa 720

acatgaaatg taagctatat ttaaacacct caagttaatt ttgaagcttc atttgtatta 780

ttgtaaccat ttagacaagc taaatccttt ttattattgt ccttattgat tttatccaga 840

ttaccgtatc taaagagcga tcaacagaaa aacggctgat tttagaccaa agtttcacaa 900

actacatttg catgaacgtc atatatatat aaaccttgac ttttcttttt tttttttttt 960

tttttttttc attatcaatt aatacaatta aataacaaaa 1000

<210> 9

<211> 634

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<400> 9

tcattttaat tacgcatttt catttactaa tttgttacat tttgataacg tcaataaatc 60

ttctaatttc ttttgttctc aaacagttta cagttctatc ttttttttta ccacaatcaa 120

ttctcaatat acaacatagc aaatgtgctt cagtaaattc attaaattct tttaaaaaaa 180

ggtaatttgt agcataaaat tcgactttat tgacgttttt tttatgatca tatacaaata 240

aaatagttgc gaatgagaac taaatttttc attgttttta gtcatatcat ctggctgttg 300

cacgatgatc gcagcatatt tttcttcaca acactcatcc tataagcacc tttcaggact 360

ttcgtctgca ctttccatat ttgatttcat caattgattt gaatttttat ccagtacaat 420

ggtttgaatc tatacaataa attagtcaca gtataaaatt atgtctcatc ttgaacacac 480

acctgcttaa caaagaaatg aagcactcta tcaatagtaa atacaatata tgcatcgatg 540

ccaaatatat atcgtacatt ctcttcaaac gtagcttgat ctaaatcgcc atcaataaac 600

ctttcaatca tcctcactag tgcattataa tggc 634

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 10

tagagggaaa aagagagaat tgaaatagg 29

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 11

ttttgttatt taattgtatt aattgataat g 31

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 12

aattaaataa caaaatcatt ttaattacgc attttc 36

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 13

catgattacg cggccgcgcc attataatgc actagtg 37

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 14

ctctttttcc ctctaatgag aggcaaaatg aagcgtac 38

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 15

aattaaataa caaaaatgtc ttctatcgaa acctccaaaa tctc 44

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 16

aattaaataa caaaaatggt gtcttctcct atccg 35

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 17

gcgtaattaa aatgattata aaggttgaca agc 33

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 18

ttttgttatt taattgtatt aattg 25

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 19

tcattttaat tacgcatttt c 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 20

gttccttgct gtggatttgt g 21

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 21

gggtgtatct ctgtcctatt catg 24

<210> 22

<211> 1128

<212> DNA

<213> 戴尔根霉

<400> 22

atgatgaccc aagaactgga tgatgaacca ctgtcactgg tgatagtcaa gaatgatgaa 60

caagtgatag caggatcaca aagtggtgct ttgtatacct ggaattggaa cacatggtca 120

gattactcaa aatggatagg tcatcctaat tcagtggatg ctctttgcaa gttggatgag 180

gacacgatct gtaccggagg cagtgatggg ttactgcgat tgatcactgt atcaccacag 240

cagcaattcg aaggtatcct gggtgatcac ggtgaggatt tcccgataga gaagatggcg 300

gttggttttg atgaaaagta cctggcaagt tgtgggcatg atttacattt acgcttttgg 360

aacatcgaat ttctttatga aaacacaaag cggaaacaac aagaaacagc gacatctggt 420

gtaaataaac aagaaactaa tgaacccaac acagtgtctt ctcctatccg aatcaataag 480

tttgatccca aagatgaaaa acttgatagt ttattaaaga gtaacgctga atggtccaag 540

gccgtgacag aagctgaccc caactttttc aaaaagctgg ctcagattca agaacccaag 600

atcttgtggg ttggctgtgc tgattctcgt gtgcctgcta atcaactggt tcaattggca 660

ccgggtgaag tctttgttca cagaaatatc gcgaatgtcg tctgtcactc tgatttgaat 720

tgcctttctg tcttacaata tgcggtagat gtgctcaagg tagagcacgt gattgtctgc 780

ggtcactcca actgtggtgg tgtggcagct gcgatgggca gtggtcaata tggtctgatt 840

gataattggc ttaggaacat caaggatgtc tatagatttt atgaaaagga actggatgaa 900

atcaaggatt caaaggaacg tctgagtcga ctgatcgaat ttaacgcgat acactctgct 960

caaaatgtat gccgttcgac gattgttcag aacgcatggc atcgtggaca gaaattgaca 1020

gtacacgcat gggtttatga cttggaaaat ggattggtaa agagattgga attcagccat 1080

aaagatcctg ctaaacttcc atctatttat gcttgtcaac ctttataa 1128

<210> 23

<211> 375

<212> PRT

<213> 戴尔根霉

<400> 23

Met Met Thr Gln Glu Leu Asp Asp Glu Pro Leu Ser Leu Val Ile Val

1 5 10 15

Lys Asn Asp Glu Gln Val Ile Ala Gly Ser Gln Ser Gly Ala Leu Tyr

