CN110938637A - 疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因及其应用 - Google Patents

疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因及其应用,所述StMKK1基因在防治马铃薯晚疫病或植物免疫调控机制中的应用,所述StMKK1基因在本氏烟草和番茄测序基因组中的同源基因序列在本氏烟草和番茄抗病育种中的应用;本发明的StMKK1基因及其同源基因能促进晚疫病菌对植物的侵染,通过活性氧爆发试验,证明StMKK1负调控植物基础防御反应PTI反应,证明了StMKK1基因作为负调控因子在提高植物疫霉菌抗性上的用途,可用于抗疫霉菌品种的选育。

Description

疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因及其应用。
背景技术
卵菌是一类形态上与真菌类似的丝状真核微生物,但在进化上与硅藻和褐藻类的不等鞭毛类更相近。卵菌中包含许多毁灭性的植物病原菌,经常给粮食作物和森林植物造成毁灭性的病害,导致严重的经济损失与生态环境的破坏。最为典型的例子就是能引发19世纪爱尔兰大饥荒的晚疫病,晚疫病是马铃薯生产上的毁灭性病害,每年在中国造成的损失巨大,严重影响马铃薯生产,而马铃薯晚疫病的致病菌正是卵菌中的致病疫霉菌;
目前生产上对于马铃薯晚疫病的防治方法大部分还是采用药剂处理或者培育抗病品种。但是,伴随着病原菌抗药性的产生、植物与病原微生物协同进化、以及有效抗病资源有限、抗病品种培育难度较大等问题的出现,故从分子水平挖掘马铃薯的抗病基因,并解析它们的调控机制,进而培育广谱性抗病品种具有重要的理论与实践意义;
近些年抗病基因的挖掘和鉴定是培育抗病品种的核心,在植物与晚疫病菌互作过程中,晚疫病菌分泌了大量的小分子效应蛋白到植物细胞内,以调控寄主免疫反应。其中包括大量序列高度分化的RXLR效应蛋白,在病菌致病过程中起关键作用;
RXLR效应蛋白可进入寄主植物细胞内,通过修饰或干扰寄主的靶标分子而影响其正常的生理生化功能,从而促进病菌侵染定植。这其中包括病原菌分泌的效应蛋白通过靶向植物体内丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK信号通路成员),从而激活MAPK信号通路并启动下游抗感染相关基因的转录以调控植物免疫,通过对病原菌在寄主植物中的靶标进行缺失和突变,改变其生理生化过程从而抑制病原菌的侵染,使植物获得抗性,这种抗病性同样具有广谱性,但是,尽管目前已鉴定有植物的免疫负调控因子,但针对致病疫霉菌的抗病基因数量不多,而且具体的调控机制也并不清晰,免疫负调控因子在抗病育种中的应用仍然是非常少的,因此,本发明提出疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因及其应用,以解决现有技术中的不足之处。
发明内容
针对上述问题,本发明提出疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因及其应用,StMKK1基因能促进晚疫病菌对植物的侵染,通过活性氧爆发试验,证明StMKK1负调控植物基础防御反应PTI反应,证明了StMKK1基因作为负调控因子在提高植物疫霉菌抗性上的用途,可用于抗疫霉菌品种的选育。
本发明提出一种疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因,所述StMKK1基因在本氏烟草中的4个同源基因,分别为Niben101Scf10103g03014.1、Niben101SCF00611G07010.1、Niben101Scf02790g03012.1和Niben101Scf13387g00027.1;
所述StMKK1基因在马铃薯测序基因组中的1个同源基因的氨基酸序列如Solgenomics network:Sotub03g033030.1.1所示;
所述StMKK1基因在番茄测序基因组中的2个同源基因的氨基酸序列如Solgenomics network:Solyc12g009020.2和Solyc03g119490.3所示。
进一步改进在于:所述Niben101Scf10103g03014.1、Niben101SCF00611G07010.1、Niben101Scf02790g03012.1和Niben101Scf13387g00027.1的氨基酸序列如Sequence IDNiben101Scf10103g03014.1、Niben101SCF00611G07010.1、Niben101Scf02790g03012.1、Niben101Scf13387g00027.1所示。
进一步改进在于:所述Niben101Scf10103g03014.1、Niben101SCF00611G07010.1、Niben101Scf02790g03012.1和Niben101Scf13387g00027.1的基因编码氨基酸序列与所述StMKK1基因的氨基酸序列同源性大于50%,并与StMKK1基因有相似的生物学功能。
进一步改进在于:所述StMKK1基因在马铃薯测序基因组中的1个同源基因与所述StMKK1基因具有>80%的氨基酸序列相似度。
进一步改进在于:所述StMKK1基因在番茄测序基因组中的2个同源基因与所述StMKK1基因具有>80%的氨基酸序列相似度。
