KR20100043681A

KR20100043681A - 혈압저하능을 가진 펩타이드

Info

Publication number: KR20100043681A
Application number: KR1020080102804A
Authority: KR
Inventors: 공재열; 최영준; 하종명
Original assignee: 주식회사 연세
Priority date: 2008-10-20
Filing date: 2008-10-20
Publication date: 2010-04-29
Also published as: KR101106303B1

Abstract

본 발명은 효소처리를 통하여 굴로부터 제조한 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있는 펩타이드에 관한 것이다.

특히, 본 발명의 펩타이드는 안지오텐신 전환효소의 저해능이 우수하여 고혈압을 포함한 심혈관계 질환을 치료 또는 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 식품인 굴 유래의 것으로 안전성이 보장되고 부작용이 문제되지 아니하므로, 특히 기존의 화학적으로 제조된 심혈관계 질환에 대한 치료 또는 개선용 인공 물질을 대체할 수 있다는 점에서 관련 산업에 폭 넓게 이용될 수 있다.

안지오텐신 전환효소, 고혈압, 식품 유래 펩타이드

Description

혈압저하능을 가진 펩타이드{A ANTIHYPERTENSIVE PEPTIDE}

식품성분 중 식품 단백질 유래의 펩타이드는 항암, 혈압강하, 혈청 콜레스테롤 강하, 면역증강 및 칼슘 흡수 촉진 등의 광범위한 생리활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 구체적으로, 생체 내에서 진통, 마취, 장관 등 평활근의 수축, 식욕조절 등에 관여하는 물질인 opioid peptides, 면역증강작용을 하는 phagocytosis peptides, 혈압강화작용을 하는 안지오텐신 전환효소(angiotensin-I converting enzyme, ACE) 저해 펩타이드, 혈소판 응집을 저해하는 antithrombotic peptides 등에 속하는 펩타이드 등이 있다.

안지오텐신 전환효소는 혈관과 신장의 근위세뇨관, 내피, 심장, 폐, 활성화된 대식세포, 뇌조직 등에서 발견되는 dicarboxy peptides의 하나로, 포유류의 혈압 및 수분균형 조절기구인 renin-angiotensin system에서 renin에 의해 안지오텐시노겐(angiotensinogen)으로부터 활성화된 안지오텐신I을 안지오텐신Ⅱ로 전환시 킨다. 안지오텐신Ⅱ는 부신, 혈관평활근세포, 신장, 심장 등에 존재하는 4종의 AT 수용체(AT receptor)에 작용하며, 이들은 혈관수축, aldosterone과 vasopressin 방출, 세뇨관의 나트륨 흡수, 신장으로의 혈류량 감소 등을 유발함으로써 심혈관, 신장 및 중추신경 부위에 여러가지 병변을 가져올 수 있는 것으로 보고되고 있다.

따라서, 안지오텐신 전환효소의 저해물질 또는 안지오텐신 전환효소 저해제(ACE inhibitor)는 고혈압, 심장병, 동맥경화 또는 뇌출혈 등의 심혈관계 질환이나 신장병 등을 치료 또는 예방할 수 있는 것으로 보고 되고 있으며, 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 구체적으로, 만성신장병, 동맥경화, 심장발작과 그로 인한 사망 등을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하여 주는 여러 임상연구 및 임상실험의 결과가 보고되고 있다.

현재 이러한 결과에 기초하여, 라미프릴(ramipril), 캅토프릴(captopril), 에날라프릴(enarapil), 리시노프릴(lisinopril), 포시노프릴(fosinoril)이나 스피라프릴(spirapril) 등과 같은 화학적으로 합성된 많은 안지오텐신 전환효소 저해제가 고혈압 치료제로 사용되고 있다. 그러나 이러한 화합물들은 약학적 투여 형태에서 쉽게 분해되어 즉, 안정성이 떨어질 뿐만 아니라 다른 세포에도 작용하여 전신에 힘이 빠지거나, 구토, 기침, 두통, 식욕부진 및 미각이상을 일으키는 등 부작용과 관련된 문제가 있는 것으로 보고되고 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 부작용이 문제되지 아니하고 안전성이 확보되는 천연물질 유래 안지오텐신 전환효소 저해제의 개발이 시급히 요구되고 있다. 특히, 식품으로 사용되는 천연물질 유래의 안지오텐신 전환효소 저해제의 경 우, 식품 단백질 가수분해물 또는 식품 단백질 가수분해물로부터 수득한 것이 보고되고 있다.

