CN110824034B - 双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法 - Google Patents

双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法，采用碱性离子液体催化代替传统皂化处理对样品催化水解进行处理，并以离子液体和非离子型表面活性剂形成的双水相胶束对胆固醇进行萃取分离，并联合UPLC进行胆固醇检测。本发明操作简便，绿色环保，准确、快捷，回收率高，为对使用离子液体提取物质中的胆固醇提供了科学依据。

Description

双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法
技术领域
本发明涉及水产检测技术领域，尤其是涉及双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定水产品中胆固醇的方法。
背景技术
胆固醇，又称胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。从营养角度来说，胆固醇是人体的不可缺少的重要物质，大部分来自自身合成，少部分来源于膳食补充，它不仅参与细胞膜形成，而且还是胆汁酸、维生素D以及甾体激素合成的主要原料。但随着社会经济发展和人们生活水平提高，不合理的饮食习惯使得人体摄入胆固醇过多，易引发高胆固醇血症，进而导致高血压、冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病，严重威胁人类的健康。水产品中的蟹类、贝类、虾类的胆固醇含量普遍较高，因此，测定和评价水产品中胆固醇含量，对于指导普通消费者以及高胆固醇血症病人的科学膳食是十分重要的。
目前关于食品中胆固醇的检测方法的文献、专利及国家标准主要方法是对样品皂化前处理，再利用高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)或气相色谱(GC)进行定量。
例如，专利申请号为申请号：2011103657933的中国专利公开了一种禽蛋或其制品中胆固醇含量的检测方法，其采用常压微波辅助回流皂化萃取-高效液相色谱法，操作如下：1)将禽蛋可食部分或其制品充分混匀后，向其中加入无水乙醇、KOH溶液、石油醚；2)将样液微波辅助回流皂化萃取，所得样液用流水冷却；3)用去离子水将皂化萃取液反复水洗至中性，弃去水相；4)将有机相在真空条件下浓缩至近干，用无水乙醇定容制备供试样品；5)采用高效液相色谱法检测。该检测方法存在以下缺陷：(1)该检测方法需要用到大量、不同的有机试剂和水，不仅增加了操作步骤，增加了检测成本，而且还会对检测人员的身体健康造成影响；(2)样品需要经微波辅助回流皂化萃取、水洗、真空浓缩、定容过滤多个步骤处理，步骤繁琐，操作不便，处理时间长。
因此，建立一种操作简便、绿色环保、高效的定量分析方法是目前研究胆固醇测定需要考虑的首要问题。
发明内容
本发明是为了解决现有的胆固醇检测方法所存在的步骤繁琐，操作不便，处理时间长，会对检测人员的身体健康造成影响的问题，提供了一种操作简便、绿色环保、准确、快捷、回收率高的双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法，包括以下步骤：
(1)将水产品的肌肉组织搅碎成肉糜后作为样品待用，在样品中加入碱性离子液体溶液，催化水解，离心取上清液。本发明中采用碱性离子液体催化代替传统皂化处理对样品进行处理，将胆固醇酯水解为游离胆固醇，条件温和，分解效率高，工艺步骤大大减少，方法简单易行，且油脂不发生皂化，产物易分离，环境污染小，催化剂可重复循环利用。
(2)将离子液体和非离子型表面活性剂混合均匀后，加入适量的去离子水，充分搅拌混合均匀，得离子液体双水相胶束。本发明中以离子液体和非离子型表面活性剂形成的双水相胶束对胆固醇进行萃取分离，萃取效果好。
(3)将步骤(1)中的上清液加入步骤(2)中的离子液体双水相胶束中振荡混合，恒温静置分相，收集下相备用。
(4)将下相用甲醇定容后，涡旋，超声，微孔过滤，通过UPLC结合外标法测定胆固醇含量。
作为优选，步骤(1)中，在0.1～0.2g样品中加入1mL碱性离子液体浓度为0.3～0.5mol/L的碱性离子液体溶液。
作为优选，所述碱性离子液体溶液中的碱性离子液体为氢氧化1-丁基-3-甲基咪唑。碱性离子液体为氢氧化1-丁基-3-甲基咪唑，催化水解效果好。
作为优选，步骤(1)中，在75～90℃下催化水解反应15～30min。实验表明，在75～90℃下催化水解反应15～30min，催化水解效果较好。
作为优选，步骤(2)中，将离子液体和非离子型表面活性剂混合均匀后，加入去离子水至总质量为5g，充分搅拌混合均匀，得离子液体双水相胶束，以离子液体双水相胶束体系总质量计，离子液体加入量为0.1～1.0％，非离子型表面活性剂加入量为3～9％。胆固醇萃取效率随着离子加入量的增加而增大，当离子液体加入量大于1％时，萃取效率增加缓慢，而非离子型表面活性剂加入量过小或过大时，两共存相之间界面模糊，易出现浑浊。
