CN1557474A - 天然降压多肽营养剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种天然降压多肽营养剂，尤其涉及一种以牛奶蛋白或其他食物蛋白为原料，通过蛋白水解酶水解或乳酸杆菌属发酵制备天然降压多肽，并应用于防治高血压的方法，其特征是，以牛奶蛋白或其他食物蛋白为原料，通过采用蛋白分解酶水解或乳酸杆菌属细菌的发酵，制备不同纯度、不同类型的降压多肽，直接应用，或作为食品添加剂、营养强化剂，或作为药物成分应用于高血压患者。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种天然降压多肽营养剂，尤其涉及一种以牛奶蛋白或其他食物蛋白为原料，通过蛋白水解酶水解或乳酸杆菌属发酵制备天然降压多肽，并应用于防治高血压的方法。
发明技术背景
医学界把高血压分为原发性高血压(即高血压病)和继发性高血压(即症状性高血压)两大类。继发性高血压是指由于某些疾病引起的高血压，高血压仅仅是这种疾病的症状之一。原发性高血压是常见病、多发病，其发病机理至今为止尚未完全探明，可能与压力、肥胖、吸烟、高血脂、运动减少、高脂肪饮食、遗传等有关。临床上以动脉血压升高为主要特征，随着病情加重，常常使心、脑、肾等脏器受累，发生功能性或器质性改变，如高血压性心脏病、心力衰竭、脑血管意外，肾功能衰竭等，是影响人类健康的最大元凶之一。
目前有多种降低血压的药物用于控制和降低血压，包括利尿剂、β-受体阻滞剂、钙拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II拮抗剂等五大类，这些药物虽能有效降低血压，但是，长期服用都有各种副作用，其中某些副作用还很严重，而且有些药物价格昂贵，很多病人不能长期坚持服用，据统计，很大一部份病人，约40％的高血压病人其血压未能得到良好控制。高血压病人盼望着用既能有效降低血压，又不引发任何毒副作用的天然药物来控制血压。
现代研究证实，牛奶蛋白经水解后产生的多肽具有抑制血管紧张素转换酶(ACE)的作用，能阻碍血管紧张素转换酶将血管紧张素I转换为血管紧张素II，从而降低血压，Maruyamaet al(1985，1987)已经证实，从牛奶αs1-酪蛋白和β-酪蛋白水解的多肽具有抑制血管紧张素转换酶(ACE)的作用，αs1-酪蛋白的f22-34，23-27和194-199，β-酪蛋白的f177-183都具有这种作用。Nakamura et al(1995)从酸奶中成功分离具有抑制血管紧张素转换酶(ACE)作用的多肽Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro.Mullaly et al(1996)证实，乳清蛋白水解后产生的多肽，尤其β-乳球蛋白N终端双肽(Try-Leu)，β-乳球蛋白f142-148，双肽(Pry-Pro)，具有更强抑制血管紧张素转换酶(ACE)的作用。
国外科学家已经报导从乳酸杆菌发酵的酸奶中分离出对血管紧张素转换酶(ACE)具有强烈抑制作用的三肽-Val-Pro-Pro和Ive-Pro-Pro(J.Dairy Sci 78：777-783)，用这类三肽对自然发生高血压的兔(SHR)进行动物实验证实，具有强烈的降血压作用(J.Dairy.Sci.78：1253-1257)。
本发明所要解决的技术问题是，以牛奶蛋白或其他食物蛋白为原料，制备天然降压多肽应用于高血压患者，在降压的同时不会引起任何毒副作用。
发明内容
本发明解决其技术问题所采用的技术方案，其特征是，以牛奶蛋白或其他食物蛋白为原料，通过采用蛋白分解酶水解或乳酸杆菌属细菌的发酵，制备不同纯度、不同类型的降压多肽，直接应用，或作为食品添加剂、营养强化剂，或作为药物成份应用于高血压患者。
本发明的技术特征是，用作制备降压多肽的原料，可以是牛奶蛋白或其他类型的食物蛋白，应用蛋白分解酶水解技术制备降压多肽时，应选用牛奶蛋白，包括但不限于：乳清、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白粉、乳清浓缩蛋白粉、高纯度乳清蛋白粉(WPI)，酪蛋白、酪蛋白粉、工业干酪素、干酪酸钠、干酪酸钾、干酪酸铵、牛奶、奶粉、牛初乳等，最好选用乳清蛋白类原料，最好是高纯度乳清蛋白粉(WPI)；应用乳酸杆菌属细菌发酵技术制备降压多肽时，可以采用上述各类牛奶中蛋白，也可以采用其他类型食物蛋白，包括但不限于：谷类蛋白、麦类蛋白、豆类蛋白等。
