CN102872446B - 一种抗栓、溶栓口服液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗栓、溶栓口服液的制备方法，是将新鲜鸡蛋去卵黄取卵清，用NaOH溶液调节pH，加热使卵清变性，用HCl溶液降低pH，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶的混合物酶解变性卵清蛋白，期间采用“顺、反转，间歇式”方式以500r·min^-1速度搅拌，酶解完成之后灭活蛋白酶，冷却至室温；酶解清液真空浓缩后，加适量甜蜜素、柠檬酸及无菌水制成产品；本方法简单易行，生产周期较短，节省设备投资；鸡卵清经过胃蛋白酶、胰蛋白酶的混合酶酶解，产生的抗凝血酶活性小肽量明显增加，有利于产品质量的提高。

Description

一种抗栓、溶栓口服液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗栓、溶栓口服液，具体涉及一种利用鸡卵清蛋白酶解物制备抗栓、溶栓口服液的方法，属于医药、保健食品生产技术领域。

背景技术

世界上心脑血管疾病的死亡率一直居于前二位，全世界每年死于该类疾病的人数超过1500 万，其中血栓栓塞性心脑血管疾病发病率和死亡率最高。据卫生部统计，我国每年死于心脑血管疾病约200 万人，超过全部死亡病人的50%。心脑血管疾病中有很大比例是血栓病，并以血栓病的发病率、致残率和死亡率最高，其病因是血栓的形成。血栓性疾病治疗的最有效办法是溶栓治疗，人类每年需要为该类疾病支出巨额药费。

导致血管内血栓形成虽有多种因素，但凝血酶诱发的血液凝固是血栓形成的主要触发机理。血栓对血液的流动产生阻碍，使相应的组织、器官出现不同程度的栓塞，之后会因缺乏氧和营养成分而导致一系列临床症状的出现：如果血管栓塞发生在脑动脉，脑就会因为梗塞突然偏瘫失语，甚至死亡；如果血管栓塞发生在心脏血管的重要部位，心脏就会因血液供应中断而停止跳动，导致猝死等等。血栓相关疾病起病隐匿，发病急骤，致残致死率高，血栓是心脑血管疾病致人死、残的元凶。

当前，国内外治疗血栓栓塞性心脑血管疾病主要使用肝素类产品。但肝素的疗效不理想而且副作用较大，急需替代的产品。

水蛭素是水蛭唾液腺内一类相对分子质量约7 000 的多肽，研究发现，水蛭素是凝血酶的特效抑制剂，它主要通过靠近肽链C-端的由3～4 个酸性氨基酸组成的活性部位与凝血酶富含碱性氨基酸的活性部位特异性结合。试验结果表明，水蛭素既能防止新的血栓形成，还能使已形成的血栓溶解，对多种血栓疾病都具有极好的预防和治疗作用。CN1864731A公开了一种抗栓降脂降压口服液，CN1325699也公开了一种溶栓灵口服液，由地龙、水蛭及其它中草药成分组成，口服给药虽然方便，但因水蛭素被患者胃肠道水解，会丧失抗栓、溶栓的效果；虽然注射给药疗效很好，但反复注射会给患者带来很大的痛苦和不便，难以适应大多数慢性高凝态患者长期抗凝治疗的需要。而且水蛭饲养成本较高，水蛭素提取工艺复杂、设备投入大，注射剂价格较高，患者承受的经济压力大。

CN102475340A公开了一种柚汁溶栓口服液，由柚子汁加工而成，由其本身所含营养物质和生理活性起到抗栓的效果。鸡蛋营养丰富，卵清的蛋白质含量约10％，在蛋白酶的作用下，蛋白质可被水解为肽，近年研究发现，2～3 肽能被人体完全迅速吸收，4 肽、5 肽甚至6 肽都能被动物直接吸收。目前，国内一些学者进行过鸡卵清蛋白酶解物实验及产物的功能特性研究，杨万根等发表的《膜反应器制备的蛋清水解物的营养评价》、《蛋清蛋白酶解物的抗氧化、抗凝血活性及生化特性的研究》、《酶膜反应器制备抗凝血酶蛋清水解物的研究》分别用Alcalase 2.4L 碱性蛋白酶、Protease N蛋白酶及用Protease N蛋白酶制成的酶膜生物反应器处理鸡卵清蛋白，得到的酶解物均具有较强的抗凝血酶活性。但是，由于他们在酶解过程中，每个酶解体系只使用1 种蛋白酶，所以蛋白质的水解度不高，水解物中含2～4 个氨基酸残基的肽（2～4 肽）含量较低（约为71％），鸡卵清蛋白中具有抗栓、溶栓活性的肽段未能充分释放出来。为了克服此不足，本发明人模拟蛋白质在人体内消化的条件，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶这两种酶组成的混合酶解体系水解鸡卵清蛋白制备抗凝血酶活性肽，并以此为主要原料，加上一些辅料制备抗栓、溶栓口服液。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，模拟蛋白质在人体内消化的条件，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶这两种酶组成的混合酶解体系水解鸡卵清蛋白制备抗凝血酶活性肽，并以此为主要原料，加上一些辅料制备抗栓、溶栓口服液，该口服液抗血栓及溶解血栓效果好、使用方便快捷、价格低、安全可靠，可以消除血栓栓塞性心脑血管疾病患者痛苦。