作为优选，以离子液体双水相胶束体系总质量计，离子液体加入量为0.5％，非离子型表面活性剂加入量为5％。
作为优选，步骤(2)中，离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑咪唑盐、1-丁基-3-甲基咪唑磷酸二氢盐、氯化1-丁基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐、氯化1-己基-3-甲基咪唑或氯化1-辛基-3甲基咪唑，非离子型表面活性剂为Triton X-114。体系的组成，特别是离子液体类型，对双水相的形成非常关键，本发明中采用上述离子液体，能与非离子型表面活性剂Triton X-114、水混合后形成稳定、明显的双水相体系。
作为优选，步骤(3)中，20～60℃温度下恒温静置1～2h。
作为优选，步骤(4)中，下相用甲醇定容至5mL，涡旋30～60s，超声3～5min，取1mL经0.22μm微孔膜过滤。对下相进行涡旋、超声，以使胆固醇充分溶出，有利于提高检测的精确度；通过微孔膜过滤，去除样品中的极细颗粒，可减少杂质干扰，有利于进一步提高检测精确度。
作为优选，UPLC色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)；使用甲醇作为流动相洗脱，流速为0.2mL/min，柱温38℃，进样量5μL，205nm波长监测下运行12min。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)采用碱性离子液体催化代替传统皂化处理对样品催化水解进行处理，将胆固醇酯水解为游离胆固醇，条件温和，分解效率高，工艺步骤大大减少，方法简单易行，且油脂不发生皂化，产物易分离，环境污染小，催化剂可重复循环利用；
(2)以离子液体和非离子型表面活性剂形成的双水相胶束对胆固醇进行萃取分离，并联合UPLC进行胆固醇检测，操作简便，准确、快捷，回收率高，为对使用离子液体提取物质中的胆固醇提供了科学依据。
附图说明
图1为不同离子碱性离子液体催化水解结果对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步的描述。
为了进一步说明，本发明通过提供下述实施例以求本领域技术人员能够对本发明的宗旨进行清楚地理解。但应当注意，下述各实施例并非是对本发明技术方案的限定，本领域技术人员在对各实施例进行分析和理解的同时，可结合现有知识对本发明提供的技术方案做一系列变形与等效替换，该变形与等效替换而得的新的技术方案亦被本发明囊括在内。
由于本发明无法对实施例进行穷举，因此一些优选的技术特征和优选的技术方案可以进行合理的相互替换或组合，由此而得的新的技术方案亦被囊括在本发明之中。
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
不同离子碱性离子液体催化水解结果试验
分别称取多组0.10g水产品(大黄鱼)肉糜，以加入1mL不同种类的碱性离子液体溶液(0.36mol/L)作为试验组，以加入1ml去离子水作为空白组，以加入1mL氢氧化钾溶液(0.36mol/L)作为对照组，然后在90℃下加热30min，冷却后5000r/min离心5min，收集上清液，用甲醇定容至5mL，取其中1mL过0.22μm滤膜，进行UPLC分析测定胆固醇含量。得到的结果如图1所示。
从图1可以看出，经过氢氧化1-丁基-3-甲基咪唑催化水解的样品得到的胆固醇含量最高。因此，本发明中选择氢氧化1-丁基-3-甲基咪唑作为催化水解的碱性离子液体。
实施例1
(1)将水产品(大黄鱼)的肌肉组织搅碎成肉糜后作为样品待用，在0.1g样品中加入1mL碱性离子液体(氢氧化1-丁基-3-甲基咪唑)浓度为0.3mol/L的碱性离子液体溶液，在75℃下催化水解反应30min，离心取上清液；
(2)将离子液体(1-丁基-3-甲基咪唑咪唑盐)和非离子型表面活性剂(Triton X-114)混合均匀后，加入去离子水至总质量为5g，充分搅拌混合均匀，得离子液体双水相胶束，以离子液体双水相胶束体系总质量计，离子液体加入量为0.1％，非离子型表面活性剂加入量为3％；
(3)将步骤(1)中的上清液加入步骤(2)中的离子液体双水相胶束中振荡混合，20℃恒温静置2h分相，收集下相备用；
(4)将下相用甲醇定容至5mL后，涡旋30s，超声3min，取1mL经0.22μm微孔膜过滤，通过UPLC结合外标法测定胆固醇含量，UPLC色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)；使用甲醇作为流动相洗脱，流速为0.2mL/min，柱温38℃，进样量5μL，205nm波长监测下运行12min。
标准溶液配制方法为：首先配制浓度1mg/mL的胆固醇标准储备液，(配制过程：准确称取胆固醇标准品0.05g，用甲醇定容至50mL)。用甲醇稀释上述储备溶液，配制成浓度为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、200μg/mL的标准溶液，以它们的浓度(x,μg/mL)对应峰面积(y)绘制标准曲线，用于外标法定量。
线性方程：y＝22240x+16914R2＝0.9999
实施例1中测得样品的胆固醇含量为：74.3mg/100g。
实施例1中回收率(％)的具体测定方法分别为：在0.1g上述已知胆固醇含量的样品中加入0.1mL胆固醇标准储备液(1mg/mL)，测定其加标回收率和重复性，3次重复实验，测得回收率为90.05％，RSD为1.86％。
对比例1
对比例1与实施例1的不同之处在于，步骤(1)中样品采用KOH皂化+甲醇萃取进行处理，具体步骤为：在0.1g取自实施例1中的样品中加入1mL浓度为0.3mol/L的KOH，在75℃下皂化30min，离心取上清液，其余与实施例1完全相同。
对比例1中测得样品的胆固醇含量为：78.0mg/100g；测得回收率为83.85％，RSD为2.49％。
实施例2
(1)将水产品(青虾)的肌肉组织搅碎成肉糜后作为样品待用，在0.15g样品中加入1mL碱性离子液体(氢氧化1-丁基-3-甲基咪唑)浓度为0.4mol/L的碱性离子液体溶液，在80℃下催化水解反应20min，离心取上清液；
(2)将离子液体(氯化1-丁基-3-甲基咪唑)和非离子型表面活性剂(Triton X-114)混合均匀后，加入去离子水至总质量为5g，充分搅拌混合均匀，得离子液体双水相胶束，以离子液体双水相胶束体系总质量计，离子液体加入量为0.5％，非离子型表面活性剂加入量为5％；
(3)将步骤(1)中的上清液加入步骤(2)中的离子液体双水相胶束中振荡混合，50℃恒温静置1.5h分相，收集下相备用；
(4)将下相用甲醇定容至5mL后，涡旋50s，超声4min，取1mL经0.22μm微孔膜过滤，通过UPLC结合外标法测定胆固醇含量，UPLC色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)；使用甲醇作为流动相洗脱，流速为0.2mL/min，柱温38℃，进样量5μL，205nm波长监测下运行12min。
标准溶液配制方法为：首先配制浓度1mg/mL的胆固醇标准储备液，(配制过程：准确称取胆固醇标准品0.05g，用甲醇定容至50mL)。用甲醇稀释上述储备溶液，配制成浓度为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、200μg/mL的标准溶液，以它们的浓度(x,μg/mL)对应峰面积(y)绘制标准曲线，用于外标法定量。
线性方程：y＝22280x+17062R2＝0.9999
实施例2中测得样品的胆固醇含量为：31.3mg/100g。
实施例2中回收率(％)的具体测定方法分别为：在0.1g上述已知胆固醇含量的样品中加入0.1mL胆固醇标准储备液(1mg/mL)，测定其加标回收率和重复性，3次重复实验，测得回收率为85.65％，RSD为1.90％。
对比例2
对比例2与实施例2的不同之处在于，步骤(1)中，样品采用KOH皂化+甲醇萃取进行处理，具体步骤为：在0.1g取自实施例2中的样品中加入1mL浓度为0.4mol/L的KOH，在80℃下皂化反应20min，离心取上清液，其余与实施例2完全相同。
对比例2中测得样品的胆固醇含量为：28.7mg/100g；测得回收率为84.11％，RSD为2.15％。
实施例3
(1)将水产品(梭子蟹)的肌肉组织搅碎成肉糜后作为样品待用，在0.2g样品中加入1mL碱性离子液体(氢氧化1-丁基-3-甲基咪唑)浓度为0.5mol/L的碱性离子液体溶液，在90℃下催化水解反应15min，离心取上清液；
(2)将离子液体(1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐)和非离子型表面活性剂(Triton X-114)混合均匀后，加入去离子水至总质量为5g，充分搅拌混合均匀，得离子液体双水相胶束，以离子液体双水相胶束体系总质量计，离子液体加入量为1.0％，非离子型表面活性剂加入量为9％；
(3)将步骤(1)中的上清液加入步骤(2)中的离子液体双水相胶束中振荡混合，60℃恒温静置1h分相，收集下相备用；
(4)将下相用甲醇定容至5mL后，涡旋60s，超声5min，取1mL经0.22μm微孔膜过滤，通过UPLC结合外标法测定胆固醇含量，UPLC色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)；使用甲醇作为流动相洗脱，流速为0.2mL/min，柱温38℃，进样量5μL，205nm波长监测下运行12min。
标准溶液配制方法为：首先配制浓度1mg/mL的胆固醇标准储备液，(配制过程：准确称取胆固醇标准品0.05g，用甲醇定容至50mL)。用甲醇稀释上述储备溶液，配制成浓度为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、200μg/mL的标准溶液，以它们的浓度(x,μg/mL)对应峰面积(y)绘制标准曲线，用于外标法定量。
线性方程：y＝22205x+17248R2＝0.9999
实施例3中测得样品的胆固醇含量为：56.6mg/100g。
实施例3中回收率(％)的具体测定方法分别为：在0.1g上述已知胆固醇含量的样品中加入0.1mL胆固醇标准储备液(1mg/mL)，测定其加标回收率和重复性，3次重复实验，测得回收率为89.66％，RSD为2.01％。
对比例3
对比例3与实施例3的不同之处在于，步骤(1)中，样品采用KOH皂化+甲醇萃取进行处理，具体步骤为：在0.2g取自实施例3中的样品中加入1mL浓度为0.5mol/L的KOH，在90℃下皂化反应15min，离心取上清液，其余与实施例3完全相同。
对比例2中测得样品的胆固醇含量为：28.7mg/100g；测得回收率为89.43％，RSD为2.26％。
通过对各实施例和对比例的回收率和RSD数值进行比较可以发现，各实施例的回收率和RSD数值均优于对比例，说明采用本发明的方法对水产品中的胆固醇进行检测，准确度高，具有较高的实用价值。

Claims (9)

1.双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将水产品的肌肉组织搅碎成肉糜后作为样品待用，在样品中加入碱性离子液体溶液，催化水解，离心取上清液；
（2）将离子液体和非离子型表面活性剂混合均匀后，加入适量的去离子水，充分搅拌混合均匀，得离子液体双水相胶束；所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑咪唑盐、1-丁基-3-甲基咪唑磷酸二氢盐、氯化1-丁基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐、氯化1-己基-3-甲基咪唑或氯化1-辛基-3甲基咪唑，所述非离子型表面活性剂为Triton X-114；
（3）将步骤（1）中的上清液加入步骤（2）中的离子液体双水相胶束中振荡混合，恒温静置分相，收集下相备用；
（4）将下相用甲醇定容后，涡旋，超声，微孔过滤，通过UPLC结合外标法测定胆固醇含量。
2.根据权利要求1所述的双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法，其特征在于，步骤（1）中，在0.1~0.2 g样品中加入1 mL浓度为0.3~0.5 mol/L的碱性离子液体溶液。
3.根据权利要求2所述的双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法，其特征在于，所述碱性离子液体溶液中的碱性离子液体为氢氧化1-丁基-3-甲基咪唑。
4.根据权利要求1或2或3所述的双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法，其特征在于，步骤（1）中，在75~90℃下催化水解反应15~30 min。
5.根据权利要求1所述的双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法，其特征在于，步骤（2）中，将离子液体和非离子型表面活性剂混合均匀后，加入去离子水至总质量为5g，充分搅拌混合均匀，得离子液体双水相胶束，以离子液体双水相胶束体系总质量计，离子液体加入量为0.1~1.0%，非离子型表面活性剂加入量为3~9%。
6.根据权利要求5所述的双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法，其特征在于，以离子液体双水相胶束体系总质量计，离子液体加入量为0.5%，非离子型表面活性剂加入量为5%。
7.根据权利要求1所述的双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法，其特征在于，步骤（3）中，20~60℃温度下恒温静置1~2 h。
8.根据权利要求1所述的双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法，其特征在于，步骤（4）中，下相用甲醇定容至5 mL，涡旋30~60s，超声3~5min，取1mL经0.22μm微孔膜过滤。
9.根据权利要求1所述的双水相胶束体系联合超高效液相色谱测定胆固醇的方法，其特征在于，UPLC色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，色谱柱规格为1.7 μm，2.1 ×100 mm；使用甲醇作为流动相洗脱，流速为0.2 mL/min，柱温38℃，进样量5 μL，205 nm波长监测下运行12 min。
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