이와 관련하여, 최근 연구보고에 의하면, 일반적으로 안지오텐신 전환효소 저해작용은 3,000 Da 이하의 저분자 펩타이드에서 높은 효과를 나타내는 것으로 확인되었고, 특히 식품 단백질로부터 유래한 안지오텐신 전환효소 저해능이 우수한 펩타이드는 그 분자량이 1,000 Da 이하인 것으로 확인되었다. 또한, 아미노산 잔기 수가 5개 이상인 펩타이드의 경우, 경구 투여 시 원형의 구조로 흡수되지 않고 장내 효소에 의해 가수분해를 겪을 수 있기 때문에 아미노산 잔기 수가 5개 미만일 것이 요구되는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 상기와 같은 조건을 모두 만족하는 식품 유래 안지오텐신 전환효소 저해제는 아직 보고되지 않고 있다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있고, 식품 유래로 부작용이 문제되지 않으며, 안전성이 확보되는 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있는 굴 유래 신규 펩타이드를 제공한다. 상기 펩타이드는 구체적으로 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 산부가염일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관질환 또는 고지혈증의 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드를 암호화(coding)하는 뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드를 암호화(coding)하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명자들은 식품 유래 안지오텐신 전환효소 저해제에 관하여 연구하던 중, 굴에 대하여 효소처리르 하여 수득된 본 발명의 펩타이드가 안지오텐신 전환효소 저해 효과가 매우 우수하다는 것을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있는 굴 유래 신규 펩타이드에 관한 것이다.

상기 안지오텐신 전환효소는 주로 폐모세혈관에 존재하고, 혈류에 있는 불활성상태의 안지오텐신 Ⅰ의 말단아미노산 2개를 분해함으로써 혈관 수축을 유도하고, 알도스테론(aldosterone) 분비를 항진시켜 체액을 증가시켜 혈압을 상승시킬 수 있는 안지오텐신 Ⅱ로 전환시켜, 최종적으로 혈압을 상승시키는 작용을 하는 효소이고, 상기 안지오텐신 전환효소 저해제는 상기 안지오텐신 전환효소를 저해하여 혈관 확장 효과를 나타낸다.

상기 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 산부가염일 수 있으며, 일 예로 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산부가염일 수 있다. 상기 펩타이드는 분리된(isolated) 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재하는 것일 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로부터 유도되는 물질일 수 있다.

상기 산 부가염이란 제약상 허용되는 산 부가염일 수 있고, 상기 제약상 허용되는 산 부가염이란 상기 펩타이드의 생물학적 활성을 유지하고 원하지 않는 독 소 효과 등의 부작용을 최소화하는 염을 의미한다.

상기 산부가염은 제약상 허용되는 무기산 부가염 또는 유기산 부가염일 수 있고, 일 예로 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 아세트산염, 벤조산염, 말레인산염, 푸말산염, 호박산염, 주석산염, 구연산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 톨루엔술폰산염, 아스파라긴산염 또는 글루타민산염 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화(coding)하는 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 분리된 뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터의 종류는 상기 벡터를 이용하여 형질전환을 수행할 대상 숙주(host)와 발현 조건에 따라서 변화될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드를 포함하고 있으면, 다른 조건은 제한되지 아니한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관질환 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다.

상기 심혈관 질환은 고혈압, 심장병, 뇌졸중, 혈전증, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상경화증 및 동맥경화로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으 며, 바람직하게는 고혈압일 수 있다.

상기 고혈압은 혈관관련 질병으로, 주로 동맥의 협압이 높은 동맥성 고혈압을 의미한다. 상기 고혈압은 동맥경화나 고혈압심장병(hypertensive heart disease) 등을 유발할 수 있다.

상기 동맥경화는 동맥의 벽이 두터워지고 동맥의 탄력이 저하되는 질환을 의미한다. 상기 동맥경화가 발병되면 경화된 동맥으로부터 혈액을 공급받던 장기에 대한 혈액 공급이 감소하게 되어, 추가적인 질병이 발병될 수 있다. 이와 관련된 대표적인 질병의 예는 심장의 근육에 혈액을 공급하는 심장동맥에 동맥경화의 변화가 오는 심장동맥병 등이 있다.

상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 및 에탄올에서 선택되는 약학적 희석제중 1종 이상 포함할 수 있으며, 희석제는 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 투여목적 및 질병에 따라 상이하게 적용될 수 있다. 실질적으로 투여되는 활성 성분의 양은 다양한 관련 요소, 즉 치료하고자 하는 질병, 환자상태의 정도, 다른 약제(예를 들어 주화성 약제)와 공동 투여여부, 환자의 나이 성별, 체중, 음식, 투여시간, 투여경로, 및 조성물의 투여비율(ratio)을 고려하여 결정하여야 한다. 상기 조성물은 투여량 및 투여경로가 질병의 형태 및 심각성에 따라 조절될 수 있으며, 하루에 한번 또는 1 내지 3번 나누어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 경 구이외의 투여경로, 즉 직장, 정맥, 복막 및 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구, 및 피하를 통한 약제 투여를 의미한다.

상기 조성물은 경구 투여 형태, 주입 가능한 용액 또는 국소제제와 같은 어떠한 형태로도 제제화될 수 있다. 제제화는 경구 및 주입 가능한 투여(진용액(true solution), 현탁액 또는 에멀젼)에 적합하도록 제조되는 것이 바람직하며, 정제, 캡슐, 연질캡슐, 수성 약제, 환제, 과립 등과 같은 경구 형태로 제조되는 것이 가장 바람직하다.

상기 제제화에서 본 발명의 펩타이드는 부형제(excipient)없이 연질 캡슐에 충전될 수 있고, 담지체와 혼합되거나 희석된 후에 적당한 제제로 만들어질 수도 있다. 적합한 담지체의 예로는 전분, 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 등이 있다.