本发明的另一个目的是在克服现有酶解法处理卵清蛋白不足，在其基础上进一步改进，提供一种抗栓、溶栓口服液的制备方法。

为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：

（1）取卵清：将新鲜鸡蛋破壳，慢慢倒出内容物，小心取出卵黄，收集卵清，称重；按卵清的质量加入1倍无菌水，300 r·min^-1搅拌10~15 min制成卵清稀释液；

（2）上调pH值：用0.5 mol·L^-1的食品级NaOH溶液调整卵清稀释液的pH值至9~11，得到高pH值的卵清稀释液；

（3）高pH值卵清稀释液热变性：将高pH值卵清稀释液于300 r·min^-1搅拌加热到88～90 ℃，维持25~35min使卵清蛋白质充分变性，取出，自然冷却至室温；

（4）下调pH值：将已充分变性、自然冷却至室温的高pH卵清稀释液使用0.5 mol·L^-1的食品级HCl溶液调整至pH值为7~8，得到变性卵清稀释液；

（5）酶解：根据变性卵清稀释液体积加入胃蛋白酶及胰蛋白酶的混合物酶解，按每升变性卵清稀释液加胃蛋白酶40 000 U、胰蛋白酶50 000 U；两种酶混合均匀后加入适量无菌水调成稀糊状，倒入预热至50 ℃的变性卵清稀释液中，一边加热一边以“顺、反转，间歇式”500 r·min^-1搅拌，按“顺→停→反→停→顺→停→反→停→”方式重复搅拌，即搅拌机以顺转5 min，停1 min，反转5 min，停1 min的方式重复搅拌；酶解期间，适时补充50 ℃的无菌水维持酶解体系体积不变；酶解2.5~3.5h后，迅速升温至100 ℃，保持10~15min以灭活酶，得酶解液；酶解液放冷至室温后，于10 000 r·min^-1离心10~15min去除沉淀收集清液，得卵清酶解清液；用凝血酶滴定改进法测定酶解清液的抗凝血酶活力，以谷胱甘肽（3肽）为对照品进行高效液相色谱定量测定；

（6）真空浓缩：将酶解清液于85～90 Kpa浓缩成活力390～400 抗凝血酶活力单位（ATU）·mL^-1的抗栓、溶栓口服液母液；

（7）配制口服液：根据所需配制的抗栓、溶栓口服液的质量，在抗栓、溶栓口服液母液中加入质量比为0.1‰~0.3‰的甜蜜素和1‰~2‰的柠檬酸，溶解，再加入适量无菌水调至370～380 ATU·mL^-1，混合均匀，即得抗栓、溶栓口服液。

与现有的技术相比，本发明的突出实质性特点和显著的进步是：

（1）以胃蛋白酶及胰蛋白酶组成的双酶混合酶解替代单酶（Protease N）水解显著提高酶解效果，原材料利用率高，产品中2～4 肽含量高，本发明的3 批酶解液中抗凝血酶活力平均365.33 ATU·mL^-1；3 肽的质量分数平均93.82％，3 批酶解液技术数据如下表 1。

表 1  3 批酶解液清液中3 肽占水解物总量的比例以及抗凝血酶活力强度

（2）采用“顺、反转，间歇式”500 r·min^-1搅拌酶解完全可以淘汰超滤步骤。实验结果表明，以本发明的双酶混合酶解技术酶解变性卵清稀释液3 h以后，再以10 000 r·min^-1离心10 min去除酶解液中的沉淀收集清液，结果发现基本无沉淀，说明卵清蛋白质已全部水解成小肽，已不存在用超滤膜将酶解过程中产生的小肽与大分子分隔的必要。

