JPH0236127A - アンジオテンシン変換酵素阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関し、特に
近年増加の傾向にあり対策が望まれている高血圧症の予
防及び治療に有用な医薬品又は食品に利用できることが
期待されるアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関するも
のである。

〔従来の技術〕

高血圧症の発症にはレニン−アンジオテンシン系が深い
かかわりを有していることがよく知られているが、この
レニン−アンジオテンシン系にはアンジオテンシン変換
酵素（ＥＣ３，４−１５，１，以下ＡＣＥとも言う）が
重要な役割を果たしている。この場合ＡＣＥは、肝で分
泌されるアンジオテンシノーゲンが腎で産生される酵素
レニンにより分解されたアンジオテンシンＩ　（Ａｓｐ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−１１ｅ−１１ｉｓ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に対して作用し、このもの
をアンジオテンシンＩｌ　（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒ。

−Ｐｈｅ）に変換させる。そして、このアンジオテンシ
ン■は血管壁平滑筋を収縮させて血圧を高め、さらに副
腎皮質に作用してアルドステロンの分泌を促進させるな
どの作用を有する。また、血漿に存在する酵素カリクレ
インはキニノーゲンと呼ばれる蛋白質を分解し、血管を
拡張させ降圧させるブラジキニンを産生ずるが、このブ
ラジキニンはＡＣＨの作用により分解され、不活性化さ
れてしまう。このように、ＡＣＥは一方で昇圧性ペプチ
ド（アンジオテンシン■）を生じさせ名とともに、他方
で降圧性ペプチド（ブラジキニン）を分解し、結果とし
て、血圧を上昇の方向に進める。したがってこの酵素活
性を抑制することによって血圧上昇を防ぐこと（降圧）
が可能である。

ＡＣＥの活性阻害物質としては蛇毒より得られた数種の
ペプチド性阻害剤を初めとして、カプトプリル（Ｄ−２
−メチル−３−メルカプトプロパノイル−し−プロリン
）などの合成物質が多数知られており、このうちカプト
プリルは経口降圧剤として既に実用に供されている。ま
た、近年、微生物あるいは種々の食品中にもＡＣＥ阻害
物質が見出され、降圧剤としての実用化が検討されてい
る。

また、牛乳カゼインのトリプシン加水分解由来のＡＣＥ
阻害物質を単離し、あるいはさらにペプチダーゼで処理
し、これを血圧降下剤として用いることが提案されてい
る（特公昭６０−２３０８５号、同６０−２３０８６号
、同６０−２３０８７号、特開昭６１−３６２２６号、
同６１−３６２２７号）。

また最近では、魚類タンパク質または大豆タンパク質の
バチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼ、バチルス属
細菌由来の金属プロテアーゼまたは植物由来のチオール
プロテアーゼによる加水分解物を血圧降下剤として用い
ることが提案されている（特開昭６２−１６９７３２号
）。

一方、とうもろこしタンパク質はプロラミンを５０〜６
０％、グルテリンを３５〜４０％含み、主成分であるプ
ロラミンはゼイン（ｚｅｉｎ）と呼ばれる。ゼインはα
、β、γの３種に分けられる（Ｊ、ＣｅｖｅａｌＳｃｉ
、　５　、１１７（１９８７））。γ−ゼイン中にはＶ
ａｌ−ｆｌｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを基
本単位とする繰り返し構造が含まれている（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３　（５）。

１４９３　（１９８５））。

〔発明が解決しようとする課題〕

新規有用な血圧降下剤ひいてはアンジオテンシン変換酵
素阻害剤は常に求められている。また医薬品としてのみ
ならず、日常の摂取を通して高血圧等の種々の症状の予
防等を図る機能性食品ももとめられる昨今である。

従って本発明は優れたアンジオテンシン変換酵素阻害作
用ならびに血圧降下作用を有し、安全性が極めて高く、
医薬品としてのみならず機能性食品としても使用可能な
特定のオリゴペプチド系アンジオテンシン変換酵素阻害
剤を提供することを目的とする。また本発明は、優れた
アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、安全性が極
めて高く、安価かつ大量に供給でき、医薬品としてのみ
ならず機能性食品としても有用なアンジオテンシン変換
酵素阻害剤を提供することをも目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らはＡＣＥ阻害活性を有する物質を種々検索し
た結果、安価で最も一般的な食品用タンパク質であると
うもろこしタンパク質中のγ−ゼインを特定のプロテア
ーゼで加水分解して得られる一定のペプチド、またはゼ
インの特定のプロテアーゼによる一定の加水分解物がア
ンジオテンシン変換酵素阻害活性を有すること、及び該
ペプチドまたは加水分解物を用いることによって上記課
題を解決できることを見出した。