상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물로 응용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 바람직하게는 척추동물, 더욱 바람직하게는 포유류일 수 있다. 상기 포유류는 인간, 돼지, 소 또는 염소 등일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.

상기 약학 조성물은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

상기 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함할 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용 할 수 있다.

구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.

더 나아가 본 발명의 약학 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일예로, 본 발명의 약학 조성물은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 기준으로 할 때, 0.000001 mg/kg/day 내지 1000 mg/kg/day로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은, 유효성분인 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 이외에 공지의 심혈관 질환 치료효과를 갖는 화합물, 특히 식품으로 사용되는 천연물 유래 물질을 더욱 포함할 수 있으며, 상기 유효성분 100 중량부에 대하여 각각 5 중량부 내지 100 중량부로 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 식품 조성물의 예로는 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제를 들 수 있다.

상기 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이며, 바람직하게는 껌 또는 캔디일 수 있다.

본 발명의 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 기능성 식품은 심혈관질환 또는 고지혈증의 예방 또는 개선에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현할 수 있는 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 첨가제는 본 발명의 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 100 중량부 당 0 내지 100,000 중량부, 바람직하게는 0.00001 내지 10,000 중량부 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 기능성음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 중량부 내지 20 중량부, 바람직하게는 1 중량부 내지 18 중량부, 더욱 바람직하게는 5 중량부 내지 12 중량부 포함될 수 있다.

또한, 심혈관질환 또는 고지혈증의 예방 또는 개선의 효과를 목적으로 하는 식품 조성물에 있어서, 상기 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 양은 전체 식품 중량의 0.00001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물 제조방법에 관한 것이다.

상기 방법은 굴에 트랜스글루타미나제를 처리하는 단계 및 상기 트랜스글루타미나제를 처리한 굴에 단백질 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

보다 상세하게는 굴을 마쇄하는 단계; 상기 마쇄된 굴에 트랜스글루타미나제를 처리하는 단계 및 상기 트랜스글루타미나제를 처리한 굴에 단백질 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 굴은 물에 데친 것일 수 있고, 상기 물의 온도는 80 내지 150℃일 수 있고, 상기 데치는 기간은 10초 내지 10분 또는 30초 내지 2분일 수 있다.

상기 굴을 마쇄하는 단계는 상기 데친 굴의 무게의 약 1 내지 4배 또는 1.5 배 내지 3배에 해당하는 물을 첨가하고, 분쇄기를 이용하여 30초 내지 5분 또는 1분 내지 3분 동안 500rpm 내지 5,000 rpm 또는 1,000 rpm 내지 3,000 rpm 의 조건에서 수행할 수 있다.

상기 트랜스글루타미나제는 상기 굴 단백질의 농도의 1 내지 5% 또는 1.5 내지 2.5% 첨가될 수 있다. 상기 반응조건 및 반응시간은 효소의 종류에 의해 적절하게 조절될 수 있으며, 일 예로 20 내지 40℃ 또는 25 내지 35℃에서 10분 내지 120분 또는 30분 내지 90분 동안 반응을 수행할 수 있다. 상기 트랜스글루타미나제의 처리에 의하여 단백질간의 새로운 공유결합이 형성될 수 있다.

상기 단백질 분해효소의 처리는 상기 트랜스글루타미나제를 처리한 굴 분쇄물에 열처리를 수행하여 상기 트랜스글루타미나제를 불활성화시킨 후에 수행할 수 있다. 상기 열처리는 50 내지 150℃ 또는 80 내지 120℃에서 10분 내지 120분 또는 30분 내지 90분 동안 수행할 수 있다.

상기 단백질 분해효소는 통상의 단백질 분해효소일 수 있고, 일 예로 Protamex 또는 Neutrase일 수 있다. 상기 단백질 분해효소의 처리량은 각각 굴 단백질의 농도의 0.5 내지 5% 또는 1 내지 2%일 수 있다. 상기 단백질 분해효소의 처리는 구체적으로, Protamex를 처리한 후에 Neutrase를 처리하는 방법으로 수행할 수 있고, 상기 반응조건 및 반응시간과 효소의 불활성화 처리는 각 효소의 종류에 의해 적절하게 조절될 수 있으며, 일 예로 상기 반응 조건은 20 내지 60℃ 또는 35 내지 45℃에서 10분 내지 120분 또는 30분 내지 90분 동안 반응을 수행할 수 있다. 상기 단백질 분해효소의 불활성화를 위한 열처리는 50 내지 150℃ 또는 80 내지 120℃에서 10분 내지 120분 또는 30분 내지 90분 동안 수행할 수 있다.