（3）淘汰超滤步骤可以明显减少设备投资。据粗略估算，一个产量0.5 T/h口服液的小型工厂，光是超滤设备就要支付约10 万元。按本发明的生产工艺，在没有增加其他设备的情况下淘汰了超滤步骤，只这一项改革就可以节省投资约10 万元。

（4）本发明制备的口服产品抗血栓及溶解血栓效果好、使用方便快捷、价格低、安全可靠。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

1、新鲜鸡蛋洗净外壳，轻轻磕破蛋壳，慢慢倒出内容物，小心取出卵黄，收集卵清，称质量，去除散黄的鸡蛋。按卵清的质量加入1倍无菌水，300 r·min^-1搅拌10min制成卵清稀释液。

2、用0.5 mol·L^-1的食品级NaOH溶液调整卵清稀释液的pH至9，得到高pH卵清稀释液。

3、将高pH卵清稀释液于加热罐中300 r·min^-1搅拌加热至88℃，维持25min使卵清蛋白充分变性后取出，自然冷却至室温。

4、将已充分变性、自然冷却至室温的高pH卵清稀释液使用0.5 mol·L^-1的食品级HCl溶液调整pH至7，得到变性卵清稀释液。

5、加入一定体积变性卵清稀释液，根据该体积加入适量胃蛋白酶及胰蛋白酶的混合物，其中每升变性卵清稀释液加入胃蛋白酶40 000 U、胰蛋白酶50 000 U。两种酶混合均匀后加入适量无菌水调成稀糊状，倒入预热至50 ℃的变性卵清稀释液中，一边加热一边以500 r·min^-1、按“顺→停→反→停→顺→停→反→停→”方式重复搅拌，即搅拌机以顺转5 min，停1 min，反转5 min，停1 min的方式重复搅拌。酶解期间，适时补充50℃的无菌水维持酶解体系体积不变。酶解2.5h后，迅速升温至100 ℃，保持10min以灭活酶，得酶解液。

6、酶解液放冷至室温后，于10 000 r·min^-1离心10 min去除沉淀收集清液，得卵清酶解清液，用凝血酶滴定改进法测定酶解清液的抗凝血酶活力。

7、酶解清液于85Kpa浓缩至390 ATU·mL^-1，得抗栓、溶栓口服液母液。

8、根据所需配制的抗栓、溶栓口服液的质量，在抗栓、溶栓口服液母液中加入质量比为0.1‰的甜蜜素和1‰的柠檬酸，溶解，再加入适量无菌水调至370 ATU·mL^-1，混合均匀，即得抗栓、溶栓口服液。

9、抗栓、溶栓口服液分装、灭菌、检测。经实际测定，抗栓、溶栓口服液各项微生物指标符合中华人民共和国国家标准保健(功能)食品通用标准（GB 16740—1997）；抗凝血酶活力为370 ATU·mL^-1。

10、包装得到产品。

实施例2

1、新鲜鸡蛋洗净外壳，轻轻磕破蛋壳，慢慢倒出内容物，小心取出卵黄，收集卵清，称质量，去除散黄的鸡蛋。按卵清的质量加入1 倍无菌水，300 r·min^-1搅拌15min制成卵清稀释液。

2、用0.5 mol·L^-1的食品级NaOH溶液调整卵清稀释液的pH至11，得到高pH卵清稀释液。

3、将高pH卵清稀释液于加热罐中300 r·min^-1搅拌加热至90℃，维持35min使卵清蛋白充分变性后取出，自然冷却至室温。

4、将已充分变性、自然冷却至室温的高pH卵清稀释液使用0.5 mol·L^-1的食品级HCl溶液调整pH至8，得到变性卵清稀释液。

5、加入一定体积变性卵清稀释液，根据该体积加入适量胃蛋白酶及胰蛋白酶的混合物，其中每升变性卵清稀释液加入胃蛋白酶40 000 U、胰蛋白酶50 000 U。两种酶混合均匀后加入适量无菌水调成稀糊状，倒入预热至50 ℃的变性卵清稀释液中，一边加热一边以500 r·min^-1、按“顺→停→反→停→顺→停→反→停→”方式重复搅拌，即搅拌机以顺转5 min，停1 min，反转5 min，停1 min的方式重复搅拌。酶解期间，适时补充50 ℃的无菌水维持酶解体系体积不变。酶解3.5h后，迅速升温至100℃，保持15min以灭活酶，得酶解液。