本发明的技术特征是，在蛋白水解时应用的蛋白分解酶，可以是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、II型弹性蛋白酶等蛋白分解酶的单独使用，例如，应用胰蛋白酶单独水解蛋白；也可以是上述数种蛋白分解酶混合应用，例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶组成混合物应用于蛋白水解过程；还可以是上述蛋白分解酶的序列使用，例如，先在酸性环境下应用胃蛋白酶进行初步蛋白水解，然后在碱性环境下应用胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶混合物和II型弹性蛋白酶进行二次蛋白水解，蛋白分解酶的投料量占水解蛋白量的0.1～1.2％，蛋白水解温度30～50℃，蛋白水解时间2～6小时，应用胃蛋白酶进行蛋白水解时，PH值在2.0～3.0，应用胰酶进行坦白水解时，PH值在7.0～9.0，在蛋白水解结束后，应加温至90℃持续5～10分钟灭活蛋白酶。
本发明的技术特征是，应用蛋白分解酶水解技术制备降压多肽时，大多数降压多肽的分子量在1,000～20,000之间，其中分子量在10,000～20,000范围的可溶性多肽约占50～60％，分子量在5,000～10,000约占10～20％，分子量2,000～5,000约占10～20％，分子量＜2,000约占10～20％，为了保证蛋白水解时产生的多肽维持在上述分子量范围，应用超滤膜技术进行分离过滤，在蛋白水解开始后一小时，将蛋白水解液持续泵入装有分子量为20,000D的超滤装置进行分离过滤，蛋白水解液中分子量小于20,000的多肽穿过超滤膜被收集，而未被水解的大蛋白分子又被泵入蛋白水解反应锅内继续进行水解过程，在蛋白水解过程结束后，收集的超滤上清液采用分子量为500～1000D的超滤膜进行浓缩，浓缩至起始容量20～30％后直接喷雾干燥或真空干燥制备干粉，内含丰富的降压多肽。
本发明的技术特征是，采用乳酸类细菌发酵方式制备降压多肽，采用的发酵细菌主要是乳酸杆菌属细菌，包括但不限于瑞士乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、短乳酸杆菌，最好选用瑞士乳酸杆菌，用作培养液的蛋白质可以是牛奶蛋白或各类植物蛋白中应含有氨基酸序列Tyr-Pro，Val-Pro-Pro，和Ile-Pro-Pro，最好选用乳清蛋白作为蛋白原料，用作乳酸杆菌属培养液内还应含有酵母抽提物、各类维生素和微量元素。
本发明的技术特征是，在接种乳酸杆菌至培养液前，培养液加热至85℃～95℃持续5～10分钟进行消毒杀菌，然后降温至预定温度加入乳酸杆菌的菌种，乳酸杆菌在培养液中加入量为10.sup.7cell乳酸杆菌/ml培养液，培养温度为30℃～45℃，培养时间为8～24小时，培养液PH值4.0～5.0，乳酸杆培养液用离心方法分离，离心速度为5,000～20,000rpm，离心时间为5～10分钟，收集的离心上清液直接干燥成粉，或采用分子量为20,000D的超滤膜过滤分离后喷雾干燥或真空干燥成粉，内含丰富的降压多肽。
本发明的技术特征是，为了从已分离的乳酸杆菌培养上清液中制备更高纯度的降压多肽，可以应用逆相树脂(Reverse-Phase resin)或逆相层析术(Reverse-PhaseChrmatography)来吸附降压多肽，然后洗脱，获得高纯度的降压多肽。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的降压多肽，含丰富的Tyr-Pro，Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro-Pro等多肽，具有显著的抑制血管紧张素转换酶(ACE)作用和降低血压的效果，可以用来预防和治疗原发性高血压，预防和治疗糖尿病伴发的高血压，高血压诱发的肾功能不全，以及预防高血压引发的心、脑、肾血管意外。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的降压多肽，可以直接应用，也可以作为食品添加剂制备各种食品应用，包括但不限于奶粉、奶茶、咖啡、饼干、糕点、速溶冲剂等，也可以与其他医药等级的辅料混合制备各类营养剂或药剂，包括但不限于片剂、胶囊剂、散剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、软胶囊剂、水剂、膜剂等。
本发明的有益效果是，在有效降低血压的同时，不会引发其他毒副作用，属于天然营养剂，安全可靠。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
用乳酸杆菌发酵制备降压多肽
取10公斤含9％乳清蛋白的蛋白溶液，加入300克带有瑞士乳酸杆菌CPN4的乳奶酵母(FERM BP4835)，在37℃温度下培养8小时，当凝乳形成，PH到达4.2时停止培养，并冷却培养溶液，10公斤酸奶溶液采用10,000rpm的速度离心10分钟，获得8公斤乳清，直接喷雾干燥，获得含有丰富降压多肽的干粉。
实施例2
制备高纯度降压多肽
取100公斤含9％乳清蛋白的蛋白溶液，加3公斤带瑞士乳酸杆菌CPN4(FERM BP-4835)的乳奶酵母，在37℃温度下培养24小时，培养液用10,000rpm速度离心10分钟，获得78公斤乳清，乳清溶液过预装C18层析柱(3升容积，由WATERS INC制造)，层析柱用10公斤5％的乙腈水溶液冲洗，然后用5公斤10％乙腈水溶液洗脱，洗脱液冷冻干燥成1186mg干粉，其中含有652mg的Tyr-Pro多肽，Tyr-Pro多肽纯度为55％。
实施例3
降压效果测试、
取实施例2制备的降压多肽，喂养自然发生高血压的兔子(SHR)来测试降血压效果，喂养剂量为2mg/kg，每2小时测量其血压降低-20.3±5.2，而对照组兔子(喂养普通牛奶)，血压仅降低-3.5±4.2。
实施例4
蛋白水解制备降压多肽
取400公斤乳清蛋白粉，加双蒸馏水升温至45℃，持续搅拌直至乳清蛋白粉完全溶解，加1N HCL稀释并调节PH至4.6，加温至90℃维持60秒进行巴氏消毒，应用交错切面流体超滤装置，采用分子量为60,000D的超滤膜分离乳糖等小分子物质，收集超滤浓缩物，用1N HCL调PH至2.5，加入38.8升牛胃蛋白酶抽提物(BOVIPEP，bovine pepsin extract.Pepsin Centent of 1.7克/L，from Lab.Presure-Granday)，水解过程持续1小时，加含12公斤NaOH和18.65公斤KOH的混合溶液150升，21％的铵溶液43升，调PH至8.0±0.1，加入647克已混合的蛋白分解酶，含有高纯度的胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶(采用PEM 2500S，胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶混合物，胰蛋白酶活性大于1800USP单位/mg，胰凝乳蛋白酶活性大于350USP单位/mg，from NOVB INDUSTRIE ENZYMES S.A.Paris.)，同时加入277克的II型弹性蛋白酶(酶活性大于30I.U./mg)，维持温度在45℃±2℃，持续3小时，蛋白水解过程结束，升温至98℃持续60秒以灭活胰酶，将蛋白水解酶泵入超滤装置，采用分子量为10,000D的SFEC超滤膜，超滤膜表面积为170m.sup.2，输入压为2bar.，温度为50℃，然后用分子量为2,000D的超滤膜浓缩至130克干物质/升的浓度，喷雾干燥成粉，内含丰富的降压多肽。
Claims (9)
1.本发明涉及一种天然降压多肽营养剂，尤其涉及一种以牛奶蛋白或其他食物蛋白为原料，通过蛋白水解酶水解或乳酸杆菌属发酵制备天然降压多肽，并应用于防治高血压的方法，其特征是， 以牛奶蛋白或其他食物蛋白为原料，通过采用蛋白分解酶水解或乳酸杆菌属细菌的发酵，制备不同纯度、不同类型的降压多肽，直接应用，或作为食品添加剂、营养强化剂，或作为药物成份应用于高血压患者。
2.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，用作制备降压多肽的原料，可以是牛奶蛋白或其他类型的食物蛋白，应用蛋白分解酶水解技术制备降压多肽时，应选用牛奶蛋白，包括但不限于：乳清、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白粉、乳清浓缩蛋白粉、高纯度乳清蛋白粉(WPI)，酪蛋白、酪蛋白粉、工业干酪素、干酪酸钠、干酪酸钾、干酪酸铵、牛奶、奶粉、牛初乳等，最好选用乳清蛋白类原料，最好是高纯度乳清蛋白粉(WPI)；应用乳酸杆菌属细菌发酵技术制备降压多肽时，可以采用上述各类牛奶中蛋白，也可以采用其他类型食物蛋白，包括但不限于：谷类蛋白、麦类蛋白、豆类蛋白等。