すなわち請求項１記載の本発明はγ−ゼインをサーモラ
イシンで加水分解し、ついでさらに酵素的にまたは酸で
加水分解することによって得られる、Ｃ末端アミノ酸配
列がＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏであるアミノ酸重合度３〜
５のペプチドの少なくとも１種を含有するアンジオテン
シン変換酵素阻害剤を提供し、請求項２記載の本発明は
サーモライシンまたはパパインによるゼインの加水分解
物であって分子量が２００〜５，０００のペプチド含有
量が固形物基準で３０重重量以上である加水分解物を有
効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤を提供す
る。

以下、本発明を特徴する 請求項１記載の本発明に使用するＴ−ゼインとしてはと
うもろこし、またはコーンスターチの製造過程で得られ
るとうもろこしタンパク質から分離したゼインタンパク
質から、常法に従って分離することができる（例えばＰ
ｌａｎＬ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、＋８（Ｌ６２３　（１９８
６）　）、また参考例１にＴ−ゼインの調製例を示す。

請求項１記載の発明における加水分解は次の工程によっ
て行われる。

ａ）　　７−ゼインはまずサーモライシン加水分解に付
してＶａｌ−１１ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏを生成させる。

すなわちまずγ−ゼインを水酸化ナトリウム水溶液等の
アルカリ溶液に溶解し、限外濾過により可溶化した低分
子夾雑物を除去する。ついで必要に応じｐＨ１０〜１２
．温度８０〜１００°Ｃで　５分〜１時間処理する等し
てＴ−ゼインを変性させ、サーモライシンを働きやすく
する。この際低分子化した両分は限外濾過により除く。

ついでｐＨを塩酸等で中性近辺に調整し、Ｃａ”含有緩
衝液でｐＨを６〜９に調整し、温度を３０〜８０°Ｃに
保ち、サーモライシンを加え１〜４０時間酵素反応を行
わせる。緩衝液としては０．００５〜０、ＯＩＭＣａＣ
Ｉｚ含有０．０５Ｍ　ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜８
．５）等が好適に用いられる。サーモライシンの使用量
は基質１００重量部に対し０．１〜１０重量部が適当で
ある。反応は例えば塩酸等の酸を添加してｐＨ３以下と
して酵素を失活させることにより終了させる。

反応後酵素液を限外濾過に付して通過する低分子含有濾
液を回収する。水酸化ナトリウム等のアルカリ水溶液で
濾液を中和後、濃縮し、カラムクロマトグラフィー、例
えばセファデックスＬｌ＋−２０カラムクロマトグラフ
ィーに付し、各両分のＨＰＬＣによる溶出パターンを合
成Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの
それと比較することにより、Ｖａｌ−旧５−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ含存溶液を得る。このものはカラ
ムクロマトグラフィー、例えばＳＰ−トヨパール６５０
Ｓ陽イオン交換クロマトグラフイー、逆相系ＨＰＬＣな
どによりさらに精製することができる。

ｂ）　次にＶａｌ−■５−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏをロイシンアミノペプチダーゼで加水分解してｌ１
ｊｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＰｒｏまたはＬｅｕ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを生成させる。

この酵素反応は通常、ｐＨ６〜９の緩衝液中、３０〜６
０’Ｃで１〜２４時間行う。緩衝液としては０．０５Ｍ
　ＭｇＣ１ｚ含有０．１Ｍ　トリス塩酸（ｐＨ８，６）
等を使用する。ロイシンアミノペプチダーゼの使用量は
基質１００重量部に対し、０．１〜１０重量部が適当で
ある。

反応は例えば１００　”Ｃで５分間加熱するなどして終
了させる０反応終了液から目的物の単離精製はカラムク
ロマトグラフィー、例えば逆相系ＨＰＬＣなどによって
行うことができる。目的物質の追跡はａ）の場合と同様
合成ペプチドのＨＰＬＣ溶出パターンの比較によって行
うことができる。

Ｃ）　次にＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ　、■５−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏまた
はＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏをカルボキシペプチ
ダーゼＣで加水分解するが、温和な酸加水分解に付する
ことにより各Ｃ末端Ｐｒｏを１つ外す。この酵素反応は
通常ｐＨ４〜７の緩衝液中３０〜６０″Ｃで１〜２４時
間行う。緩衝液としては０．１Ｍクエン酸緩衝液等を使
用する。カルボキシペプチダーゼＣの使用量は基質１０
０重量部に対し０．１〜１０重量部が適当である。反応
は例えばｌＯｏ″Ｃで５分間加熱する等して終了させる
。

