CN111471698A - 马铃薯StDeSI-2基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供马铃薯StDeSI‑2基因及其应用。StDeSI‑2能提高马铃薯晚疫病抗性，在植物中超量表达该基因后能显著减小病斑面积，而沉默该基因后病斑面积显著增大。本发明还提供了鉴定出Avr8为晚疫病菌的毒力效应蛋白，在晚疫病菌中沉默或敲除该基因，或在植物中采用一些技术达到相同效果都可以降低晚疫病菌的侵染能力，为制定新的晚疫病抗性育种策略提供了依据。提供了晚疫病抗性调控基因的研究方法，从晚疫病菌效应蛋白为切入点，通过酵母双杂筛选钓取其互作蛋白，再通过酵母双杂点对点实验、萤火素酶互补实验和免疫共沉淀对候选互作蛋白加以验证，然后可通过病毒诱导基因沉默(VIGS)技术和农杆菌介导瞬时表达技术结合晚疫病菌离体叶片接种技术对其进行抗病功能验证。

Description

马铃薯StDeSI-2基因及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及马铃薯StDeSI-2基因及其在抗马铃薯晚疫病中的应用。
背景技术
马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界上第四大重要粮食作物且粮菜兼用，不仅能够提供人体所需的碳水化合物，还富含大量的营养元素，如膳食纤维、维生素C、钾元素、类胡萝卜素、花青素、各种氨基酸以及矿物质元素(Burlingame et al 2009)。而由Phytophthora infestans所引起的晚疫病是马铃薯生产中最具毁灭性的病害，严重影响了马铃薯的产量与品质。18世纪40年代，晚疫病引起了轰动全世界的“爱尔兰大饥荒”，这场饥荒导致近100万人死亡，另100万余人背井离乡移居海外(Bourke 1991)。
为了减少晚疫病对马铃薯生产带来的影响，农业上采取了许多防治技术，如使用脱毒种薯，加强栽培管理，建立晚疫病预警系统，及时清除中心病株等等。这些措施虽然能在一定程度上减轻晚疫病的危害，但往往费时费力并且效果有限，实践证明选育晚疫病抗性品种是最经济有效的策略。
一直以来，马铃薯晚疫病的抗性育种使用的都是专化型的抗病(R)基因。R蛋白都含有NB-LRR结构域，能识别晚疫病菌分泌到植物细胞内的无毒(Avr)蛋白，进而产生对某一生理小种的专化抗性。因此，R蛋白介导的抗性依赖于对Avr蛋白的识别反应，这种抗病反应最终导致植物细胞坏死，限制病原菌的扩展。十多年来，在马铃薯中已克隆了20多个R基因(Du and Vleeshouwers 2017)，其中有些R基因已在育种上应用，但大多数R基因的抗性均不持久(Vleeshouwers et al 2011)。近期克隆的R8基因来自于马铃薯晚疫病菌鉴别寄主MaR8，通过转基因鉴定证实其具有田间广谱抗性(Vossen et al 2016)。本实验室经过十多年的系统研究，进一步证实了R8控制一个对晚疫病具有广谱持久抗性的主效QTL位点dPI09c(Jiang et al 2018)。利用来自南美、欧洲和中国具有代表性的晚疫病菌接种研究表明，含有dPI09c位点的马铃薯对不同来源的病原菌均具有相似水平的抗性，而且在南美晚疫病流行区域的田间抗性近10年的评价中一直稳定(Jiang et al 2018；Vossen et al2016)。研究还表明，R8基因在不同的马铃薯抗病材料中都高度保守，仅有个别碱基的差别，其无毒基因Avr8亦十分保守，在能克服和不能克服R8的晚疫病小种中Avr8的DNA序列完全一致(Jiang et al 2018)，这可能是R8基因能维持广谱持久抗性的一种机制。
马铃薯晚疫病菌的基因组大，可塑性高，进化速度快，因此容易产生克服R基因的新小种(Dong et al 2014；Fry 2008；Haas et al 2009；Raffaele et al 2010)。前人研究发现，晚疫病菌通过多种方法改变自身与R基因识别的无毒基因来逃逸宿主的识别。含有R2的马铃薯品种在欧洲广泛种植，但其抗性早已丧失。研究显示，无毒菌株中的Avr2能广泛与茄科中R2以及R2的同源蛋白识别，而毒性菌株中Avr2-like有13个氨基酸突变，使其不能与R2识别(Gilroy et al 2011)。不仅Avr2-like采取氨基酸突变的方式逃逸识别，与R3a识别的Avr3a也采取了类似的方式。毒性菌株通过将Avr3a氨基酸序列中的KI突变为EM来逃逸R3a的识别而致病(Armstrong et al 2005)。Avr4则直接采取短截的形式使其不能完整翻译从而丧失功能来逃逸R4的识别(van Poppel et al 2008)。Avr8在晚疫病菌中的序列保守性暗示它对晚疫病菌的生存或生活能力起着重要作用，可以帮助晚疫病菌侵染马铃薯，因此其在马铃薯中靶标蛋白可能对晚疫病抗性具有重要作用。本研究验证了Avr8的毒力作用，并用它作为诱饵通过酵母双杂交和其它蛋白互作技术筛选鉴定到一个马铃薯中的靶标蛋白StDeSI-2(DeSUMOylating isopeptidase，去SUMO(small ubiquitin-relatedmodifiers,小泛素样修饰蛋白)化异肽酶，其功能是将SUMO从其靶蛋白上去除。
SUMO作为泛素相关类似物(ubiquitin-like modifiers,UBLs)的重要成员之一，氨基酸序列与泛素有接近18％的同源性(Kurepa et al 2003)，执行多种与泛素相似的生物学功能，对通过蛋白质的修饰调节多种细胞过程至关重要，例如转录、细胞内运输、DNA修复、复制和细胞信号传导(Gill 2004)。SUMO对蛋白质的共价修饰是可逆的，通过水解SUMO与底物结合的异肽键，将SUMO从其靶蛋白去除即去SUMO化。目前已在人类中鉴定出近100种去SUMO化酶(deSUMOylase)，大多数是由一组半胱氨酸蛋白酶，又称泛素样蛋白加工酶(ubiquitinlike-protein-progressing enzymes，Ulps)或SUMO特异性蛋白酶(sentrin-specific protease，SENPs)家族所介导。而在哺乳动物中报道了区别于这二者新型的deSUMOylase，将其命名为DeSI(Shin et al 2012)。deSUMOylase在维持SUMO信号传导的平衡中起关键作用，参与了激素信号传导、植物防御、非生物胁迫、核转运、酶活性、细胞周期进程和植物发育等各种细胞过程(Isono and Nagel 2014)。DeSI主要含有DeSI-1和DeSI-2两类，尽管他们与ULP/SENP酶缺乏明显的序列相似性，它们还是半胱氨酸蛋白酶并且都具有典型PPPDE结构域和催化活性位点，小鼠中DeSI-1和DeSI-2在氨基酸水平上具有23％的同源性(Shin et al 2012)。本研究中发现的StDeSI-2即为DeSI-2类。目前DeSI类deSUMOylase在植物免疫中的报道还非常少，仅有的一例报道是近期在拟南芥中发现DESI3a可以使FLS2去SUMO化导致BIK1从PRR复合体中解离受阻从而抑制植物下游的转录反应，DESI3a是由人类DeSI-1的保守催化域在拟南芥的蛋白组数据库中比对得到的(Orosaet al 2018)。
现有技术存在的问题：目前还未见有关DeSI-2在植物免疫中的报道。
发明内容
本发明要解决的关键技术问题在于提供StDeSI-2通过参与Avr8与R8互作正调控马铃薯晚疫病抗性的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一、StDeSI-2全长CDS序列如序列表SEQ ID NO：1所示；Avr8全长CDS序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
二、Avr8和StDeSI-2基因克隆和载体构建方法，包括：1.使用Gateway方法构建带有GFP标签的StDeSI-2和Avr8载体。2.同源重组法构建带有cMyc标签的StDeSI-2和Avr8载体。
三、Avr8能促进晚疫病菌侵染植物的应用。该应用能够用于构建晚疫病模型，用于实验研究和制定新的晚疫病抗性育种策略。
四、StDeSI-2在与Avr8蛋白互作中的应用。该应用能够用于解释马铃薯晚疫病的抗病机理，用于实验研究解释StDeSI-2与Avr8基因功能。
五、StDeSI-2与Avr8蛋白互作的验证方法。包括：1.酵母文库构建；2.诱饵载体构建；3.文库筛选；4.互作验证，酵母双杂点对点互作验证、免疫共沉淀互作验证、荧火素酶互补互作验证。
六、StDeSI-2正调控(提高)马铃薯晚疫病抗性的应用。该应用能够用于马铃薯晚疫病抗性育种，培育抗晚疫病马铃薯品种。
七、StDeSI-2正调控(提高)马铃薯晚疫病抗性的验证方法。分别利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术和农杆菌介导瞬时表达技术结合晚疫病菌离体叶片接种技术对StDeSI-2进行了功能验证。包括：1.VIGS载体构建；2.病毒诱导基因沉默(VIGS)；3.植物RNA的提取和实时定量RT-PCR；4.晚疫病抗性鉴定。
八、StDeSI-2在参与Avr8与R8识别反应的应用。该应用能够用于解析马铃薯晚疫病抗性机制，用于进一步的实验研究。
九、StDeSI-2与Avr8蛋白共定位于细胞质中的应用。今后可参考该定位结果辅助鉴定更多晚疫病抗性基因。
附图说明
图1为Avr8促进晚疫病菌侵染本氏烟；
图2为StDeSI-2与Avr8互作验证；
图3为StDeSI-2与Avr8共定位于细胞质中；
图4为NbDeSI-2与StDeSI-2的CDS序列比对；
图5为StDeSI-2正调控晚疫病抗性；
图6为NbDeSI-2沉默后延迟Avr8与R8的识别反应。
具体实施方法
本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供了StDeSI-2、Avr8基因序列，包括：
(1)StDeSI-2全长CDS序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
(2)Avr8全长CDS序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
实施例2
本实施例提供Avr8和StDeSI-2基因克隆和载体构建方法，包括：
(1)使用Gateway方法构建带有GFP标签的StDeSI-2和Avr8载体。
根据StDeSI-2和去掉信号肽序列的Avr8两者的CDS序列设计接头上下游引物，在前引物和后引物上分别加上接头序列attB1和attB2的部分序列生成引物序列attB1-Avr8_F/R、attB1-StDeSI-2_F/R(表1)。以此引物进行第一轮PCR扩增，扩增使用PhantaDNA聚合酶，扩增程序及体系见表2和表3，第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，体系及程序同表2及表3。扩增产物利用胶回收试剂盒(北京庄盟)进行回收，回收后的PCR产物根据BP反应体系要求(表4)，置于PCR仪中25℃恒温放置4h进行BP反应，取出后加入0.5μl重组克隆增强试剂，37℃反应10min。反应完成后直接加入DH5α感受态中进行热激转化，随后挑取单克隆转化子进行PCR验证，送阳性克隆测序。得到阳性克隆后提取质粒按照表5的要求进行LR反应，步骤同BP反应。最终测序得到的阳性克隆即为构建成功的载体菌株。BP反应和LR反应中使用的重组酶均购于
Figure BDA0002440381840000055
公司。
表1载体构建引物
Figure BDA0002440381840000051
表2 PCR标记扩增程序
Figure BDA0002440381840000052
表3 Phanta DNA聚合酶扩增体系
Figure BDA0002440381840000053
表4 BP反应体系
Figure BDA0002440381840000054
表5 LR反应体系
Figure BDA0002440381840000061
(2)同源重组法构建带有cMyc标签的StDeSI-2和Avr8载体。
利用ClonExpressTM II One Step Cloning Kit(南京诺唯赞)进行大片段克隆。根据StDeSI-2和Avr8序列设计引物，在引物两端添加上载体酶切位点序列，然后在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列。首先，利用Phanta DNA聚合酶进行PCR扩增(表2及表3)，回收扩增产物。然后，将目标载体进行酶切(表6)，37℃反应5h，再置于65℃反应10min失活内切酶。最后，按照表7的体系进行同源重组，37℃反应30min，反应完成后立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。之后，反应产物直接进行大肠杆菌DH5α热激转化，随后挑取转化子进行PCR验证，送阳性克隆测序。测序阳性克隆的质粒随后电击转入农杆菌GV3101感受态中备用。
表6质粒酶切体系
Figure BDA0002440381840000062
表7 Ligation-free反应体系
Figure BDA0002440381840000063
a)重组反应体系中最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，最适克隆载体使用量为0.03pmol，插入片段使用量为0.06pmol。
实施例3
本实施例提供了Avr8能促进晚疫病菌侵染植物的应用，包括：
构建带有cMyc标签的Avr8基因的超量表达载体，利用农杆菌介导的瞬时转化体系(Du et al 2014)将携带cMyc-Avr8的农杆菌GV3101注射到周龄约为4w的本氏烟叶片上，24h后选取晚疫病菌小种88069(van West et al 1998)(也可以采用实验室保存的菌种)进行离体叶片接种鉴定，发病第5天测量病斑面积。
如图1所示，图1(A)在本氏烟叶中脉两端通过农杆菌瞬时表达体系分别瞬时超量表达阴性对照GUS(左)和Avr8(右)，24h后接种晚疫病菌，5d后在紫外灯下观察到的代表图片；图1(B)经Western-blot检测发现GUS和Avr8蛋白均完整表达且大小符合预期；图1(C)瞬时超量表达Avr8后晚疫病的病斑面积显著大于对照；图1(D)发病统计结果显示二者侵染效率基本一致，都大于95％。统计结果来自三次生物学重复，每次接种数目为30，统计学分析采用单因素多重比较法，误差线代表的是标准误(n＝3)。以上数据表明，效应子Avr8能显著促进晚疫病菌对本氏烟的侵染。
实施例4
本实施例提供了StDeSI-2与Avr8蛋白互作的应用，包括：
1.酵母文库构建
拟用于酵母双杂实验的文库由英国James Hutton研究所的Paul Birch教授惠赠，酵母双杂文库为马铃薯栽培种Désirée叶片经晚疫病菌分别诱导12h和72h的混样，通过Invitrogen系统构建。
2.诱饵载体构建
本实验构建AD-Prey质粒的骨架选用pDEST22，构建BD-Bait质粒的骨架选用pDEST32。采用Gateway两步法构建pDEST32-Avr8载体，具体方法见实施例2中图表。
3.文库筛选
利用pDEST32-Avr8载体去钓酵母文库中的互作蛋白，将阳性的酵母克隆提取质粒并测序，总共筛选了三次，经序列比对发现三次筛选结果中有一个共同的阳性克隆。进一步在NCBI网站上检索其序列，发现其与DeSI-2基因同源，因此将该基因命名为StDeSI-2。
4.互作验证
进一步对Avr8和StDeSI-2用酵母双杂点对点验证、免疫共沉淀和荧火素酶互补实验进行了互作验证。
4.1酵母双杂点对点互作验证步骤
(1)构建pDEST32-Avr8、pDEST32-ED(effctor domain，Avr8核心效应子结构域)、pDEST32-Avr2与pDEST22-StDeSI-2的重组质粒，将pDEST22-Avr8、pDEST22-ED分别与pDEST22-StDeSI-2共转化转化到相应酵母菌株，在二缺平板上涂皿。
(2)在灭菌的PCR板中加入150μl的无菌ddH2O备用。
(3)在转化成功的二缺平板和强互作(++)、弱互作(+)、不互作(-)对照二缺平板上分别挑取3个单克隆菌落，溶解混匀于上述加了150μl的无菌ddH2O的PCR板中。
(4)用排枪吸取5μl上述菌液点在三缺平板上，置于30℃培养箱中培养。
(5)用排枪吸取5μl上述菌液点在YPDA平板上，待菌液吹干后贴上一块大小适中的Whatman酵母专用膜，置于30℃培养2-3d。
(6)3-4d时观察三缺平板上菌落的生长情况，如果待检测的基因的菌落生长状况良好，则很可能互作。
(7)2-3d左右时取出YPDA的平板，准备做X-gal显蓝验证。
(8)配制显蓝检测的溶液，10ml显蓝溶液配制方法：在通风橱中称取12.5mgX-gal，溶解于100μl的DMF中，然后再加入60μl的β-巯基乙醇，最后用配好的Z-buffer定容到10ml。
(9)在一个干净的12cm的平板中放入2块大小适中的干净滤纸，然后用配好的显蓝溶液浸泡充分，尽量赶走气泡和保持滤纸的平坦，备用。
(10)把上述酵母生长良好的YPDA平板中贴的Whatman的酵母专用膜用镊子小心的取下，放入液氮中30s。
(11)取出膜后立即小心的贴在上述用显蓝液浸泡过的滤纸上(应保持粘有酵母菌落的面朝上)。
(12)然后用封口膜封好平板后平坦的置于37℃培养箱中，每过一段时间观察显蓝的情况。如果共转入待检测蛋白后的酵母生长圆斑与强互作或者弱互作对照酵母生长圆斑相比呈现明显的蓝色，说明待检测的蛋白两者互作；若圆斑未呈现明显的蓝色，说明待检测的蛋白两者不互作。
4.2免疫共沉淀步骤：
(1)将携带候选基因的农杆菌如实施例3所述准备好后，瞬时注射与于4-5w苗龄本氏烟叶片。2d后用1cm直径的打孔器打孔取样，四个不同叶片的叶盘取为一个样，一个样品取两份，一份用于蛋白表达的检测，一份用于免疫共沉淀实验。
(2)样品取完立即用液氮速冻，保存于-70℃或立即提取蛋白。利用样品研磨机将样品磨成粉末，加入400μl的蛋白提取液(10％甘油、25mMTris-HClpH7.5、150mMNaCl、10mMDTT、0.15％NonidetP40、1mMPMSF、蛋白酶抑制剂和1mMEDTA)置于冰上，样品完全溶解后利用振荡器将提取液与植物组织完全混匀，冰上孵育0.5h，震动混匀3次。
(3)孵育好的样品用提前预冷好的离心机4℃、13000rpm离心10min。取40μl的上清液加40μl2×SDSloadingbuffer(100mMTris-HCLpH＝6.8、0.2％Bromophenol、20％glycerol、4％SDS)，95℃变性10min后用于Western-blots(Inputs)检测蛋白的表达水平。
(4)剩余的样品上清液与20μl的GFPTrapbeads在4℃垂直旋转仪上孵育2h，孵育好的样品放在磁力架上静止1min后，将上清液吸出后加入500μl的washingbuffer(10％甘油、25mMTRIS-HClpH7.5、150mMNaCl、10mMDTT、0.15％NonidetP40、1mMPMSF、蛋白酶抑制剂和1mMEDTA)洗三次。
(5)洗好的GFPbeads加入50μl2×SDSsampleloadingbuffer后，95℃变性10min。
(6)蛋白样品用12％聚丙烯酰胺凝胶分离后，30V通过半干湿转膜仪(Bio-Rad，Hercules，CA)转到PVDF膜上。
(7)用4％脱脂奶粉(4％脱脂奶粉溶于0.1％Tween的1×PBS)在室温封闭PVDF1h后，按1：2000的比例在4％脱脂奶粉加入GFP或cMyc抗体(MBL，Nagoya，Japan)4℃孵育过夜。
(8)1×PBST(0.1％Tween的1×PBS)清洗PVDF膜4-5次10min后，按1：5000加入二抗antimouseIgGHRP(MBL，Nagoya，Japan)室温孵育1h。
(9)将用1×PBST清洗4-5次10min的PVDF膜用于显影定影。
4.3荧火素酶互补实验步骤：
(1)构建重组载体
分别将Avr8和StDeSI-2基因构建到含有luciferaseN端(JW771)和C端(JW772)的载体上。确保目标蛋白序列与luciferase的N端或C端在同一读码框中，不会发生移码。通过测序确定重组载体正确后，将重组载体转化到农杆菌GV3101中。
(2)农杆菌的注射
具体方法见实施例3。
(3)实验结果观测
预先向活体成像仪中灌注液氮，让CCD降温至-120℃(该过程大约1h)。在叶片上涂抹luciferin底物液，并将叶片置于活体成像仪中，采集信号。温度达到-120℃时将样品放入暗箱内，关闭暗箱，对于植物样品暗处理5min(排除植物自身荧光影响)，设定CCD参数拍照。
如图2所示，图2(A)酵母双杂点对点实验证明Avr8蛋白核心效应子区域(ED)和StDeSI-2互作。如图显示的结果从左至右依次为二缺平板、三缺平板菌落生长状况和X-gal显蓝结果。其中“-”、“+”、“++”依次表示不互作，弱互作以及强互作对照，pDEST32-Avr2与pDEST22-StDeSI-2共转化菌株为负对照。二缺平板四组酵母菌落长势良好，而pDEST32-ED与pDEST22-StDeSI-2共转化后酵母菌株只能在三缺平板生长且X-gal显蓝。图2(B)荧火素酶互补实验证明Avr8和StDeSI-2互作。图中所示为注射农杆菌48h后利用植物活体成像仪采集的烟草叶片发光信号，JW771-Avr8与JW772-StDeSI-2、JW771-ED与JW772-StDeSI-2均能显示很强的荧光信号，而负对照JW771-EV+JW772-EV无信号。图2(C)免疫共沉淀(CO-IP)实验证明Avr8和StDeSI-2互作。cMyc-GUS为阴性对照，GFP磁珠富集蛋白后用Myc抗体检测，只能杂到cMyc-StDeSI-2的条带，而cMyc-GUS无带。Input代表富集前的蛋白表达，CO-IP代表磁珠富集之后的蛋白检测，“+”表示注射过相对应农杆菌。所有结果都证明了这两个蛋白能发生互作，且StDeSI-2为Avr8的直接互作靶标。
为了进一步明确StDeSI-2的定位信息，将GFP标签通过Gateway的方法融合到StDeSI-2的N端。利用农杆菌介导的瞬时转化体系(见实施例3)将携带StDeSI-2-GFP农杆菌GV3101注射到周龄约为4w的本氏烟叶片上，两天后使用激光共聚焦显微镜进行观察。
如图3所示，图3(A)在本氏烟叶上瞬时注射携带有StDeSI-2-GFP质粒的农杆菌，2d后进行亚细胞定位观察，结果显示StDeSI-2主要定位于细胞质中。图3(B)经Western-blot检测发现实验过程中Avr8和StDeSI-2蛋白均完整表达且大小符合预期。图3(C)在本氏烟叶上共注射携带有StDeSI-2-RFP和Avr8-GFP质粒的农杆菌，2d后进行亚细胞定位观察，结果显示二者均定位于细胞质中。
实施例5
本实施例提供了StDeSI-2正调控(提高)马铃薯晚疫病抗性的应用，包括：
分别利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术和农杆菌介导瞬时表达技术结合晚疫病菌离体叶片接种技术对StDeSI-2进行了功能验证。
1.VIGS载体构建
NbDeSI-2与StDeSI-2的CDS序列的同源性为90％(图4)，选取NbDeSI-2中304bp构建到TRV2载体中并转化农杆菌GV3101。图4中灰色部分表示NbDeSI-2与StDeSI-2一致的序列，红点表示构建VIGS载体的序列。
2.病毒诱导基因沉默(VIGS)
将携带TRV1、TRV2-NbDeSI-2和TRV2-GFP的农杆菌培养于YEB液体培养基中(1L液体YEB：5g Peptone、1g Yeast Extract、5g Beef Extract、0.493g MgSO4·7H2O)，28℃摇床220rpm培养16h后，4000rpm室温离心10min。用2ml的MES buffer(10mM MES,10mM MgCl2)悬浮菌体后测量OD600，最后按照每个载体终浓度均为OD600＝0.4将TRV1与目标载体混合后定容到2ml，按1：500的比例加入100mM乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)后，黑暗放置1-2h后用于注射四叶龄的本氏烟叶。
3.植物RNA的提取和实时定量RT-PCR
用1cm直径的打孔器在处理后的本氏烟片打孔取样，取四个不同注射叶片的叶盘于同一个2ml的离心管中。样品速冻在液氮中，磨样机将其磨成粉末后，利用EASYspin植物RNA提取试剂盒提取RNA(Aidlab)。提取的RNA通过Nanodrop1000(Thermo Scientific)测浓度和纯度后，取2μg反转录。反转录试剂为HiscriptReverseTranscriptase(Vazyme)、oligodT primers(Vazyme)，反转录的cDNA用无菌水稀释20倍后用于quantitativeRealtime PCR(qRT-PCR)，程序为95℃15min，95℃15s，59℃30s，72℃30s，40个循环。定量体系为6.25μl SYBR green supermix、1μl基因前引物(primerF:AATCTTTCATAGTGCCGTTCA)和基因后引物(primerR：CTCTGTTCCATGCTGCT)和3.25μl无菌水，总体系12.5μl。
4.晚疫病抗性鉴定
待VIGS后3w左右时，取NbDeSI-2沉默后的本氏烟新生叶片，使用晚疫病菌生理小种88069进行离体叶片接种，5d后测量病斑面积统计发病状况。同时，采用农杆菌介导的瞬时转化体系在生长4w左右的本氏烟叶上瞬时超量表达cMyc-StDeSI-2，24h后取下叶片后采取上述相同方法进行晚疫病抗性鉴定。
如图5所示，图5(A)为本氏烟VIGS 3w后的植株表型。环境对照PDS沉默后植株变得矮小新生叶变白，NbDeSI-2沉默后植株生长正常，和阴性对照GFP相比无明显差异。图5(B)qRT-PCR检测结果显示NbDeSI-2沉默效率大约在75％。图5(C)取下NbDeSI-2基因沉默后的本氏烟叶上离体接种晚疫病菌生理小种88069，图片为接种5d后紫外灯下观察到的典型的病斑表型；图5(D)统计结果显示NbDeSI-2基因沉默后病斑面积显著大于对照。图5(E)在本氏烟叶上瞬时超量表达携StDeSI-2-cMyc的农杆菌24h后，取下叶片离体接种晚疫病菌生理小种880695d后紫外灯下的表型，Western-blot检测结果显示StDeSI-2蛋白正常表达且大小符合预期；图5(F)统计结果显示StDeSI-2基因超量表达后病斑面积显著小于对照。统计结果均来自三次生物学重复，每次接种数目为30，统计学分析采用单因素多重比较法，误差线代表的是标准误(n＝3)。以上两种晚疫病抗性鉴定结果均表明StDeSI-2正调控(提高)晚疫病抗性。
实施例6
本实施例提供了StDeSI-2参与Avr8与R8识别反应的应用，包括：
为了研究StDeSI-2参与晚疫病抗性的机制，在实施例5中通过VIGS诱导NbDeSI-2沉默后的本氏烟叶上，使用农杆菌介导的瞬时转化方法(见实施例3)，在新生叶上分别表达INF1以及Avr8与R8来诱导PTI和ETI反应。INF1为晚疫病菌分泌的胞外效应蛋白，作为阳性对照。如图6所示，图6(A)在VIGS诱导NbDeSI-2沉默后的本氏烟新生叶上，使用农杆菌介导瞬时转化方法注射携带INF1的农杆菌，第3-5d后INF1诱导的细胞坏死率分别为75％、85％和100％，与阴性对照GFP无显著差异，照片为在紫外灯下观察到的INF1诱导的细胞坏死反应的典型表型。图6(B)显示共注射携带Avr8与R8的农杆菌第3-4d后，Avr8与R8诱导的细胞坏死率分别为13％和37％，显著低于阴性对照GFP的78％和92％，到第5天时两者才达到一致，均为100％，照片为在紫外灯下观察到的Avr8与R8诱导的细胞坏死反应的典型表型。统计结果来自三次生物学重复，每次注射至少15个点，统计学分析采用单因素多重比较法，误差线代表的是标准误(n＝3)。以上结果说明NbDeSI-2参与了R8与Avr8的识别反应，沉默后NbDeSI-2延迟了它们的识别。
有益效果：
本发明至少存在以下有益效果：
1.提供了晚疫病抗性调控基因的研究思路和方法。可以晚疫病菌效应蛋白为切入点，通过酵母双杂筛选钓取其互作蛋白，再通过酵母双杂点对点、萤火素酶互补实验和免疫共沉淀(CoIP)等蛋白互作实验方法对候选互作蛋白加以验证，然后可通过病毒诱导基因沉默(VIGS)技术和农杆菌介导瞬时表达技术结合晚疫病菌离体叶片接种技术对其进行抗病功能验证和机制解析。
2.鉴定出Avr8为晚疫病菌的毒力效应蛋白。在晚疫病菌中沉默或敲除该基因，或在植物中采用一些技术达到相同效果都可以降低晚疫病菌的侵染能力，这为制定新的晚疫病抗性育种策略提供了理论依据。
3.StDeSI-2能提高马铃薯晚疫病抗性。在植物中超量表达该基因后能显著减小病斑面积，而沉默该基因后病斑面积显著增大。
4.揭示StDeSI-2参与晚疫病抗性的机制。在植物中将该基因沉默后，AVR8和R8所介导的免疫坏死反应会延迟，因而影响了马铃薯对晚疫病的抗性。
5.证明了StDeSI-2与Avr8蛋白共定位于细胞质中。今后可参考该定位结果辅助鉴定更多晚疫病抗性基因。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
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Figure BDA0002440381840000161
<110> 华中农业大学
<120> 马铃薯StDeSI-2基因及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 714
<212> DNA
<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）
<400> 1
1 atgacggagg tggtcctcca catatatgat gtgacgaata gtggctccga taagaccaac
61 aacaccattg ttcagatcaa caagtttttc aaagacggta tcggtcttgg tggaatcttt
121 catagtgccg ttcaggttta tggagatgat gagtggtcat tcgggttctg tgaacaaggt
181 actggagttt ttagctgtcc tgctgggaaa aatccaatgt attcgtaccg tgaatgcatt
241 gtacttggaa acacaaacca ctctattttc aaagtgaacg agatattgag agagcttagt
301 agagagtggc ctggacactc atatgactta ttgtcaaaga attgcaatca cttttgtgat
361 gaattttgtg aaagacttgg tgttcaaaag cttcctggct gggttaacag gtttgctcat
421 gctggtgatg ctgccgttga gatagcagga actactgctt ttaggctgag gcaagctaaa
481 acagagatcg ttacagctag taaagtggca tataggttct tcgcaggagt tgcttctaac
541 aattcagctt cccccgactc tcctggcaac tctggtcggg gaactcctag gtttcaagca
601 aattggttta aaaatttcat caccactggt gcgaaaccat ctggttcaga tagtgaagag
661 gtgctaggac agcagcagca gcatggaaca gagacccctt tgaggcagaa ctag
<210> 2
<211> 735
<212> DNA
<213> 晚疫病菌（Phytophthora infestans）
<400> 2
1 atgcgctcaa tccaacttct gatcatcgcg ctggttgcgt tcctcgcctg ttgtagtgca
61 acaccagcac cgccacaagt atccctctcg ttccttccag tccagagacg gtcactgcgc
121 actgacacaa ctcttgacag tgaagacaac aacgaagact cgggggagag aagcgtctgg
181 aaacatgtca aagtgaggtg gtggttagag accgaaaagt ctgacgactt tgtccggaag
241 gcgctcaaac taaacggact tgacgataca gctatgaagg cccacaagaa ctacaaatat
301 tatgcctatt ttgccaaaaa ggctgaagac tatcttttca acaagtggct acggaatcat
361 gtacccacat ttgaagcctg gaagagtctc aacctgggca aaatcaccaa ggctgaccag
421 ctgaaggaga tagcaaacac taagaacttc attagctaca gtcgcttcgt gaagcagtat
481 gacgacaacg tagtttcgac gctgaacgcc gggtataacc cccctgttgt ggcggttgct
541 aggggtgcct cagaagctga gataacagcg cgaacgatga tcatggctag tgcacgtagg
601 gacgacgatg tcgccaaagt gttgttgggc ttgactaaac cgggctatcc gcggcgagtg
661 ctagacggca atgcgctcac gcagcatgat gagtacaagt actatcagct ttttaaagaa
721 gcgaaaacat cgtaa

Claims (10)

1.马铃薯StDeSI-2基因，其特征在于，所述StDeSI-2的CDS序列如SEQ ID NO：1所示。
2.StDeSI-2提高马铃薯晚疫病抗性的应用，其特征在于，所述StDeSI-2的CDS序列如SEQ ID NO：1所示。
3.Avr8基因，其特征在于，所述Avr8的CDS序列如SEQ ID NO：2所示。
4.Avr8和StDeSI-2基因克隆和载体构建方法，其特征在于，该方法包括：(1)使用Gateway方法构建带有GFP标签的StDeSI-2和Avr8载体；(2)同源重组法构建带有cMyc标签的StDeSI-2和Avr8载体。
5.Avr8能促进晚疫病菌侵染植物的应用，其特征在于，该应用能够用于构建晚疫病模型，用于制定新的晚疫病抗性育种策略。
6.StDeSI-2在与Avr8蛋白互作中的应用，其特征在于，该应用能够用于解释马铃薯晚疫病的抗病机理，用于实验研究解释StDeSI-2与Avr8基因功能。
7.StDeSI-2与Avr8蛋白互作的验证方法，其特征在于，包括：(1)酵母文库构建；(2)诱饵载体构建；(3)文库筛选；(4)互作验证，酵母双杂点对点互作验证、免疫共沉淀互作验证、荧火素酶互补互作验证。
8.StDeSI-2提高马铃薯晚疫病抗性的验证方法，其特征在于，分别利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术和农杆菌介导瞬时表达技术结合晚疫病菌离体叶片接种技术对StDeSI-2进行了功能验证，具体包括：(1)VIGS载体构建；(2)病毒诱导基因沉默；(3)植物RNA的提取和实时定量RT-PCR；(4)晚疫病抗性鉴定。
9.StDeSI-2在参与Avr8与R8识别反应的应用，其特征在于，该应用能够用于解析马铃薯晚疫病抗性机制。
10.StDeSI-2与Avr8蛋白共定位于细胞质中的应用，其特征在于，该应用为辅助鉴定更多晚疫病抗性基因提供参考。
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