一种疫霉菌抗性负调控因子StMKK1在防治马铃薯晚疫病或植物免疫调控机制中的应用,所述StMKK1基因的核苷酸序列如Sol genomics network:Sotub12g010200.1.1所示,所述StMKK1基因的编码蛋白的氨基酸序列如Sol genomics network:Sotub12g010200.1.1所示。
一种疫霉菌抗性负调控因子StMKK1在本氏烟草和番茄测序基因组中的同源基因序列在本氏烟草和番茄抗病育种中的应用。
本发明的有益效果为:本发明的负调控因子StMKK1基因,首次作为茄科作物负调控植物抗疫霉菌的基因被克隆,通过农杆菌介导的瞬时表达体系在本氏烟草上瞬时过表达StMKK1基因,证明了StMKK1基因促进晚疫病菌对植物的侵染,通过病毒介导的基因沉默技术(VIGS)获得沉默本氏烟草同源基因的植物材料,并证明此材料增强了对晚疫病菌的抗性;通过活性氧爆发试验,证明StMKK1负调控植物基础防御反应PTI反应,证明了StMKK1基因作为负调控因子在提高植物疫霉菌抗性上的用途,可用于抗疫霉菌品种的选育。
附图说明
图1为本发明StMKK1负调控植物免疫结果示意图;
图2为本发明本氏烟草同源基因沉默后的植株生长表型与野生型对比结果示意图;
图3为本发明本氏烟草同源基因沉默植株增强了flg22诱导的结果示意图;
图4为本发明马铃薯StMKK1基因与本氏烟草4个同源基因的氨基酸序列的比对结果示意图;
图5为本发明StMKK1与马铃薯、番茄基因组中3个同源基因的氨基酸序列比对结果示意图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解,下面将结合实施例对本发明做进一步详述,本实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例一
本实施例提出马铃薯负调控因子StMKK1基因的克隆,包括以下步骤:
步骤一:获取植物材料,马铃薯青薯九号(可以通过公开渠道获得),从其叶片中提取RNA;
步骤二:RNA的抽提,用RNA提取试剂盒(OMGA,Lot#:R6827-01)抽提RNA,用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性,然后在分光光度计上测定RNA的纯度和浓度;
步骤三:基因克隆,用反转录试剂盒(TaKaRa,Lot#:AHE3187A)获得马铃薯青薯九号的cDNA,根据Sol genomics network:Sotub12g010200.1.1的全长编码序列设计上下游引物,以cDNA为模板进行扩增;PCR产物经酶切、连接、菌液PCR验证后构建成载体pART27-StMKK1,测序并与已公布序列进行比对,正确的质粒用于后续实验;
引物序列:StMKK1ECOR1F:
ccggaattcATGAAGAAAGGATCTTTTGCTCC
StMKK1Xba1R:gctctagaTAGCTCAGTAAGTGTTGCCAATG。
实施例二
根据图4、5所示,本实施例提出马铃薯StMKK1基因的序列信息与同源性分析,其中,马铃薯StMKK1基因全长CDS序列为1074bp,详细序列见Sol genomics network:Sotub12g010200.1.1,氨基酸序列共357个氨基酸,详细序列见Sol genomics network:Sotub12g010200.1.1;
具体步骤为:将马铃薯StMKK1的氨基酸序列用BLAST程序进行同源性检索,结果表明与本氏烟草中的4个基因Niben101Scf10103g03014.1、Niben101SCF00611G07010.1、Niben101Scf02790g03012.1、Niben101Scf13387g00027.1同源性很高,氨基酸序列的相似度在80%;同时在马铃薯中基因组的检索中也找到1个StMKK1的同源基因,在番茄测序基因组中的2个同源基因,其氨基酸序列的相似度在80%以上,推断7个同源基因具有和StMKK1相同的功能;
其中:马铃薯StMKK1基因与本氏烟草中4个同源基因的氨基酸序列的比对结果如图4所示;
马铃薯StMKK1基因编码蛋白的氨基酸序列与马铃薯、番茄测序基因组中3个同源基因的氨基酸序列的比对结果如图5所示。
实施例三:StMKK1烟草同源基因沉默植株的获得
根据图1、2、3所示,本实施例利用病毒介导的基因沉默技术降低目标基因的表达,具体实施如下:
步骤一:将沉默载体TRV2-NbMKK1转化入农杆菌感受态,并将转化成功的克隆挑至液体LB培养基中培养24-36小时;
步骤二:低转速收集菌体,用含有乙酰丁香酮的MES溶液重悬菌体,取部分菌液稀释后用分光光度计检测OD600的浓度;
步骤三:将菌液调整至合适浓度,与TRV1菌液1:1混合注射;
步骤四:选取4叶期的本氏烟草幼苗,注射第3叶位叶片,2-3周后可选取上部完全展平的叶片进行接菌实验。
图1中,(a)为StMKK1过表达促进晚疫病菌对植物的侵染;(b)为沉默本氏烟草同源基因抑制晚疫病菌对植物的侵染。
本发明的负调控因子StMKK1基因,首次作为茄科作物负调控植物抗疫霉菌的基因被克隆,通过农杆菌介导的瞬时表达体系在本氏烟草上瞬时过表达StMKK1基因,证明了StMKK1基因促进晚疫病菌对植物的侵染,通过病毒介导的基因沉默技术(VIGS)获得沉默本氏烟草同源基因的植物材料,并证明此材料增强了对晚疫病菌的抗性;通过活性氧爆发试验,证明StMKK1负调控植物基础防御反应PTI反应,证明了StMKK1基因作为负调控因子在提高植物疫霉菌抗性上的用途,可用于抗疫霉菌品种的选育。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Figure BDA0002289546060000081