酸加水分解は通常、濃度０．１〜６規定の塩酸等の酸を
用い、温度８０〜１２０°Ｃで５〜１２０分行う。

反応は水酸化ナトリウム水溶液等で中和することにより
終了させる。

いずれの場合も反応終了液から目的物の単離精製はカラ
ムクロマトグラフィー、例えば逆相系＋１　Ｐ　Ｌ　Ｃ
などによって行うことができる。目的物質の追跡はａ）
の場合と同様合成ペプチドのＨＰＬＣ溶出パターンの比
較によって行うことができる。

なお、上記ｂ）の工程は必要に応じ行う。またｂ）とＣ
）の工程を共に行う場合いずれを先に行ってもよい。

上記によって得られる請求項１記載のアミノ酸重合度３
〜５のペプチドはＡＣＥ阻害活性を示す。

これらのペプチドをＡＣＥ阻害剤として使用する場合、
これらのペプチドは単独で含有されていてもよく、また
任意の割合の混合物として含有されていてもよく、さら
に加水分解物由来の他のペプチド、アミノ酸をマイナー
成分として含有していてもよい。

請求項１のペプチドはそのまま、または通常少な（とも
１つの製薬補助剤と製薬組成物にして使用する。

請求項１のペプチドは非経口的（すなわち、静脈注射、
直腸投与等）または経口的にヒトをはじめとする補乳頻
に投与し、各投与方法に適した形態に製剤することがで
きる。

注射剤としての製剤形態は、通常滅菌水水溶液を包含す
る。上記形態の製剤はまた緩衝剤・ｐＨ調節剤（リン酸
水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤（塩化ナトリ
ウム、グルコース等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メ
チル、Ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル等）等の水以外
の他の製薬補助剤を含有することができる。該製剤は細
菌保持フィルターを通す濾過、組成物への殺菌剤の混入
、組成物の照射や加熱によって滅菌することができる。

該製薬はまた殺菌固体組成物として製造し、用時滅菌水
等に溶解して使用することもできる。

経口投与剤は胃腸器官による吸収に適した形に製剤する
。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉末剤は常用の
製薬補助剤、例えば結合剤（シロップ、アラビアゴム、
ゼラチン、ツルピント、トラガカント、ポリビニルピロ
リドン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、賦形剤（
ラクトース、シュガー、コーンスターチ、リン酸カルシ
ウム、ソルビット、グリシン等）、滑沢剤（ステアリン
酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シ
リカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、カルボキシメチル
セルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）
を包含することができる。錠剤は常法によりコーティン
グすることができる。

経口液剤は水溶液等にしたり、ドライプロダクトにする
ことができる。そのような経口液剤は常用の添加剤例え
ば保存剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロ
ピル、ソルビン酸等）を包含していてもよい。

請求項１のＡＣＥ阻害剤中の本ペプチドの量は種々かえ
ることができるが、通常１〜１００％（ｗ／ｗ）が適当
である。本ＡＣＥ阻害剤の投与量は有効成分として０．
５〜５００ｍｇ７ｋｇ／ｄａｙが適当である。

なお、請求項１のペプチドの急性毒性はいずれもＬＤ５
゜（ラット、経口投与）　＞　５ｇ／ｋｇである。

また、請求項１のペプチドは多量に摂取しても生体に悪
影響を与えない利点を有することから、そのまま、また
は種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品中に含有せ
しめて血圧降下作用、高血圧予防の機能をもたせた機能
性食品、健康食品として食してもよい。すなわち、例え
ば各種ビタミン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、例
えば栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各種
形状の固形食品、さらには粉末状としてそのままあるい
は各種食品へ添加して用いることもできる。

かかる機能性食品、健康食品としての請求項１のＡＣＥ
阻害剤中の本ペプチドの含有量、及び摂取量は上記製薬
におけると同様でよい。

次に請求項２記載の本発明について説明する。

この発明に使用するゼインはα−ゼイン、β−ゼイン、
Ｔ−ゼイン各単独でもよいし、２また３の混合物であっ
てもよい。これらのゼインは市販のものでもよいし、ま
たコーンスターチの製造過程で得られるとうもろこしタ
ンパク質から分離したゼイン、またはそれから公知の手
法で分離した（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、、ＩＱ
、　６２３　（１９８６））各α−１β−Ｔ−ゼインで
あってもよい。参考例２にβ−ゼインの製造例を示す。