20 25 30

Thr Trp Asn Trp Asn Thr Trp Ser Asp Tyr Ser Lys Trp Ile Gly His

35 40 45

Pro Asn Ser Val Asp Ala Leu Cys Lys Leu Asp Glu Asp Thr Ile Cys

50 55 60

Thr Gly Gly Ser Asp Gly Leu Leu Arg Leu Ile Thr Val Ser Pro Gln

65 70 75 80

Gln Gln Phe Glu Gly Ile Leu Gly Asp His Gly Glu Asp Phe Pro Ile

85 90 95

Glu Lys Met Ala Val Gly Phe Asp Glu Lys Tyr Leu Ala Ser Cys Gly

100 105 110

His Asp Leu His Leu Arg Phe Trp Asn Ile Glu Phe Leu Tyr Glu Asn

115 120 125

Thr Lys Arg Lys Gln Gln Glu Thr Ala Thr Ser Gly Val Asn Lys Gln

130 135 140

Glu Thr Asn Glu Pro Asn Thr Val Ser Ser Pro Ile Arg Ile Asn Lys

145 150 155 160

Phe Asp Pro Lys Asp Glu Lys Leu Asp Ser Leu Leu Lys Ser Asn Ala

165 170 175

Glu Trp Ser Lys Ala Val Thr Glu Ala Asp Pro Asn Phe Phe Lys Lys

180 185 190

Leu Ala Gln Ile Gln Glu Pro Lys Ile Leu Trp Val Gly Cys Ala Asp

195 200 205

Ser Arg Val Pro Ala Asn Gln Leu Val Gln Leu Ala Pro Gly Glu Val

210 215 220

Phe Val His Arg Asn Ile Ala Asn Val Val Cys His Ser Asp Leu Asn

225 230 235 240

Cys Leu Ser Val Leu Gln Tyr Ala Val Asp Val Leu Lys Val Glu His

245 250 255

Val Ile Val Cys Gly His Ser Asn Cys Gly Gly Val Ala Ala Ala Met

260 265 270

Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Leu Ile Asp Asn Trp Leu Arg Asn Ile Lys

275 280 285

Asp Val Tyr Arg Phe Tyr Glu Lys Glu Leu Asp Glu Ile Lys Asp Ser

290 295 300

Lys Glu Arg Leu Ser Arg Leu Ile Glu Phe Asn Ala Ile His Ser Ala

305 310 315 320

Gln Asn Val Cys Arg Ser Thr Ile Val Gln Asn Ala Trp His Arg Gly

325 330 335

Gln Lys Leu Thr Val His Ala Trp Val Tyr Asp Leu Glu Asn Gly Leu

340 345 350

Val Lys Arg Leu Glu Phe Ser His Lys Asp Pro Ala Lys Leu Pro Ser

355 360 365

Ile Tyr Ala Cys Gln Pro Leu

370 375

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 24

ttttgttatt taattgtatt aattg 25

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 25

tcattttaat tacgcatttt catttac 27

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 26

aattaaataa caaaaatgat gacccaagaa ctggatg 37

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核甘酸

<400> 27

gcgtaattaa aatgattata aaggttgaca agcataaata g 41

Claims

1.一种多肽，其中，

由序列号2表示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中，

与所述序列号2表示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列为：相对于序列号2表示的氨基酸序列，1个以上且10个以下的氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中，

具有碳酸酐酶活性。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的多肽，其中，

具有提高细胞的C4二羧酸生产能力的功能。

5.根据权利要求4所述的多肽，其中，

使细胞的C4二羧酸生产能力优选提高5％以上，更优选提高10％以上，进一步优选提高15％以上。

6.一种多核苷酸，其中，

编码权利要求1～5中任一项所述的多肽。

7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中，

由序列号1表示的核苷酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中，

与序列号1表示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列为：相对于序列号1表示的核苷酸序列，1个以上且30个以下的核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。

9.根据权利要求6～8中任一项所述的多核苷酸，其中，

所述多核苷酸为cDNA或化学合成DNA。

10.一种载体或DNA片段，其中，

含有权利要求6～9中任一项所述的多核苷酸。

11.根据权利要求10所述的载体或DNA片段，其中，

还含有与所述多核苷酸可操作地连结的控制区域。

12.一种转化细胞，其中，

含有外来的权利要求6～9中任一项所述的多核苷酸。

13.一种转化细胞，其中，

含有权利要求6～9中任一项所述的多核苷酸、或者权利要求10或11所述的载体或DNA片段。

14.一种转化细胞，其中，

权利要求6～9中任一项所述的多核苷酸的表达被强化。

15.根据权利要求12～14中任一项所述的转化细胞，其中，

所述细胞为微生物细胞。

16.根据权利要求15所述的转化细胞，其中，

所述微生物为丝状菌。

17.根据权利要求16所述的转化细胞，其中，

所述丝状菌为根霉属菌。

18.根据权利要求12～17中任一项所述的转化细胞，其中，

C4二羧酸生产能力提高。

19.根据权利要求18所述的转化细胞，其中，

所述C4二羧酸生产能力提高优选5％以上，更优选10％以上，进一步优选15％以上。

20.根据权利要求18或19所述的转化细胞，其中，

所述C4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸。

21.一种C4二羧酸的制造方法，其中，

包括将权利要求12～20中任一项所述的转化细胞进行培养。

22.根据权利要求21所述的制造方法，其中，

还包括从所述培养物中回收C4二羧酸。

23.根据权利要求21或22所述的制造方法，其中，

所述C4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸。

24.一种转化细胞的制造方法，其中，

包括将权利要求6～9中任一项所述的多核苷酸或权利要求10或11所述的载体或DNA片段导入至宿主细胞，或者强化权利要求6～9中任一项所述的多核苷酸的表达。

25.一种宿主细胞中的C4二羧酸生产能力的提高方法，其中，

26.根据权利要求25所述的方法，其中，

宿主细胞中的C4二羧酸生产能力提高优选5％以上，更优选10％以上，进一步优选15％以上。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中，

所述C4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸。