CN104622906B - 一种海参的超高压提取方法及其制备的海参提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海参的超高压提取方法，包括如下步骤：（1）取鲜海参，洗净，加水，匀浆，得海参浆液；（2）超高压提取步骤（1）制得的海参浆液，提取温度为20～80℃，压强为100‑600MPa，提取次数为2～5次，每次不低于10min，即得提取液；（3）离心步骤（2）的提取液，得上清液，浓缩，得浓缩液；（4）在步骤（3）的浓缩液中加入乙醇溶液至醇含量为30～60%（v/v），4～20℃静置6～48h，过滤，得上清液，浓缩，干燥，粉碎，即可。本发明还公开了前述方法制备的海参提取物。本发明超高压提取方法可以有效提取海参的有效成分，收率高，操作简便，应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种海参的超高压提取方法及其制备的海参提取物。
背景技术
海参，别名刺参、海鼠，属海参纲（Holothurioidea），是生活在海边至8000米的海洋棘皮动物，据今已有六亿多年的历史，海参以海底藻类和浮游生物为食。海参全身长满肉刺，广布于世界各海洋中。我国南海沿岸种类较多，约有二十余种海参可供食用，海参同人参、燕窝、鱼翅齐名，是世界八大珍品之一。据《本草纲目拾遗》中记载：海参，味甘咸，补肾，益精髓，摄小便，壮阳疗痿，其性温补，足敌人参，故名海参。海参是典型的高蛋白、低脂肪、低胆固醇、富含矿物质和维生素的优质食品。干海参富含蛋白质，含量高达55%，由于海参本身胶原蛋白的包裹作用，无论是新鲜产品或干制品水发，蛋白质都不能有效利用和吸收，有效利用率通常在20%左右。近年来，人们发现海参中含有许多具有重要生物活性的物质，如海参多肽、多糖、皂苷等。海参多肽具有良好的溶解性和稳定性，易消化吸收，食用安全，而且具有降血压、预防心脑血管疾病、抗疲劳、提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老等生物活性。
目前，海参提取通常采用酶法提取，但是，酶法提取无法兼顾提取物的收率和蛋白质含量，如，苏永昌等，“海参多肽的制备工艺优化及其抗氧化测定”，福建水产，2009，2（6）：6-9中公开了一种酶法提取海参多肽的方法，其加酶量1800U/g,酶解温度为55℃,酶解pH值为7.5,酶解时间为3h。经超滤与冷冻干燥后,多肽得率为6.9%,蛋白质含量为94.9%，该方法制备的提取物蛋白质含量高，但是多肽得率太低。另外，酶法对反应条件的要求较为苛刻，而且酶的价格高，导致生产成本高。
超高压提取(ultrah igh-pressure ex traction,UHPE)，也称超高冷等静压提取，是指用100～1000MPa的流体静压力作用于提取溶剂和中药的混合液上，并在预定压力下保持一段时间，使植物细胞内外压力达到平衡后迅速卸压。由于细胞内外渗透压力忽然增大，细胞膜的结构发生变化，使得细胞内的有效成分能够穿过细胞的各种膜而转移到细胞外的提取液中，达到提取中药有效成分的目的。超高压提取可以有效提取黄酮类、皂苷类、多糖类和生物碱类等有效成。
目前，未见采用超高压方法提取海参的报道。
发明内容
本发明提供了一种海参的超高压提取方法。
本发明海参的超高压提取方法，包括如下步骤：
（1）取鲜海参，洗净，加水，匀浆，得海参浆液；
（2）超高压提取步骤（1）制得的海参浆液，提取温度为20～80℃，压强为100-600MPa，提取次数为2～5次，每次不低于10min，即得提取液；
（3）离心步骤（2）的提取液，得上清液，浓缩，得浓缩液；
（4）在步骤（3）的浓缩液中加入乙醇溶液至醇含量为30～60%（v/v），4～20℃静置6～48h，过滤，得上清液，浓缩，干燥，粉碎，即可。
步骤（1）中，水的加入量为鲜海参的6～10（v/w）倍。
步骤（2）中，提取温度为40℃或60℃。
步骤（2）中，压强为300-500MPa。优选地，所述压强为400MPa。
步骤（2）中，提取时间为10～100min。优选地，所述提取时间为20-60min。进一步优选地，所述提取时间为40min。
步骤（4）中，所述溶液的醇含量为60%（v/v）。
步骤（4）中，所述静置的温度为8℃，时间为12小时。
本发明还提供了前述方法制备的海参提取物。所述海参提取物的蛋白含量不低于70%（w/w）。优选地，所述海参提取物的蛋白含量为70.1-89.8%（w/w）。
本发明采用超高压提取方法提取海参，收率为35.3%-42.8%，制得的提取物中，蛋白含量为70.1%-89.8%，可以兼顾收率和提取物的蛋白含量，具有良好的应用前景。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明中，蛋白质的含量采用GB 50095-2010食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定》第二法（分光光度法）进行测定。
1 范围
本标准规定了食品中蛋白质的测定方法。
本标准不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。
2 原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。
3 试剂和材料
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。
3.1 硫酸铜（CuSO4·5H2O）。
3.2 硫酸钾（K2SO4）。
3.3 硫酸（H2SO4密度为1.84g/L）：优级纯。
3.4 氢氧化钠（NaOH）。
3.5 对硝基苯酚（C6H5NO3）。
3.6 乙酸钠（CH3COONa·32HO）。
3.7 无水乙酸钠（CH3COONa）。
3.8 乙酸（CH3COOH）：优级纯。
3.9 37%甲醛（HCHO）。
3.10 乙酰丙酮（C5H8O2）。
3.11 氢氧化钠溶液（300g/L）：称取30g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。
3.12 对硝基苯酚指示剂溶液（1g/L）：称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于2mL95%乙醇中，加水稀释至100mL。
3.13 乙酸溶液（1mol/L）：量取5.8mL乙酸（3.8），加水稀释至100mL。
3.14 乙酸钠溶液（1mol/L）：称取41g无水乙酸钠（3.7）或68g乙酸钠（3.6），加水溶解后并稀释至500mL。
3.15 乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60mL乙酸钠溶液（3.14）与40mL乙酸溶液（3.13）混合，该溶液pH4.8.
3.16 显色剂：15mL甲醛（3.9）与7.8mL乙酰丙酮（3.10）混合，加水稀释至100mL，剧烈振摇混匀（室温下放置稳定3d）。
3.17 氨氮标准储备溶液（以氮计）（1.0g/L）：称取105℃干燥2h的硫酸铵0.4720g加水溶解后移于100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0mg氮。
3.18 氨氮标准使用溶液（0.1g/L）：用移液管吸取10.00mL氨氮标准储备液（3.17）于100mL容量瓶内，加水定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于0.1mg氮。
4 仪器和设备
4.1 分光光度计。
4.2 电热恒温水浴锅：100℃±0.5℃。
4.3 10mL具塞玻璃比色管。
4.4 天平：感量为1mg。
5 分析步骤
5.1 试样消解
称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～0.5g（精确至0.001g）、半固体试样0.2g～1g（精确至0.001g）或液体试样1g～5g（精确至0.001g），移入干燥的100mL或250mL定氮瓶中，加入0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸（3.3），摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20mL水，放冷后移入50mL或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。
5.2 试样溶液的准备
吸取2.00mL～5.00mL试样或试剂空白消化液于50mL或100mL容量瓶内，加1滴～2滴对硝基苯酚指示剂溶液（3.12），摇匀后滴加氢氧化钠溶液（3.11）中和至黄色，再滴加乙酸溶液（3.13）至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。
5.3 标准曲线的绘制
吸取0.00mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL和1.00mL氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg和100.0μg氮），分别置于10mL比色管中。加4.0mL乙酸钠-乙酸缓冲液（3.15）及4.0mL显色剂（3.16），加水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色杯内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。
5.4 试样测定
吸取0.50mL～2.00mL（约相当于氮＜100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。以下按3.3自“加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH4.8）及4mL显色剂……”起操作。试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量。
6 分析结果的表述
试样中蛋白质的含量按下式进行计算。
式中：
X－试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100g）；
c－试样测定液中氮的含量，单位为微克（μg）；
c0－试剂空白测定液中氮的含量，单位为微克（μg）；
V1－试样消化液定容体积，单位为毫升（mL）；
V2－制备试样溶液的消化液体积，单位为毫升（mL）；
V3－试样溶液总体积，单位为毫升（mL）；
V4－测定用试样溶液体积，单位为毫升（mL）；
m－试样质量，单位为克（g）；
F－氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25.
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1g/100g时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8 其他
本方法当称样量为5.0g时，定量检出限为0.1mg/100g。
下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细地描述：
实施例1 本发明海参的超高压提取方法
称取去除内脏的鲜海参10Kg，用蒸馏水冲洗干净，加入100L蒸馏水，通过匀浆机制备鲜海参浆液；将鲜海参浆液密封于耐压柔性塑料桶中，置于超高压容器内进行超高压提取，压强为400MPa，温度为40℃，循环加压3次，每次30min，卸压，冷却温度至20℃，开盖取样，通过管式离心机（30000r/min）离心，将离心液于50℃减压浓缩至相对密度为50℃的1.10；加入体积浓度为95%的乙醇至含醇量为40%，在4℃静置24小时，过滤；滤液于50℃减压回收至相对密度为50℃时的1.30，于50℃减压干燥至干，粉碎，得3.97Kg的海参提取物，收率为39.7%。采用GB 50095-2010食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定》第二法（分光光度法）进行测定，该海参提取物蛋白质含量为89.6%。
实施例2 本发明海参的超高压提取方法
称取去除内脏的鲜海参20Kg，用蒸馏水冲洗干净，加入120L蒸馏水，通过匀浆机制备鲜海参浆液；将鲜海参浆液密封于耐压柔性塑料桶中，置于超高压容器内进行超高压提取，压强为500MPa，温度为70℃，循环加压5次，每次10min，卸压，冷却温度至35℃，开盖取样，通过管式离心机（30000r/min）离心，将离心液于60℃减压浓缩至相对密度为50℃的1.05；加入体积浓度为93%的乙醇至含醇量为30%，在20℃静置48小时，过滤；滤液于60℃减压回收至相对密度为50℃时的1.20，于60℃减压干燥至干，粉碎，得7.58Kg的海参提取物，收率为37.9%。采用GB 50095-2010食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定》第二法（分光光度法）进行测定，该海参提取物蛋白质含量为79.5%。
实施例3 本发明海参的超高压提取方法
称取去除内脏的鲜海参30Kg，用蒸馏水冲洗干净，加入240L蒸馏水，通过匀浆机制备鲜海参浆液；将鲜海参浆液密封于耐压柔性塑料桶中，置于超高压容器内进行超高压提取，压强为200MPa，温度为80℃，循环加压2次，每次20min，卸压，冷却温度至40℃，开盖取样，通过管式离心机（30000r/min）离心，将离心液于80℃减压浓缩至相对密度为50℃的1.12；加入体积浓度为98%的乙醇至含醇量为60%，在8℃静置12小时，过滤；滤液于80℃减压回收至相对密度为50℃时的1.25，于80℃减压干燥至干，粉碎，得10.60Kg的海参提取物，收率为35.3%。采用GB 50095-2010食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定》第二法（分光光度法）进行测定，该海参提取物蛋白质含量为70.1%。
实施例4 本发明海参的超高压提取方法
称取去除内脏的鲜海参15Kg，用蒸馏水冲洗干净，加入150L蒸馏水，通过匀浆机制备鲜海参浆液；将鲜海参浆液密封于耐压柔性塑料桶中，置于超高压容器内进行超高压提取，压强为100MPa，温度为50℃，循环加压4次，每次60min，卸压，冷却温度至25℃，开盖取样，通过管式离心机（30000r/min）离心，将离心液于60℃减压浓缩至相对密度为50℃的1.08；加入体积浓度为95%的乙醇至含醇量为50%，在4℃静置6小时，过滤；滤液于80℃减压回收至相对密度为50℃时的1.15，于80℃减压干燥至干，粉碎，得5.63Kg的海参提取物，收率为37.5%。采用GB 50095-2010食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定》第二法（分光光度法）进行测定，该海参提取物蛋白质含量为72.7%。
实施例5：本发明海参的超高压提取方法的参数筛选
称取去除内脏的鲜海参5Kg，用蒸馏水冲洗干净，加入40L蒸馏水，通过匀浆机制备鲜海参浆液；将鲜海参浆液密封于耐压柔性塑料桶中，置于超高压容器内进行超高压提取，分别采用100、200、300、400、500、600、700、800MPa的压强，温度为60℃，循环加压3次，每次30min，卸压，冷却温度至40℃，开盖取样，通过管式离心机离心，将离心液于80℃减压浓缩至相对密度为50℃的1.05；加入体积浓度为95%的乙醇至含醇量为60%，在8℃静置12小时，过滤；滤液于80℃减压回收至相对密度为50℃时的1.25，于80℃减压干燥至干，粉碎，分别得海参提取物1.96Kg、1.97Kg、2.04Kg、2.10Kg、2.05Kg、1.99Kg、1.22Kg、1.04Kg。采用GB50095-2010食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定》第二法（分光光度法）进行测定海参提取物蛋白质含量。
实验结果如表1所示：
表1 不同压强对海参提取物收率及蛋白质含量的影响
如表1所示，随着压强的增大，海参提取物的收率和蛋白质的含量都是先增加后降低，当压强为300～500MPa时，收率和蛋白质含量均较高，压强为400MPa时，收率和蛋白质含量均达到最高，分别为42.0%和89.0%。
本发明超高压制备海参提取物的方法中，超高压处理的有效压强为100～600MPa，优选为300～500MPa，进一步优选为400MPa。
实施例6：本发明超高压制备海参提取物的方法的参数筛选
称取去除内脏的鲜海参5Kg，用蒸馏水冲洗干净，加入40L蒸馏水，通过匀浆机制备鲜海参浆液；将鲜海参浆液密封于耐压柔性塑料桶中，置于超高压容器内进行超高压提取，压强为400MPa，温度为60℃，循环加压3次，加压时间分别为5、10、20、30、40、50、60、100min，卸压，冷却温度至40℃，开盖取样，通过管式离心机离心，将离心液于80℃减压浓缩至相对密度为50℃的1.05；加入体积浓度为95%的乙醇至含醇量为60%，在8℃静置12小时，过滤；滤液于80℃减压回收至相对密度为50℃时的1.25，于80℃减压干燥至干，粉碎，分别得海参提取物1.13Kg、1.97Kg、2.07Kg、2.10Kg、2.13Kg、2.13Kg、2.14Kg、2.01Kg。采用GB 50095-2010食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定》第二法（分光光度法）进行测定海参提取物蛋白质含量。实验结果如表2所示：
表2 不同时间对海参提取物收率及蛋白质含量的影响
如表2所示，随着压强的增大，海参提取物的收率和蛋白质的含量都是先增加后降低，处理时间不低于10min时，海参提取物的收率在39.4%以上，蛋白质的含量在76.2%以上，当时间为20～60min时，收率和蛋白质含量均较高，处理时间为40min时，收率和蛋白质含量均达到最高，分别为42.6%和89.8%。
本发明超高压制备海参提取物的方法中，超高压处理的时间应不低于10min，优选为20～60min，进一步优选为40min。
对比实施例7
称取去除内脏的鲜海参10Kg，用蒸馏水冲洗干净，通过切片机切成鲜海参片；加水煮沸提取3次，每次提取1h，加水量为10倍、8倍、8倍，过滤，合并3次滤液；将滤液于60℃减压浓缩至相对密度为50℃的1.10；加入体积浓度为95%的乙醇至含醇量为60%，在4℃静置6小时，过滤；滤液于80℃减压回收至相对密度为50℃时的1.15，于80℃减压干燥至干，粉碎，得2.84Kg的海参提取物，收率为28.4%。采用GB 50095-2010食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定》第二法（分光光度法）进行测定，该海参提取物蛋白质含量为53.8%。
对比实施例8
称取去除内脏的鲜海参10Kg，用蒸馏水冲洗干净，通过切片机切成鲜海参片；加60%乙醇提取3次，每次提取1h，加水量为10倍、8倍、8倍，过滤，合并3次滤液；将滤液于60℃减压浓缩至相对密度为50℃的1.10；于80℃减压干燥至干，粉碎，得3.01Kg的海参提取物，收率为30.1%。采用GB 50095-2010食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定》第二法（分光光度法）进行测定，该海参提取物蛋白质含量为46.1%。
对比实施例9
称取去除内脏的鲜海参10Kg，用蒸馏水冲洗干净，加入40L蒸馏水，通过匀浆机制备鲜海参浆液；加入复合胰蛋白酶进行水解h，取出，离心，将离心液于60℃减压浓缩至相对密度为50℃的1.12；于80℃减压干燥至干，粉碎，得3.43Kg的海参提取物，收率为34.3%。采用GB 50095-2010食品安全国家标准《食品中蛋白质的测定》第二法（分光光度法）进行测定，该海参提取物蛋白质含量为53.9%。
根据实施例1-6可以看出，采用本发明超高压方法提取海参，收率为35.3%-42.8%，制备的提取物中，蛋白含量为70.1%-89.8%。
根据对比实施例7-9可以看出，采用酶法以及其他常规提取方法提取海参，收率为28.4%-34.3%，但是蛋白含量较底，仅为46.1%-53.9%。苏永昌等，“海参多肽的制备工艺优化及其抗氧化测定”，福建水产，2009，2（6）：6-9中公开的酶法提取海参多肽的方法，蛋白质含量为94.9%，但是得率太低，仅为6.9%。
对比可以看出，本发明方法制备得到的提取物的蛋白含量和收率均较高，克服了现有方法难以兼顾收率和提取物蛋白含量的缺陷。
综上，本发明超高压提取方法可以有效提取海参的有效成分，收率高，制得的提取物蛋白含量高，可用于降血压、预防心脑血管疾病、抗疲劳、提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老等，应用前景良好。
Claims (8)
1.一种海参的超高压提取方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取鲜海参，洗净，加水，匀浆，得海参浆液；
(2)超高压提取步骤(1)制得的海参浆液，提取温度为40℃或60℃，压强为400MPa，提取次数为2～5次，每次提取时间为20～60min，即得提取液；
(3)离心步骤(2)的提取液，得上清液，浓缩，得浓缩液；
(4)在步骤(3)的浓缩液中加入乙醇溶液至醇含量为30～60％(v/v)，4～20℃静置6～48h，过滤，得上清液，浓缩，干燥，粉碎，即可。
2.根据权利要求1所述的超高压提取方法，其特征在于：步骤(1)中，水的加入量为鲜海参的6～10(v/w)倍。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(2)中，所述提取时间为40min。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，所述溶液的醇含量为60％(v/v)。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，所述静置的温度为8℃，时间为12小时。
6.权利要求1～5任意一项所述方法制备的海参提取物。
7.根据权利要求6所述的海参提取物，其特征在于：所述海参提取物的蛋白含量不低于70％(w/w)。
8.根据权利要求7所述的海参提取物，其特征在于：所述海参提取物的蛋白含量为70.1-89.8％(w/w)。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200623 Address after: Mianyang City, Sichuan Province, 622651 Industrial Park Patentee after: Good Doctor Pharmaceutical Group Co.,Ltd. Address before: 610000, No. 2, No. 1, building 136, 13, two north section of Ring Road, Jinniu District, Sichuan, Chengdu, 2 Patentee before: Shu Mei |
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| TR01 | Transfer of patent right |