6、酶解液放冷至室温后，于10 000 r·min^-1离心15min去除沉淀收集清液，得卵清酶解清液。用凝血酶滴定改进法测定酶解清液的抗凝血酶活力。

7、酶解清液于90Kpa浓缩至400 ATU·mL^-1，得抗栓、溶栓口服液母液。

8、根据所需配制的抗栓、溶栓口服液的质量，在抗栓、溶栓口服液母液中加入质量比为0.3‰的甜蜜素和3‰的柠檬酸，溶解，再加入适量无菌水调至380 ATU·mL^-1，混合均匀，即得抗栓、溶栓口服液。

9、抗栓、溶栓口服液分装、灭菌、检测。经实际测定，抗栓、溶栓口服液各项微生物指标符合中华人民共和国国家标准保健(功能)食品通用标准（GB 16740—1997）；抗凝血酶活力为380 ATU·mL^-1。

10、包装得到产品。

实施例3

1、新鲜鸡蛋洗净外壳，轻轻磕破蛋壳，慢慢倒出内容物，小心取出卵黄，收集卵清，称质量，去除散黄的鸡蛋。按卵清的质量加入1 倍无菌水，300 r·min^-1搅拌12min制成卵清稀释液。

2、用0.5 mol·L^-1的食品级NaOH溶液调整卵清稀释液的pH至10，得到高pH卵清稀释液。

3、将高pH卵清稀释液于加热罐中300 r·min^-1搅拌加热至89℃，维持30min使卵清蛋白充分变性后取出，自然冷却至室温。

4、将已充分变性、自然冷却至室温的高pH卵清稀释液使用0.5 mol·L^-1的食品级HCl溶液调整pH至7.5，得到变性卵清稀释液。

5、加入一定体积变性卵清稀释液，根据该体积加入适量胃蛋白酶及胰蛋白酶的混合物，其中每升变性卵清稀释液加入胃蛋白酶40 000 U、胰蛋白酶50 000 U。两种酶混合均匀后加入适量无菌水调成稀糊状，倒入预热至50℃的变性卵清稀释液中，一边加热一边以500 r·min^-1、按“顺→停→反→停→顺→停→反→停→”方式重复搅拌，即搅拌机以顺转5 min，停1 min，反转5 min，停1 min的方式重复搅拌。酶解期间，适时补充50 ℃的无菌水维持酶解体系体积不变。酶解3h后，迅速升温至100℃，保持12min以灭活酶，得酶解液。

6、酶解液放冷至室温后，于10 000 r·min^-1离心12min去除沉淀收集清液，得卵清酶解清液。用凝血酶滴定改进法测定酶解清液的抗凝血酶活力。

7、酶解清液于87Kpa浓缩至400 ATU·mL^-1，得抗栓、溶栓口服液母液。

8、根据所需配制的抗栓、溶栓口服液的质量，在抗栓、溶栓口服液母液中加入质量比为0.2‰的甜蜜素和2‰的柠檬酸，溶解，再加入适量无菌水调至3740 ATU·mL^-1，混合均匀，即得抗栓、溶栓口服液。

9、抗栓、溶栓口服液分装、灭菌、检测。经实际测定，抗栓、溶栓口服液各项微生物指标符合中华人民共和国国家标准保健(功能)食品通用标准（GB 16740—1997）；抗凝血酶活力为374 ATU·mL^-1。

10、包装得到产品。

实施例4

1、新鲜鸡蛋洗净外壳，轻轻磕破蛋壳，慢慢倒出内容物，小心取出卵黄，收集卵清，称质量，去除散黄的鸡蛋。按卵清的质量加入1 倍无菌水，300 r·min^-1搅拌14min制成卵清稀释液。