Figure BDA0002289546060000091
Figure BDA0002289546060000101
Figure BDA0002289546060000111
Figure BDA0002289546060000121
Figure BDA0002289546060000131
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagaaag gatcttttgc tcctaatctt aaactttctc ttcctcctcc tgatgaagtt 60
gctctctcca aattcctgac tgaatcagga acatttaagg atggagatct tctggtgaat 120
agagatggag ttcgaattgt ttcgcagagt gaagttgcag ctccttcagt tatacagcca 180
tcagacaacc agttatgctt agctgatttt gaagcagtta aagttattgg aaagggaaat 240
ggtggtattg tgcggctggt tcagcataaa tggacagggc agtttttcgc tctcaaggtt 300
attcagatga atattgacga gtccatgcgc aaacatattg ctcaagaact gagaattaat 360
cagtcatccc agtgtccata tgttgtcata tgctatcaat cgttcttcga caatggtgct 420
atatccttaa ttttggagta tatggatggt ggttccttag cagattttct gaaaaaggtc 480
aaaacaatac ctgaacgata tcttgcaatt atctgcaaac aggttctcaa aggcttgtgg 540
tatcttcatc atgagaagca tattattcac agggatttga aaccttcgaa tttgctaatc 600
aatcacagag gtgatgtcaa aatcacagac tttggtgtga gtgcagtact agcaagcaca 660
tctggactgg ccaatacgtt tgtcggcaca tacaaccata tgtctccaga gagaatttca 720
ggaggtgcct atgattacaa aagcgacatt tggagcttgg gtttagtctt gctcgagtgt 780
gcaacaggtc atttcccata tacaccaccc gagggagatg aaggatgggt caatgtctat 840
gaacttatgg aaacaatagt tgaccaacca gaaccttgtg cacctcctga ccaattttct 900
ccacaattct gctcattcat atctgcatgt gtccagaaac accagaagga cagactgtcg 960
gcaaatgaac tcatgagtca ccctttcatc accatgtacg atgaccagga tatcgatctt 1020
ggattttact tcacttccgc aggacctcca ttggcaacac ttactgagct ataa 1074
<210> 2
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Lys Gly Ser Phe Ala Pro Asn Leu Lys Leu Ser Leu Pro Pro
1 5 10 15
Pro Asp Glu Val Ala Leu Ser Lys Phe Leu Thr Glu Ser Gly Thr Phe
20 25 30
Lys Asp Gly Asp Leu Leu Val Asn Arg Asp Gly Val Arg Ile Val Ser
35 40 45
Gln Ser Glu Val Ala Ala Pro Ser Val Ile Gln Pro Ser Asp Asn Gln
50 55 60
Leu Cys Leu Ala Asp Phe Glu Ala Val Lys Val Ile Gly Lys Gly Asn
65 70 75 80
Gly Gly Ile Val Arg Leu Val Gln His Lys Trp Thr Gly Gln Phe Phe
85 90 95
Ala Leu Lys Val Ile Gln Met Asn Ile Asp Glu Ser Met Arg Lys His
100 105 110
Ile Ala Gln Glu Leu Arg Ile Asn Gln Ser Ser Gln Cys Pro Tyr Val
115 120 125
Val Ile Cys Tyr Gln Ser Phe Phe Asp Asn Gly Ala Ile Ser Leu Ile
130 135 140
Leu Glu Tyr Met Asp Gly Gly Ser Leu Ala Asp Phe Leu Lys Lys Val
145 150 155 160