請求項２の発明で使用される酵素はサーモライシンまた
はパパインである。

次に加水分解の条件としては、分子量２００〜ｓ、　ｏ
ｏｏのペプチドを蚤加水分解固形物に対する割合で３０
重量％（以下％と略称する。）以上含むような加水分解
物が得られる条件であれば特に限定はない。

具体的には、基質濃度は反応時に攪拌混合ができる範囲
内であればいずれでも良いが、攪拌が容易なタンパク質
濃度２〜２０％の範囲で行うのが好ましい。酵素の添加
量は使用する酵素の力価により異なるが通常はタンパク
質当たり０．０１％以上、好ましくは、０．１〜１０％
が適当である。反応のｐＨ、温度は各々の酵素により異
なるが、各々の至適ｐｔ＋、至適温度付近を用いればよ
く、サーモライシンでは９１１６〜９、温度３０〜７０
°Ｃ、パパインではｐＨ５〜８、温度３０〜６０″Ｃが
適当である。反応時間は酵素の種類、添加量、反応温度
、反応ｐＨによって異なるため一定ではないが、通常は
１〜４０時間程度である。

加水分解反応の停止は、反応混合液の加熱あるいはクエ
ン酸、リンゴ酸等の有機酸または塩酸、リン酸等の無機
酸または水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカ
リの添加によるｐＨの変化などによる酵素の失活、限外
濾過膜等による酵素の濾別など公知の方法に従って行う
ことができる。

反応混合液はそのままで優れたＡＣＥ阻害作用を有する
が、遠心分離または濾過等公知の固液分離法により固形
分を除去して用いることもできる。

固形分除去したかまたは除去しない該加水分解物は液体
としてそのまま使用することもでき、又必要に応じて脱
色、脱塩等の操作を行った後、噴霧乾燥あるいは凍結乾
燥等の公知の乾燥法によって粉末として使用することも
できる。上記した操作によって分子量が２００〜ｓ、ｏ
ｏｏのペプチドの含有量が全加水分解固形物基準で３０
重量％以上であるゼイン（α、β、γ−ゼイン各単独、
またはその任意の混合物）の加水分解物が得られる。な
お、上述したところから明らかなように本加水分解物は
固体状であっても液状であってもよい。

請求項２の加水分解物は限外濾過、ゲル濾過等により高
分子量部分、及びまたは低分子量部分（アミノ酸等）を
カットしたものであってもよい。

例えばα−ゼインについての本加水分解終了液を分画分
子１ｉ１０．０００の膜を用いて限外濾過して得られる
膜通過画分は分子１５．０００を越えるペプチド、及び
分子Ｍ２Ｏ０未満のペプチド及びアミノ酸を実質上殆ど
含有しないが、かかる両分またはその精製物、粉末化物
も請求項２のＡＣＥ阻害剤の有効成分として用いること
ができる。

請求項２の加水分解物はそのまま製薬組成物として、ま
たは少なくとも１つの製剤補助剤と製薬組成物にして使
用する。請求項２の加水分解物は非経口的（すなわち、
静脈注射、直腸投与等）または経口的にヒトをはじめと
する哺乳類に投与し、各投与方法に適した形態に製剤す
ることができる。

注射剤及び経口投与剤の製造、製剤補助剤例は請求項１
の発明と同様でよい。

請求項２のＡＣＥ阻害剤中の加水分解物の量は種々かえ
ることができるが、通常加水分解物（固形物）として１
〜１００％が適当である０本ＡＣＥ阻害剤の投与量は加
水分解物（固形物）として０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ／
ｄａｙが適当である０本加水分解物は毒性を有さない。

例えば実施例３．４で得られる加水分解物（高分子量カ
ット）の急性毒性はいずれもＬＤ、。（ラット、経口投
与）＞５ｇ／ｋｇである。

また、請求項２の加水分解物は多量に摂取しても生体に
悪影響を与えない利点を有することから、請求項１のペ
プチドと同様、そのまま、または種々の栄養分等を加え
て、もしくは飲食品中に含有せしめて血圧降下作用、高
血圧予防の機能をもたせた機能食品、健康食品として食
してもよい。かかる食品としての請求項２のＡＣＥ阻害
剤中の本加水分解物の含有量及び摂取量は製薬における
と同様でよい。