또한, 상기 제조방법은 상기 효소처리물에 최종 농도가 60%(v/v)가 되도록 에탄올을 첨가하는 단계 및 2 내지 6℃의 저온실에서 30분 내지 120분 또는 45분 내지 90분 동안 방치하여 에탄올 불용성 물질과 잔여 단백질을 침전시킨 후, 원심분리를 이용하여 제거하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 또한, 상기 침전물을 제거하여 수득한 상측액을 여과하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 만들어진 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 상기 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물은 굴 효소처리물을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 펩타이드 또는 산부가염은 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있고, 이로 인하여 심혈관질환의 치료, 예방 또는 개선에 유용할 뿐만 아니라, 식품인 굴 유래의 것으로 안전성이 보장되고 부작용이 문제되지 아니하다. 또한, 3면이 바다인 우리나라에서 풍부하게 수확되는 굴로부터 효소처리에 의하여 수득할 수 있는 것이므로, 상기 펩타이드의 제조는 기존 화학적으로 인공 합성하는 것에 비하여, 경제성도 우수하다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 기존의 화학적으로 제조된 심혈관계 질환에 대한 치료 또는 개선용 인공 물질을 대체할 수 있다는 점에서 관련 산업에 폭 넓게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다.　 그러나, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것일 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 굴 단백질 효소처리물의 제조

1-1. 굴 단백질 효소처리물의 제조

통영시 소재 수하조합에서 구입한 양식산 굴 3kg을 1분 동안 끓는 물에 데친 후, 채를 이용하여 물기를 제거하였다. 상기 끓는 물에 데친 굴에 상기 굴의 무게 2배에 해당하는 물을 첨가한 후, 분쇄기를 이용하여 2분 동안 3000 rpm의 조건으로 마쇄하였다. 상기 굴 마쇄물의 단백질 농도는 Lowry법을 이용하여 측정하였다. 상기 측정된 단백질 농도에 대하여 2%의 농도가 되도록 각 트랜스글루타미나제 및/또는 단백질 분해효소를 첨가하고 반응시켜 가수분해물을 제조하였다. 구체적으로, 상기 가수분해물은 트랜스글루타미나제(transglutaminase, TGase, Ajinomoto Co, 일본), Protamex(Novozyme-Korea, 대한민국) 및 Neutrase(Novozyme-Korea, 대한민국)를 처리한 실험예 1과 단백질 분해효소인 Protamex 및 Neutrase만을 처리한 실험예 2이다.

상기 실험예 1의 가수분해물 제조는 보다 상세하게는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 우선, 상기 굴 분쇄물에 측정된 단백질 농도에 대하여 1%의 농도가 되도록 트랜스글루타미나제를 첨가하고 30℃에서 1시간 동안 반응을 수행하여 공유결합을 형성시킨 후, 100℃에서 1시간 동안 열처리하여 효소를 불활성화 시켰다. 상기 트랜스글루타미나제를 처리한 효소처리물에 Protamex를 상기 측정된 단백질 농도에 대하여 1%의 농도가 되도록 첨가하고 40℃에서 1시간 동안 반응을 수행한 후, 100℃에서 1시간 동안 열처리하여 효소를 불활성화 시켰다. 상기 Protamex를 처리한 효소처리물에 Neutrase를 상기 측정된 단백질 농도에 대하여 1%의 농도가 되도록 첨가하고 50℃에서 1시간 동안 반응을 수행한 후, 100℃에서 1시간 동안 열 처리하여 효소를 불활성화 시켰다. 상기 효소처리물의 상층액을 수득하여 실험예 1을 제조하였다.

또한, 실험예 2는 상기 굴 분쇄물에 측정된 단백질 농도에 대하여 1%의 농도가 되도록 Protamex를 첨가하고 40℃에서 1시간 동안 반응을 수행한 후, 100℃에서 1시간 동안 열처리하여 효소를 불활성화 시키고, 상기 Protamex를 처리한 효소처리물에 Neutrase를 상기 측정된 단백질 농도에 대하여 1%의 농도가 되도록 첨가하고 50℃에서 1시간 동안 반응을 수행한 후, 100℃에서 1시간 동안 열처리하여 효소를 불활성화 시켰다. 상기 효소처리물의 상층액을 수득하여 실험예 2를 제조하였다.

상기 수득한 실험예 1과 실험예 2을 최종 농도가 60%(v/v)가 되도록 에탄올을 첨가하고, 4℃의 저온실에서 1시간 동안 방치하여 에탄올 불용성 물질과 잔여 단백질을 침전시킨 후, 원심분리(8000×g, 25min)를 이용하여 제거하였다. 침전물을 제거하여 수득한 상층액은 0.45 μm의 막으로 여과하고, 회전진공증발기(N-type, EYELA, 일본)를 이용하여 40℃ 이하의 온도에서 에탄올을 증발시키는 방법으로 건조시켜 실험예 1의 가수분해물을 및 실험예 2의 가수분해물을 제조하였다. 상기 가수분해물은 각각 건조중량을 기준으로 실험초기에 사용된 굴의 약 29%(28.5 내지 30.1%)인 것으로 확인되었다.

1-2. 혈압저하능의 확인

상기 실시예 1-1에서 수득한 실험예 1과 실험예 2의 가수분해물 및 이하 유효성분의 혈압저하능을 확인하는 방법은 ACE 저해능을 측정하는 방법으로 수행하였 다.

상기 실시예 1-1에서 수득한 실험예 1과 실험예 2의 가수분해물은 증류수로 희석하여 최종 농도가 0.5 mg/ml로 조절하여 확인하였다. 상기 혈압저하능은 ACE 저해능을 이용하여 측정하였다.

보다 상세하게는, ACE 저해능은 Wu et al.(2002)의 방법을 기초로 수행하였다.

구체적으로, 0.3 M NaCl을 첨가한 0.1 M borate buffer(pH 8.3)로 5 mM hippuryl-His-Leu(HHL)과 0.25 mUnit ACE를 제조하였다. Eppendorf tube에 시료 40 uL, ACE 150 uL를 첨가하고, 37 ℃ 항온수조에서 10분간 교반 하면서 반응시킨 후 100 uL HHL을 가하여 37 ℃ 항온수조에서 30분간 교반하면서 반응시켰다. 반응 종결 후 150 uL의 1 M HCl을 가하여 효소 반응을 중지시킨 다음 10000 x g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 분취하였다. 상기 분취한 상층액을 HPLC(Hitachi, Japan)로 유리한 hippuric acid(HA)의 함량을 측정하였다.　 HA의 정량을 위해 역상 column(Watchers 120 ODS-AP, 4.6 x 250 mm, 5 ㎛, Daiso, Japan)에 반응 중지용액 40 uL를 주입하였다. A 용매로는 0.1 % TFA를 포함하는 H₂0를 사용하고 B 용매로는 0.1 % TFA를 포함하는 100 % CH₃CN을 사용하였다. Gradient는 5 → 60 % B 용매/ 20 min 조건으로 선형 균배하면서 228 nm 흡광도에서 검출하였다. Reference 용액은 시료대신 40 uL의 A용매를 사용하였고 유속은 1 mL/ min의 조건으로 용출하였다. 효소저해능은 하기 계산식1로 계산하였으며, 시료 농도별로 ACE저해활성을 측정하 여 농도별 저해 활성을 선형 회귀분석 하였다. 또한 ACE 저해활성의 50%를 저해하는 데 필요한 시료 농도를 IC₅₀ 으로 정의하였다.

[계산식 1]

ACE 저해(%)=(Reference의 HA - 시료의 HA)/Reference의 HA x 100

상기 실험예 1과 실험예 2의 가수분해물의 정제단계별 혈압저하능을 시료 처리 전의 안지오텐신 전환효소의 효소능을 기준으로 저해능을 확인한 결과를 하기 표 1 및 표 2에 기재하였다.

[표 1]

시료명	가수분해물	양이온-교환크로마노그래피	크기배제 크로마토그래피
실험예 2	38.1%	86.7%	80.0%
실험예 1	48.9%	87.0%	79.8%

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실험예 2의 가수분해물이 정제가 거듭될수록 안지오텐신 전환효소 저해능이 우수한 것으로 확인되어 실험예 2로부터 안지오텐신 전환효소 저해능이 있는 펩타이드를 추출하는 것이 바람직할 것으로 판단되었다.

1-3. 활성성분 회수

상기 실시예 1-1에서 수득한 실험예 1과 실험예 2의 가수분해물을 탈이온수에 녹인 후, 5 kDa 막(5 kDa membrane)을 장착한 한외여과기(8200, Amicon Co., USA)로 한외 여과하였다. 상기 한외 여과를 수행한 후, 수득한 상층액과 잔사를 진공동결 건조하여 각 굴 가수분해물의 활성성분 건조 분말을 제조하였다.

1-4. 분획물의 제조

상기 실시예 1-2에서 수득한 건조 분말(이하, TGPN)을 20% CH₃CN에 용해하여 1kDa 막을 장착한 한외여과기(8200, Amicon Co., USA)로 한외 여과하여 상층액(1 kDa 초과 TGPN)과 여과액(1 kDa 이하 TGPN)을 분리하고, 10% CH₃CN 10 ml로 정용하여 안지오텐신 전환효소 저해능을 측정하였다. 측정 결과, 1 kDa 초과 TGPN의 IC₅₀은 4.5157 mg/ml이고, 1 kDa 이하 TGPN의 IC₅₀은 0.6142 mg/ml으로, 1 kDa 이하 TGPN이 안지오텐신 전환효소 저해능이 우수한 것으로 확인되었다. 상기 저해능이 우수한 1 kDa 이하 TGPN을 정제하면서, 유효성분을 분리하는 단계를 수행하였다. 상기 유효성분을 분리하기 위해 수행한 정제방법은 도 1에 나타낸 바와 같으며, 상세하게는 하기와 같다.

첫 번째 단계로, 상기 저해능이 우수한 1 kDa 이하 TGPN(30.1298 mg/ml, 20 ml)을 분자량별로 분리하기 위한 크기 배제 컬럼(Hiroad 16/60 superdex 30 pg, 16×600 mm, Pharmacia, 스웨덴)을 이용하여 226 nm 흡광도로 검출하였고, 용매는 20% CH₃CN을 이용하였으며, 유속은 1 ml/min 조건에서 수행하고, 각 2ml씩 분취하였다. 상기 각 2 ml씩 분취한 시료의 분자량은 동일한 조건에서 각각의 표준 단백질의 용출부피를 통해 표준곡선을 작성하여 계산하였다. 상기 각 분자량으로 구분된 분획별로 안지오텐신 전환효소 저해능을 측정하였다.

두 번째 단계로 역상 HPLC column(218TP510 Protein&peptide C₁₈, 10×250 mm, 5 μm, Grace Vydac, USA)을 이용하여 254nm 흡광도로 검출하였다. A용매로는 0.1% TFA를 포함하는 H₂O를 이용하였고, B용매로는 0.1% TFA를 포함하는 CH₃CN을 이용하였으며, 농도구배는 0에서 50% B용매/50min의 조건으로 선형구배하였으며, 유속은 3 mL/min의 조건으로 부분정제하였다. 각 분획의 1/65에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.

세 번째 단계로 양이온 교환 HPLC column(TSK-gel SP-5PW, 7.5×7.5 mm, Tosoh, 일본)을 이용하여 254nm 흡광도로 검출하였다. A용매로는 10 mM phosphate buffer(pH 6.0)을 사용하였고, B용매는 1M NaCl을 포함한 10 mM phosphate buffer(pH 6.0)을 사용하였다. 농도구배는 0에서 1.0M B용매/100min의 조건으로 선형구배하였으며, 유속은 1 mL/min의 조건으로 부분정제하였다. 각 분획의 1/50에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.

네 번째 단계로 역상 HPLC column(Watchers 120 ODS-AP, 4.6×250 mm, 5 μm, Daiso, 일본)을 이용하여 분취하였다. A용매로는 0.1% TFA를 포함하는 H₂O를 이용하였고, B용매로는 0.1% TFA를 포함하는 CH₃CN을 이용하였으며, 220 nm에서 흡광도로 검출하였다. 농도구배는 0에서 20% B용매/60min의 조건으로 선형 구배하였으며, 유속은 1 mL/min의 조건으로 부분정제하였다. 각 분획의 1/25에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.

다섯 번째 단계로 네 번째 단계에서 사용한 것과 동일한 역상 HPLC column을 사용하여, 220nm흡광도로 검출하하였다. 용매는 0.1% TFA를 포함하는 12% CH₃CN을 이용하였으며, isocratic 조건에서 1 mL/min의 유속으로 부분정제하였다. 각 분획의 1/25에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.

여섯 번째 단계로 네 번째 단계에서 사용한 것과 동일한 역상 HPLC column을 사용하여, 상기 다섯 번째 단계에서 얻어진 분획을 동일한 조건으로 부분정제하였다. 각 분획의 1/20에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.

일곱 번째 단계로 크기 배제 FPLC 컬럼(Superdex Peptide HR 10/30, 10×300 mm, Pharmacia, 스웨덴)을 이용하여 정제하였으며, 용매는 12% CH₃CN을 이용하였으며, 226nm 흡광도로 검출하였고, 유속은 0.5 ml/min 조건에서 수행하였다. 각 분획의 1/10에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.

실시예 2: 활성분획의 안지오텐신 전환효소 저해능 측정

상기 실시예 1-4에서 제조된 각각의 활성분획의 안지오텐신 전환효소 저해능을 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 측정하였다.

우선, 실시예 1-4에서 수득한 1 kDa 이상과 1 kDa 이하의 활성 분획을 비교한 결과, 안지오텐신 전환효소 저해능은 1 kDa 이상의 경우 IC₅₀값이 4.5157 mg/ml로 확인되었고, 1 kDa 이하의 경우 IC₅₀값이 0.6142 mg/ml로 확인되어 1 kDa 이하의 활성분획이 현저하게 우수한 저해능을 갖는 것으로 확인되었다.

상기 확인 결과에 따라, 1 kDa 이하의 활성분획을 실시예 1-4의 첫번째 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분획한 결과, 총 4개의 주요 분획층으로 확인되었고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

분획	IC₅₀(mg/ml)	용출부피/void 부피	분자량(Da)
SX1	0.2642	0.95-1.95	>1,000
SX2	0.0790	2.35	200-500
SX3	0.1591	2.70	100-200
SX4	-	3.10	<100

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 저해능이 확인된 3개의 분획을 SX1, SX2 및 SX3로 명명하였다. 각각의 IC₅₀값은 0.2642 mg/ml, 0.0790 mg/ml 및 0.1591 mg/ml 로 확인되었다.

상기 IC₅₀값이 가장 우수한 것으로 확인된 SX2를 회전진공증발기(N-1, EYELA, 일본)로 농축하고, 이를 실시예 1-4에 기재된 두 번째 분획법으로 검출하는 단계를 실시하였으며, 이 중, 안지오텐신 전환효소 저해능이 우수한 분획, 구체적으로 50% 이상의 활성을 가진 분획을 분리하였다. 상기 분리된 분획은 각각 RP9(9.5min, 4-5% CH₃CN) 및 RP17(15.7min, 10-11% CH₃CN )로 명명하였고, 각각의 활성은 55.67%와 50.54%이었다.

상기 IC₅₀값이 우수한 것으로 확인된 RP9 및 RP17를 회전진공증발기로 농축하고, 이에 대하여 실시예 1-4에 기재된 세 번째 분획법을 실시하였으며, RP9의 경우 8개 분획으로, RP17의 경우 5개 분획으로 분취하여 안지오텐신 전환효소 저해능을 측정하였다. 이 중, 저해능이 우수한 것을 각각 RP9CX1(2.68min, 10 mM NaCl), RP17CX1(2.40min, 8 mM NaCl), RP17CX3(4.23min, 26 mM NaCl) 및 RP17CX4(5.09min, 35 mM NaCl)로 명명하였고, 각각의 활성은 54.58%, 76.11%, 72.68%와 70.20%이었다. 상기 저해능이 우수한 것으로 확인된 활성분획 각각은 진공동결건조장치(FDU-540, EYELA, 일본)로 용매를 휘발시켜 제거하였다.

상기 용매를 제거한 분획에 대해 실시예 1-4에 기재된 네 번째 분획법을 실시하였으며, RP9CX1의 경우 2개 분획을 제외한 분획이 모두 254nm 또는 280nm의 흡광도가 220nm의 흡광도 보다 높게 나왔고, 상기 2개의 분획은 안지오텐신 전환효소 저해능을 나타내지 아니하여 이후 실험에서 제외하였다.

한편, RP17CX1의 경우 6개 분획으로 분취하고, RP17CX3의 경우 8개 분획으로 분취하였으며, RP17CX1의 경우 4개 분획으로 분취하여 안지오텐신 전환효소 저해능을 측정하였다. 이 중, 저해능이 우수한 것을 확인하면, 각각 RP17CX1RP1(43.22min, 11-12% CH₃CN), RP17CX1RP4(46.72min, 12-13% CH₃CN) 및 RP17CX1RP5(47.68min, 13% CH₃CN)에서 각각 55.20%, 69.79% 및 76.02%의 저해능을 나타내었고, RP17CX3RP4(44.13min, 12% CH₃CN), RP17CX3RP5(45.02min, 12% CH₃CN) 및 RP17CX3RP6(45.61min, 12% CH₃CN)에서 각각 52.57%, 54.99% 및 71.25%의 저해능을 나타내었으며, RP17CX4RP1(43.26min, 12% CH₃CN) 및 RP17CX4RP2(44.53min, 12% CH₃CN) 에서 각각 43.13% 및 32.62%의 저해능을 나타내었다.

상기 분획에 대해 실시예 1-4에 기재된 다섯 번째 분획법을 실시하였으며, 그 결과는 다음과 같다. 구체적으로, RP17CX1RP1의 경우 3개 분획으로 분취하였 고, RP17CX1RP4의 경우 6개 분획으로 분취하였으며, RP17CX1RP5의 경우 7개 분획으로 분취하였고, RP17CX3RP5의 경우 6개 분획으로 분취하였으며, RP17CX3RP6의 경우 3개 분획으로 분취하였고, RP17CX4RP1의 경우 단일 peak가 검출되었고, RP17CX4RP2의 경우 4개 분획으로 분취하여 안지오텐신 전환효소 저해능을 측정하였다. RP17CX3RP4의 경우, 분취된 분획물 모두 안지오텐신 전환효소 저해능이 없는 것으로 확인되었다.

이 중, 저해능이 우수한 것을 확인하면, RP17CX1RP1RP2(8.80min)은 58.65%의 저해능을 나타내었으나, 명확한 분획의 구분이 어려워 더 이상의 분획이 어려운 것으로 확인되었다.

또한, RP17CX1RP4RP6(11.10min)은 73.62%의 저해능을 나타내었고, RP17CX1RP5RP5(13.27min)은 54.17%의 저해능을 나타내었으며, RP17CX3RP5RP2(9.60min)은 64.11%의 저해능을 나타내었고, RP17CX3RP5RP6(12.03min)은 53.53%의 저해능을 나타내었으며, RP17CX3RP6RP4(12.12min)은 58.97%의 저해능을 나타내었고, RP17CX1RP1 (12.80min)의 단일 피크는 53.46%의 저해능을 나타내었으며, RP17CX4RP2RP4(11.80min)은 RP17CX4RP2로부터 분취된 분획물 중, 확연히 차이가 나는 59.60%의 저해능을 나타내었다.

상기 분획에 대해 실시예 1-4에 기재된 여섯 번째 분획법을 실시하였으며, 그 결과는 다음과 같다. 구체적으로, RP17CX1RP4RP6의 경우 모든 분획에서 안지오텐신 전환효소 저해능이 없는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터 상기 분획은 낮은 활성을 가지는 여러 분획으로 분리되어진 것으로 판단되었다. 한편, RP17CX1RP5RP5의 경우, 총 3개의 분획으로 구분되었으며, 이중 RP17CX1RP5RP5RP3(15.60min)에서 15.60%의 저해능을 나타내었다. 또한, RP17CX3RP5RP2(11.17 min), RP17CX3RP5RP6(14.24 min), RP17CX3RP6RP3(12.60 min), RP17CX4RP1RP1(12.57 min) 및 RP17CX4RP2RP4(13.74 min)의 경우, 모두 단일 분획으로 분리되었다.

마지막으로, 상기 분획에 대해 실시예 1-4에 기재된 일곱 번째 분획법을 실시하였으며, 그 결과를 도 2 내지 도 5 및 하기 표 4에 나타내었다.

[표 4]

	분획번호	저해능(%)
(A)	RP17CX1RP5RP5RP3SX1	66.11
	RP17CX1RP5RP5RP3SX2	22.90
	RP17CX1RP5RP5RP3SX3	0.37
(B)	RP17CX3RP5RP2RP1SX1	93.67
(C)	RP17CX3RP5RP6RP1SX1	57.66
(D)	RP17CX4RP1RP1RP1SX1	92.76

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, RP17CX1RP5RP5RP3의 경우, 총 3개의 분획으로 구분되었으며, 이중 RP17CX1RP5RP5RP3SX1 분획에서 66.11%의 안지오텐신 저해능이 확인되었다. 한편, RP17CX3RP5RP2RP1, RP17CX3RP5RP6RP1 및 RP17CX4RP1RP1RP1의 경우 단일 분획으로 나타났으며, (12.60 min), RP17CX4RP1RP1(12.57 min) 및 RP17CX4RP2RP4(13.74 min)의 경우, 모두 단일 분획으로 분리되었다.

실시예 3: 아미노산 서열분석

상기 실시예 2에서 최종적으로 선택된 분획에 포함된 아미노산 서열을 분석하였다. 상기 아미노산 서열 분석은 아미노산 서열과 정확한 분자량의 결과를 얻기 위해 QTOF2(Micormass, 영국) 질량분석기를 이용하여 전기분무이온환(ESI)법을 수행하였고, 서열을 확인하기 위하여 Edmnan법을 수행하였으며, 이를 통하여 분석한 결과가 일치하는 펩타이드로 아미노산 서열 분석을 수행하였다. 상기 분석된 아미노산 서열을 도 6 및 하기 표 5에 기재하였다.

[표 5]

명칭	아미노산 서열	서열번호
Cpep1	Pro-Asn(P-N)	1
Cpep2	Arg-His-Asp(R-H-D)	2

상기 도 6 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2에서 가장 우수한 것으로 확인된 분획에 포함된 아미노산 Cpep1과 Cpep2는 각각 질량이 215 Da과 397 Da인 것으로 확인되었고, 각각 2개와 3개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드이며, 그 서열은 상기 표 5와 같은 것으로 확인되었다.

상기 표 5에 기재된 펩타이드의 안지오텐신 전환효소의 저해능을 확인하기 위하여, 상기 안지오텐신 전환효소 저해능 측정방법에 따라, 안지오텐신 전환효소를 50% 저해할 수 있는 농도인 IC₅₀을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

[표 6]

명칭	아미노산 서열	IC₅₀ (μM)
Cpep1	Pro-Asn(P-N)	0.19
Cpep2	Arg-His-Asp(R-H-D)	2.96

상기 표 6에 기재된 바와 같이, 상기 두 펩타이드는 안지오텐신 전환효소의 저해능이 매우 우수한 것으로 확인되었고, 특히, 서열번호 1의 Cpep1(Pro-Asn)은 0.19 μM 함량으로도 안지오텐신 전환효소의 50%를 저해할 수 있는 것으로 확인되어, 이후 안지오텐신 전환효소와 관련된 심혈관계 질환의 치료제 등의 다양한 용도로 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 굴 단백질 효소 처리물에 대해 크로마노그래피를 수행하여 유효성분을 분리 및 정제 하는 단계와 그 결과를 나타내는 도면으로, TGPN은 트랜스글루타미나제와 단백질 가수분해효소(Protamex 및 Neutrase)를 순서대로 처리한 처리물이고, SX는 크기배제크로마토그래피, RP는 역상크로마토그래피 및 CX는 양이온-교환 크로마토그래피를 각각 수행한 결과를 나타내는 것이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 최종 분획법을 실시한 결과물의 활성분획을 나타낸 것으로, RP17CX1RP5RP5RP3SX1 내지 RP17CX1RP5RP5RP3SX3의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 최종 분획법을 실시한 결과물의 활성분획을 나타낸 것으로, RP17CX3RP5RP2RP1SX1의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 최종 분획법을 실시한 결과물의 활성분획을 나타낸 것으로, RP17CX3RP5RP6RP1SX1의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 최종 분획법을 실시한 결과물의 활성분획을 나타낸 것으로, RP17CX4RP1RP1RP1SX1의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 최종 분획법을 실시한 결과물의 활성분획으로부터 추출한 아미노산을 질량분석기를 이용한 전기분무이온화법으로 펩타이드의 분자량을 분석한 질량 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.

<110> KONG,JAI-YUL <120> A ANTIHYPERTENSIVE PEPTIDE <130> KP200080200 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2 <212> PRT <213> Cpep1 <400> 1 Pro Asn 1 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Cpep2 <400> 2 Arg His Asp 1

Claims

서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염.
제1항에 있어서,

상기 펩타이드는 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme)의 저해능을 갖는 것인 펩타이드 또는 이들의 산 부가염.
서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드.
제3항에 따른 뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제1항 또는 제2항에 따른 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관질환 치료 또는 개선용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 심혈관질환이란 고혈압, 심장병, 뇌졸중, 혈전증, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상경화증 및 동맥경화로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인 심혈관질환 치료 또는 개선용 조성물.
굴에 트랜스글루타미나제를 처리하는 단계 및 상기 트랜스글루타미나제를 처리한 굴에 단백질 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물 제조방법.
제7항의 제조방법에 따라 제조되고, 굴 효소처리물을 포함하는 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물.