Lys Thr Ile Pro Glu Arg Tyr Leu Ala Ile Ile Cys Lys Gln Val Leu
165 170 175
Lys Gly Leu Trp Tyr Leu His His Glu Lys His Ile Ile His Arg Asp
180 185 190
Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ile Asn His Arg Gly Asp Val Lys Ile
195 200 205
Thr Asp Phe Gly Val Ser Ala Val Leu Ala Ser Thr Ser Gly Leu Ala
210 215 220
Asn Thr Phe Val Gly Thr Tyr Asn His Met Ser Pro Glu Arg Ile Ser
225 230 235 240
Gly Gly Ala Tyr Asp Tyr Lys Ser Asp Ile Trp Ser Leu Gly Leu Val
245 250 255
Leu Leu Glu Cys Ala Thr Gly His Phe Pro Tyr Thr Pro Pro Glu Gly
260 265 270
Asp Glu Gly Trp Val Asn Val Tyr Glu Leu Met Glu Thr Ile Val Asp
275 280 285
Gln Pro Glu Pro Cys Ala Pro Pro Asp Gln Phe Ser Pro Gln Phe Cys
290 295 300
Ser Phe Ile Ser Ala Cys Val Gln Lys His Gln Lys Asp Arg Leu Ser
305 310 315 320
Ala Asn Glu Leu Met Ser His Pro Phe Ile Thr Met Tyr Asp Asp Gln
325 330 335
Asp Ile Asp Leu Gly Phe Tyr Phe Thr Ser Ala Gly Pro Pro Leu Ala
340 345 350
Thr Leu Thr Glu Leu
355

Claims (7)

1.一种疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因,其特征在于:所述StMKK1基因在本氏烟草中的4个同源基因,分别为Niben101Scf10103g03014.1、Niben101SCF00611G07010.1、Niben101Scf02790g03012.1和Niben101Scf13387g00027.1;
所述StMKK1基因在马铃薯测序基因组中的1个同源基因的氨基酸序列如Sol genomicsnetwork:Sotub03g033030.1.1所示;
所述StMKK1基因在番茄测序基因组中的2个同源基因的氨基酸序列如Sol genomicsnetwork:Solyc12g009020.2和Solyc03g119490.3所示。
2.根据权利要求1所述的一种疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因,其特征在于:所述Niben101Scf10103g03014.1、Niben101SCF00611G07010.1、Niben101Scf02790g03012.1和Niben101Scf13387g00027.1的氨基酸序列如Sequence IDNiben101Scf10103g03014.1、Niben101SCF00611G07010.1、Niben101Scf02790g03012.1、Niben101Scf13387g00027.1所示。
3.根据权利要求2所述的一种疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因,其特征在于:所述Niben101Scf10103g03014.1、Niben101SCF00611G07010.1、Niben101Scf02790g03012.1和Niben101Scf13387g00027.1的基因编码氨基酸序列与所述StMKK1基因的氨基酸序列同源性大于50%,并与StMKK1基因有相似的生物学功能。
4.根据权利要求1所述的一种疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因,其特征在于:所述StMKK1基因在马铃薯测序基因组中的1个同源基因与所述StMKK1基因具有>80%的氨基酸序列相似度。
5.根据权利要求1所述的一种疫霉菌抗性负调控因子StMKK1的同源基因,其特征在于:所述StMKK1基因在番茄测序基因组中的2个同源基因与所述StMKK1基因具有>80%的氨基酸序列相似度。
6.一种疫霉菌抗性负调控因子StMKK1在防治马铃薯晚疫病或植物免疫调控机制中的应用,所述StMKK1基因的核苷酸序列如Sol genomics network:Sotub12g010200.1.1所示,所述StMKK1基因的编码蛋白的氨基酸序列如Sol genomics network:Sotub12g010200.1.1所示。
7.一种疫霉菌抗性负调控因子StMKK1在本氏烟草和番茄测序基因组中的同源基因序列在本氏烟草和番茄抗病育种中的应用。
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