〔実施例］ 次に本発明を実施例により説明する。

実施例中　％は重量％を示す。

Ｗ−上　　各オリゴペプチドの調製とＡＣＥ阻害活性 ａ）　　Ｖａｌ−１１ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏの調製Ｔ−ゼイン０．５ｇを蒸留水２５ｄに分散
させ、ＩＮ　ＮａＯＨで９１１１２に調整しＴ−ゼイン
を溶解させた。

ついで限外濾過膜としてアミコン社ＰＭ−１０（分画分
子量１０．０００）を用いる限外濾過に付し、可溶化し
た低分子夾雑物を除去した。内液にｐ　Ｈ１２のＮａＯ
Ｈを加え全容２５ｄとし、１００″Ｃで３０分加熱しＴ
−ゼインを変性させた。この処理で低分子化した両分を
除去するため再度上記と同じ限外濾過に付し、内液に蒸
留水を加え全容２５ｄとし、さらにＩＮ　ｌｌＣｌで中
性にした。

全容に対し０．２５容の０．０５Ｍ　ＣａＣ１ｚ含有０
．２５Ｍ　　ト’Ｊ　７！、ｌｌＣｌ　ｌｉ衝液（ｐＨ
８，５）を加え、３７°ｃに保った後、サーモライシン
（シグマ社）１８ｍｇを加えた。４０時間後、ＩＮ’１
ｌＣ１でｐＨ１，７に調整して反応を停止させ、前記と
同じ限外濾過に付して通過する低分子を回収した。これ
をＩＮ　Ｎａ０Ｉｌで中和後、濃縮し濃縮液をセファデ
ックスＬｌｌ〜２０のカラムに添加し蒸留水で溶出させ
た（溶出条件二カラム高さ７０ｃｍ、内径１．６ｃｍ　
、試料添加１２Ｉｎｌ、ｍ速３３ｍｆ／ｈｒ）。

各百分の少量を用いてＨＰＬＣによる溶出パターンを調
べ、合成　Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏが示す溶出位置と同位置のピークを持つ両分を回
収した（ＨＰＬＣの溶出条件二カラム　ウォーターズ社
Ｒａｄｔａｌ　ＰＡＫ　Ｃ−８＋　　１０　ｕ　１ｍ、
　　試料添加９５　ｕ　ｆｉ。

流速１　ｍ／ｍｉｎ、溶出リン酸緩衝液（ｌｏｍＭ　Ｋ
ＩＩｚＰＯ４゜５抛Ｍ　Ｎａ２ＳＯ２，ｐＨ３，０）　
ニアセトニトリル−２：３、検出ＵＶ２１０ｎｍ）　。

この両分を５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）で平衡化し
たｓｐトヨパール６５０５カラムに添加し、０〜０．３
ＭＮａＣ１の直線濃度勾配で溶出し、ＨＰＬＣにて合成
Ｖａｌ−１１ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏと
同位置に溶出されるピークをもつ両分を回収した（ＳＰ
−１−ヨパール溶出条件：カラム高さ２０ｃ＋ｓ、内径
１．６ｃｍ　、流速Ｌｏｏｍ／ｈｒ　、溶出５ａ＋Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４，０）を含む０〜０．３Ｍ　ＮａＣ１
、ＩＩＰＬＣの溶出条件は前記と同じ）。

回収した両分を濃縮後、）ＩＰＬｃに付して合成νａｌ
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏと同位置のピ
ークのみを分取し、ｐＨ２のＨＣＩで洗浄した逆相シリ
カゲルカラム５ｅｐＰＡＫ　Ｃ−１８（ウォーターズ社
）に吸着させ、ρ１１２のＩＩｃＩで混在する塩を除去
した後、メタノールで溶出させ、アミノ酸分析を行った
（分取時の１１ＰＬｃ溶出条件：試料添加量のみ２５μ
２で他は最初の場合の条件と同じ）。上記でアミノ酸分
析は試料を６Ｎ　ｌｌＣｌに溶解し、真空下１１０　’
Ｃで２４時間加熱後アミノ酸分析計により行った。

この結果Ｌｅｕを１としたモル比がＶａｌ　１．３、Ｈ
ｉｓ　１．２　、Ｌｅｕ　１　、　Ｐｒｏ　３．１とな
り、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
が回収できた。

また、質量分析の結果は６５９（Ｍ＋１）　”であり、
上記ペプチドの予想分子量と一致した。

ｂ）　Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの調製ロイシン
アミノペプチターゼ（ベーリンガーマンハイム山之内１
社）（５ｍｇ／＃２１！液状）を０．０５Ｍ　ＭｇＣ１
ｚ含存０．１？Ｉ）ＩＪス塩酸（ｐＨ８，６）８００μ
ｌに溶解し酵素液とした。

３００　μＭ　Ｖａｌ−旧５−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ　５０ｕｌと酵素液２００μｌを混合し、３７
°Ｃで２３時間反応させた。

反応後、反応液よりＩＩＰＬｃで合成Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ｐｒ。

と同位置に溶出されるピークを回収しアミノ酸分析を行
った（Ｉｌｒ’ＬＣ溶出条件：使用するリン酸緩衝液の
ｐＨを２．５としたこと、及び試料添加量を１０μ２と
した以外は最初の場合の条件と同じ）。

この結果Ｌｅｕを１としたモル比がＶａｌ　Ｏ，１６、
Ｌｅｕ　ｌ　、ｔｌｉｓ　Ｏ，１９、Ｐｒｏ　２．５１
となり、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏが回収できた
。

ｃ）　　Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの調製６．３ｎ＋Ｍ　
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　２００　／／　ｌと
１２Ｎ　ＨＣｌ２００μｌを混合し、１００　’Ｃで１
０分加水分解反応に服せしめた。ついでＨＰＬＣによる
溶出で合成Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏと同位置のピーク（
３，１８ｓ＋ｍ）をもつ画分が回収できた。

（溶出条件二カラム　メルク社Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　
ＲＰ−Ｓｅｌｅｃｔ　Ｂ　５μｌｌ　、流速ｌａｄ／ｗ
ｉｎ、溶出　リン酸緩衝液（ｐＨ２，５）ニアセトニト
リ／Ｌ／＝５：ｌ、検出ＵＶ２１０ｎａ＋）。

ｄ）　　Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの調
製Ｖａｌ−１１ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
より上記Ｃ）と同様にして得た。

ｅ）　　ＡＣＥ阻害活性の測定 以上のようにして得た各ペプチドのＡＣＥ阻害活性を以
下のごとく測定した。すなわちまず、５ｇのラビットラ
ングアセトンパウダーを５０ｄのＯ，ＩＭホウ酸ナナト
リウム緩衝液ρＩ＋　８．３）に溶かし、４０．０ＯＯ
Ｇ　、４０分の条件下で遠心処理し、その上澄液をさら
に上記緩衝液で５倍に希釈して、アンジオテンシン変換
酵素液を得た。

各ペプチド溶液を試験管に０．０３ｄ入れ、これに基質
として、０．２５ａｇのヒブリルヒスチジルロイシン（
最終濃度５ｍＭ　、ＮａＣ１３００ｍＭ含む）を添加し
、ついで上記アンジオテンシン変換酵素液０．１Ｍ１を
加え、３７℃で３０分間反応させた。その後、ＩＮ塩酸
０．２５ｄを添加して反応を停止させた後、１．５　ｄ
の酢酸エチルを加え、酢酸エチル中に抽出されたヒプリ
ル酸の２２８ｎａ＋での吸収値を測定し、これを酵素活
性とした。なお、この条件で本発明阻害剤を含まない場
合の２２８ｎｍの吸収値はほぼ０．３５であった。

このような実験を複数行い、阻害率を次の式より算出し
た。

Ａ：阻害剤を含まない場合の２２８ｎｍ吸収値Ｂ：阻害
剤添加の場合の２２８ｎｍ吸収値そして、阻害率５０％
のときの阻害剤濃度Ｉ、。

を求めた。

結果は以下の通りであった。

■、。（μＭ）備考 Ｖａｌ−１１ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　　　　　
　　１８　　　本発明しｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　　　　
　　　　　　　　　　　９．６　　　　　　　ｔｔＶａ
ｌ−Ｈｉｓ−Ｌａｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　　　　
２００　　　比較例Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　
（１ｍＭで３３χ阻害）〃ｎｕ　　　Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏの血圧降下作用体重２００ｇのＷｉｓｔａｒ系雄
性ラット（日本ラット（株）、１群５匹）をウレタン１
．５ｇ／ｋｇ腹腔内投与により麻酔し、常法に従って総
頚動脈圧をトランスデユーサ−（ＳＣＫ−５９０，日本
光電（株））を介して連続的に記録した。下腿静脈より
、生理食塩水に溶解したＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを投与
し、その５．１５．２５および３５分後にアンジオテン
シンＩ（ヒト配列。

シグマ社）ｌｏＯｎｇ／ｋｇを繰り返し投与して、前後
の平均血圧の変化を測定した。対照としては、生理食塩
水を投与したものを用いた。

結果を表−１に示す。

本ペプチドは投与５分後のアンジオテンシンＩによる昇
圧有効果的に抑制し、その作用は３５分後にもなお持続
していた。

表−１ 上段：最高血圧　　下段：平均血圧 １遊」［−ユ α−ゼイン（シグマ社）を２％濃度になるように５０＋
＋＋Ｍ　）リス塩酸（ｐＨ８，０）に加え、トリプシン
、キモトリプシン（ともにＰ−Ｌハイオケミカルズ社）
ズプチリシンカールスバーグ（シグマ社）またはパパイ
ン（シグマ社）を０．２％濃度になるように加え、３７
゛Ｃで２０時間酵素反応を行った。

別に５ｍＭ塩化カルシウム含有５０ｍＭ　）　’Ｊス塩
酸（ｐＨ８，ｏ）　と０．２％サーモライシン（シグマ
社）との組合わせ、０．０５７Ｎ塩酸と０．２％ペプシ
ン（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社）との組合わせ、または
１０ｍＭホウ酸塩（ｐ）１１２．０）との０．２％アル
カリプロテアーゼ（東洋紡（株））との組合わせをそれ
ぞれ用いて上記と同様に酵素反応を行った。

酵素反応液を限外濾過に付しくミリポア社モルカット使
用、分画分子量１０，０００）　、膜を通過した画分を
回収した。

次に上記各両分について実施例１と同様の方法によって
ＡＣＥ阻害活性を測定した。またサーモライシン及びパ
パインの場合の上記各両分について分子量２００〜ｓ、
　ｏｏｏのペプチドの割合及び加水分解前のα−ゼイン
全量に対する分子量２００〜５．０００のペプチドの割
合を以下の方法により調べた。

すなわち、セファデックスｃ−２５（ファイン）のカラ
ム（１３＋＋＋ｌＩ＋　Ｘ　　８２０ｍｍ）に予め分子
量既知の標準品を流しく溶媒　０．１Ｍ酢酸アンモニウ
ム　）分子量と溶出位置の関係を決定した。用いた標準
品及びその分子量は次の通りである。

リボヌクレアーゼＡ　　　　　　　　Ｉ３，７００アプ
ロチニン　　　　　　　　　　６，５００グイノルフィ
ン八　　　　　　　　　２．１４７バシトラシン　　　
　　　　　　　１，４１１オキシトシン　　　　　　　
　　　１，００７グリシルグリシルアラニン　　　　　
２０３次に同一条件下に前記膜通過画分を流して得たゲ
ル濾過パターンから、膜通過画分はサーモライシン及び
パパインのうちいずれの酵素を使用した場合にも実質上
分子量２００〜５．０００のペプチドからなっており、
５，０００を越えるペプチド、２００未満のペプチド、
アミノ酸を殆ど含有していないことが明らかになった。

次にサーモライシン及びパパインについて得られた膜通
過画分中の窒素量（ミクロケルプール法による）を分解
前のα−ゼインの窒素量で除することにより原料α−ゼ
インに対する分子量２００〜５，０００のペプチドの割
合を求めた。

得られた結果を表−２にまとめて示す。

表−２ サーモライシン パパイン ペプシン ズブチリシン キモトリプシン アルカリプロテアーゼ トリプシン 本発明 比較例 β−ゼイン（参考例２で調製のもの）またはγゼイン（
参考例１で調製のもの）を２％濃度になるように５ｍＭ
塩化カルシウム含有５０ｍＭ　）リス塩ｕ　（ｐＨ８，
０）に加え、サーモライシン（シグマ社）を０．２％濃
度になるように加え、３７°Ｃで２０時間酵素反応を行
った。

得られた酵素反応液を実施例３と同様に限外濾過に付し
て得た画分を用いて実施例３と同様にして求めた該両分
のＡＣＥ阻害活性（Ｉ５゜）はβゼインでは５０μｇ／
ｒｄ、　　γ−ゼインでは１１０μｇ／成、及び各原料
ゼインに対する分子ｆｆ１２００〜５，０００のペプチ
ドの割合（固形分基準）はβ−ゼインでは７５％、γ−
ゼインでは５８％であった。

裏音拠−１静脈注射剤 Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを２０〜ｌＯＯ倍（容積／重量
）の滅菌生理食塩水に溶解し、無菌的にフィルター（孔
径０．４５μｍ）で濾過した濾液を注射剤とする。

旦」 スｊ首激２−　　錠剤 Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　　　　　　　　　７部ヒドロ
キシプロピルセルロース　　　１部ラクトース　　　　
　　　　　　　１０．９部ポテトスターチ　　　　　　
　　　　１部ステアリン酸マグネシウム　　　　０．１
部ヒドロキシプロピルセルロース１部を含む６０％エタ
ノール水溶液２０部を調製し、本ペプチド７部およびラ
クトース１０．９部を加えて充分に混練した後、減圧下
で乾燥し、得られた乾燥物にポテトスターチ１部および
ステアリン酸マグネシウム０．１部を加えて混和し、打
錠機により製錠する。

尖施■−１静脈注射剤 実施例３で得られた膜通過画分（凍結乾燥品）を２０〜
１００倍（容積７重Ｍ）の滅菌生理食塩水に溶解し、無
菌的にフィルター（孔径０．４５μｍ）で濾過した濾液
を注射剤とする。

ヒドロキシプロピルセルロース　　　１部ラクトース　
　　　　　　　　　　１２．９部ポテトスターチ　　　
　　　　　　　１部ステアリン酸マグネシウム　　　　
０．１部ヒドロキシプロピルセルロース１部を含む６０
％エタノール水溶液２０部を調製し、本加水分解物５部
およびラクトース１２．９部を加えて充分に混練した後
、減圧下で乾燥し、得られた乾燥物にポテトスターチ１
部およびステアリン酸マグネシウム０．１部を加えて混
和し、打錠機により製錠する。

参］」Ｌ−一上　　　Ｔ−ゼインの調製Ｅｓｅｎの方法
（Ｊ、Ｃｅｒｅａｌ　Ｓｃｉ、５．１１７　（１９８７
））に準じて行った。粉砕とうもろこしく普通種プント
コーン）１０ｈに１χ２−メルカプトエタノールを含む
６０χイソプロピルアルコ一ル水５倍量を加え、６０°
Ｃで２時間攪拌することにより全ゼイン画分を抽出した
。混合物を３，０ＯＯＧで１０分遠心分離し、上清に等
容の蒸留水及び０．０２容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液
を加え、少量の酢酸でｐＨを６に合わせ４．°ｃで−晩
装置してαおよびβ−ゼインを沈澱させた。

ついで３，０ＯＯＧで１０分遠心分離し、上清を凍結乾
燥し、乾燥物を少量の蒸留水に分散させ、透析チューブ
を用いて蒸留水に対して透析し、ついで凍結乾燥して、
淡黄色粉末としてγ−ゼイン０．４ｇを得た。

葺（陥−−Ｉ　　　β−ゼインの調製 Ｅｓｅｎの方法（参考例１と同文献）に準じて行った。

参考例１で沈澱させたα及びβ−ゼイン混合物を回収し
、２％２−メルカプトエタノールを含む６０％イソプロ
ピルアルコール水を５倍量加え、α及びβ−ゼイン両者
とも再溶解せしめた後、３倍量のイソプロピルアルコー
ルを加えα−ゼインのみ沈澱させた。３０００Ｇで１０
分遠心分離して上清を回収し、以下γ−ゼ・インと同様
に透析、凍結乾燥を経て淡黄色粉末のβ−ゼイン０．６
ｇを得た。

〔発明の効果〕

請求項１記載の本発明によれば優れたＡＣＥ阻害作用な
らびに血圧降下作用を有するＡＣＥ阻害剤が提供される
。

請求項２記載の本発明によれば最も一般的な食品タンパ
ク質であるとうもろこしタンパク質中のゼインからＡＣ
Ｅ阻害剤を安価かつ大量に提供することが可能である。

また請求項１及び２記載のＡＣＥ阻害剤は共に食品タン
パク質由来のため大量に摂取しても極めて安全性が高く
、従って副作用を示すこともない。

またゼインの加水分解物を含有するＡＣＥ阻害剤は特開
昭６２−１６９７３２号に記載の魚類タンパク質または
大豆クンバク質の加水分解物を含有するＡＣＥ阻害剤に
比し、より高いＡＣＥ阻害活性を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、γ−ゼインをサーモライシンで加水分解し、ついで
   さらに酵素的にまたは酸で加水分解することによって得
   られる、Ｃ末端アミノ酸配列がＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
   であるアミノ酸重合度３〜５のペプチドの少なくとも１
   種を有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素
   阻害剤。 ２、サーモライシンまたはパパインによるゼインの加水
   分解物であって分子量が２００〜５，０００のペプチド
   含有量が固形物基準で３０重量％以上である加水分解物
   を有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻
   害剤。