3.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，在蛋白水解时应用的蛋白分解酶，可以是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、II型弹性蛋白酶等蛋白分解酶的单独使用，例如，应用胰蛋白酶单独水解蛋白；也可以是上述数种蛋白分解酶混合应用，例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶组成混合物应用于蛋白水解过程；还可以是上述蛋白分解酶的序列使用，例如，先在酸性环境下应用胃蛋白酶进行初步蛋白水解，然后在碱性环境下应用胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶混合物和II型弹性蛋白酶进行二次蛋白水解，蛋白分解酶的投料量占水解蛋白量的0.1～1.2％，蛋白水解温度30～50℃，蛋白水解时间2～6小时，应用胃蛋白酶进行蛋白水解时，PH值在2.0～3.0，应用胰酶进行坦白水解时，PH值在7.0～9.0，在蛋白水解结束后，应加温至90℃持续5～10分钟灭活蛋白酶。
4.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，应用蛋白分解酶水解技术制备降压多肽时，大多数降压多肽的分子量在1,000～20,000之间，其中分子量在10,000～20,000范围的可溶性多肽约占50～60％，分子量在5,000～10,000约占10～20％，分子量2,000～5,000约占10～20％，分子量＜2,000约占10～20％，为了保证蛋白水解时产生的多肽维持在上述分子量范围，应用超滤膜技术进行分离过滤，在蛋白水解开始后一小时，将蛋白水解液持续泵入装有分子量为20,000D的超滤装置进行分离过滤，蛋白水解液中分子量小于20,000的多肽穿过超滤膜被收集，而未被水解的大蛋白分子又被泵入蛋白水解反应锅内继续进行水解过程，在蛋白水解过程结束后，收集的超滤上清液采用分子量为500～1000D的超滤膜进行浓缩，浓缩至起始容量20～30％后直接喷雾干燥或真空干燥制备干粉，内含丰富的降压多肽。
5.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，采用乳酸类细菌发酵方式制备降压多肽，采用的发酵细菌主要是乳酸杆菌属细菌，包括但不限于瑞士乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、短乳酸杆菌，最好选用瑞士乳酸杆菌，用作培养液的蛋白质可以是牛奶蛋白或各类植物蛋白中应含有氨基酸序列Tyr-Pro，Val-Pro-Pro，和Ile-Pro-Pro，最好选用乳清蛋白作为蛋白原料，用作乳酸杆菌属培养液内还应含有酵母抽提物、各类维生素和微量元素。
6.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，在接种乳酸杆菌至培养液前，培养液加热至85℃～95℃持续5～10分钟进行消毒杀菌，然后降温至预定温度加入乳酸杆菌的菌种，乳酸杆菌在培养液中加入量为10.sup.7cell乳酸杆菌/ml培养液，培养温度为30℃～45℃，培养时间为8～24小时，培养液PH值4.0～5.0，乳酸杆培养液用离心方法分离，离心速度为5,000～20,000rpm，离心时间为5～10分钟，收集的离心上清液直接干燥成粉，或采用分子量为20,000D的超滤膜过滤分离后喷雾干燥或真空干燥成粉，内含丰富的降压多肽。
7.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，为了从已分离的乳酸杆菌培养上清液中制备更高纯度的降压多肽，可以应用逆相树脂(Reverse-Phase resin)或逆相层析术(Reverse-Phase Chrmatography)来吸附降压多肽，然后洗脱，获得高纯度的降压多肽。
8.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的降压多肽，含丰富的Tyr-Pro，Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro-Pro等多肽，具有显著的抑制血管紧张素转换酶(ACE)作用和降低血压的效果，可以用来预防和治疗原发性高血压，预防和治疗糖尿病伴发的高血压，高血压诱发的肾功能不全，以及预防高血压引发的心、脑、肾血管意外。
9.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的降压多肽，可以直接应用，也可以作为食品添加剂制备各种食品应用，包括但不限于奶粉、奶茶、咖啡、饼干、糕点、速溶冲剂等，也可以与其他医药等级的辅料混合制备各类营养剂或药剂，包括但不限于片剂、胶囊剂、散剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、软胶囊剂、水剂、膜剂等。
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