2、用0.5 mol·L^-1的食品级NaOH溶液调整卵清稀释液的pH至10.5，得到高pH卵清稀释液。

3、将高pH卵清稀释液于加热罐中300 r·min^-1搅拌加热至89℃，维持30min使卵清蛋白充分变性后取出，自然冷却至室温。

4、将已充分变性、自然冷却至室温的高pH卵清稀释液使用0.5 mol·L^-1的食品级HCl溶液调整pH至7.6，得到变性卵清稀释液。

5、加入一定体积变性卵清稀释液，根据该体积加入适量胃蛋白酶及胰蛋白酶的混合物，其中每升变性卵清稀释液加入胃蛋白酶40 000 U、胰蛋白酶50 000 U。两种酶混合均匀后加入适量无菌水调成稀糊状，倒入预热至50℃的变性卵清稀释液中，一边加热一边以500 r·min^-1、按“顺→停→反→停→顺→停→反→停→”方式重复搅拌，即搅拌机以顺转5 min，停1 min，反转5 min，停1 min的方式重复搅拌。酶解期间，适时补充50 ℃的无菌水维持酶解体系体积不变。酶解3.2h后，迅速升温至100℃，保持14min以灭活酶，得酶解液。

6、酶解液放冷至室温后，于10 000 r·min^-1离心14min去除沉淀收集清液，得卵清酶解清液。用凝血酶滴定改进法测定酶解清液的抗凝血酶活力。

7、酶解清液于88Kpa浓缩至400 ATU·mL^-1，得抗栓、溶栓口服液母液。

8、根据所需配制的抗栓、溶栓口服液的质量，在抗栓、溶栓口服液母液中加入质量比为0.2‰的甜蜜素和2‰的柠檬酸，溶解，再加入适量无菌水调至375 ATU·mL^-1，混合均匀，即得抗栓、溶栓口服液。

9、抗栓、溶栓口服液分装、灭菌、检测。经实际测定，抗栓、溶栓口服液各项微生物指标符合中华人民共和国国家标准保健(功能)食品通用标准（GB 16740—1997）；抗凝血酶活力为375ATU·mL^-1。

10、包装得到产品。

Claims (1)

1.一种抗栓、溶栓口服液的制备方法，其特征在于:包括以下几个步骤：

（1、新鲜鸡蛋洗净外壳，轻轻磕破蛋壳，慢慢倒出内容物，小心取出卵黄，收集卵清，称质量，去除散黄的鸡蛋，按卵清的质量加入1 倍无菌水，300 r·min^-1搅拌12min制成卵清稀释液；

（2、用0.5 mol·L^-1的食品级NaOH溶液调整卵清稀释液的pH至10，得到高pH卵清稀释液；

（3、将高pH卵清稀释液于加热罐中300 r·min^-1搅拌加热至89℃，维持30min使卵清蛋白充分变性后取出，自然冷却至室温；

（4、将已充分变性、自然冷却至室温的高pH卵清稀释液使用0.5 mol·L^-1的食品级HCl溶液调整pH至7.5，得到变性卵清稀释液；

（5、加入一定体积变性卵清稀释液，根据该体积加入适量胃蛋白酶及胰蛋白酶的混合物，其中每升变性卵清稀释液加入胃蛋白酶40 000 U、胰蛋白酶50 000 U，两种酶混合均匀后加入适量无菌水调成稀糊状，倒入预热至50℃的变性卵清稀释液中，一边加热一边以500 r·min^-1、按“顺→停→反→停→顺→停→反→停→”方式重复搅拌，即搅拌机以顺转5 min，停1 min，反转5 min，停1 min的方式重复搅拌，酶解期间，适时补充50 ℃的无菌水维持酶解体系体积不变，酶解3h后，迅速升温至100℃，保持12min以灭活酶，得酶解液；

（6、酶解液放冷至室温后，于10 000 r·min^-1离心12min去除沉淀收集清液，得卵清酶解清液，用凝血酶滴定改进法测定酶解清液的抗凝血酶活力；

（7、酶解清液于87Kpa浓缩至400 ATU·mL^-1，得抗栓、溶栓口服液母液；

（8、根据所需配制的抗栓、溶栓口服液的质量，在抗栓、溶栓口服液母液中加入质量比为0.2‰的甜蜜素和2‰的柠檬酸，溶解，再加入适量无菌水调至374 ATU·mL^-1，混合均匀，即得抗栓、溶栓口服液；

（9、抗栓、溶栓口服液分装、灭菌、检测；经实际测定，抗栓、溶栓口服液各项微生物指标符合中华人民共和国国家标准保健(功能)食品通用标准（GB 16740—1997）；抗凝血酶活力为374 ATU·mL^-1；

（10、包装得到产品。